生物工程学报  2019, Vol. 35 Issue (2): 171-182
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.180201
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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张梦筱, 朱建伟, 路慧丽
Zhang Mengxiao, Zhu Jianwei, Lu Huili
抗体药物表达技术最新进展
Advances in antibody drug expression techniques
生物工程学报, 2019, 35(2): 171-182
Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(2): 171-182
10.13345/j.cjb.180201

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Received: May 11, 2018
Accepted: July 2, 2018
Published: July 20, 2018
抗体药物表达技术最新进展
张梦筱 , 朱建伟 , 路慧丽     
上海交通大学 药学院 细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心,上海 200240
摘要:生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量,其中单克隆抗体类药物是生物技术药物的典型代表,是恶性肿瘤、自身免疫病等领域全球销售额最高的药品种类。在抗体药物发展的几十年里,随着基因工程、蛋白质工程等领域的发展,抗体生产的宿主细胞建立、表达、纯化等各阶段的技术均不断取得突破,文中综述和讨论了抗体药物生产所采用的真核哺乳动物细胞表达系统、原核大肠杆菌表达系统、转基因动物反应器、无细胞蛋白质合成系统以及相关的关键技术进展。
关键词抗体药物    表达系统    哺乳动物细胞    生产    CRISPR    
Advances in antibody drug expression techniques
Mengxiao Zhang , Jianwei Zhu , Huili Lu     
Engineering Research Center of Cell & Therapeutic Antibody, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: The 21st century is regarded as the century of biotechnological drugs, among which monoclonal antibodies and their derived targeting drugs have established themselves as the leading modality of biopharmaceutical pharmaceutics for a wide range of indications covering malignant tumors and autoimmune disorders. Since the manufacturing of the first antibody drug from hybridoma cells, the technologies have been intensely studied and there emerged numerous breakthroughs in recombinant cell line establishment, antibody expression and purification, quality control and other related areas. This article summarizes the critical progresses of antibody drugs expression technologies, especially of mammalian cell expression system, Escherichia coli expression system, the transgenic animal reactor and the cell free protein synthesis system, to give a detailed illustration of the recent advances in antibody drugs development.
Keywords: antibody drugs    expression system    mammalian cells    manufacturing    CRISPR    

抗体药物是利用人体免疫系统,通过抗原抗体的特异性反应达到靶向阻断或消灭携带抗原的细胞或抗原本身、达到治疗疾病目的的大分子药物。2000年之后,随着肿瘤病理机制的研究不断深入,人们陆续发现大量的疾病治疗新靶标,例如CTLA-4、PD-1/PD-L1[1]、CD27[2]、TNF[3]和IL-6[4]等。针对这些靶点,以单克隆抗体为主的大分子药物用于临床,成为“精准医疗”的重要组成成分。在肿瘤研究领域,有多种特异性杀伤肿瘤细胞的经典抗体药物如Trastuzumabinjection (罗氏,商品名Herceptin)[5],Bevacizumab (罗氏,商品名为Avastin)[6]等,以及近年获批的通过激活肿瘤免疫发挥作用的PD-1单克隆抗体Nivolumab (百时美施贵宝,商品名Opdivo)[7]和PD-L1单克隆抗体Atezolizumab (基因泰克,商品名Tencentriq)[8]等。而在自身免疫性疾病治疗方面,以抗体为主的生物药物更是占主导地位。例如治疗类风湿性关节炎的阿达木单抗(艾伯维,商品名Humira)[9],从2012年开始,它连续多年蝉联世界上最畅销的药物榜首[10]。由于出色的临床效果和市场占有率,较早上市的一批抗体药物的专利保护逐渐到期,抗体药物的类似药发展也如火如荼,使得越来越多的抗体药物加速涌入市场。

单克隆抗体技术是在1975年由英国科学家Milstein和Kohler所发明,并获得1984年诺贝尔医学奖[11]。而在随后的短短40年内,抗体的工业生产得到了长足发展。目前的单克隆抗体主要分为鼠源性单克隆抗体,人鼠嵌合抗体(由鼠源的可变区和人源的恒定区组成)[12],人源化单克隆抗体[13],人源性单克隆抗体等[14];从分子形式上又可分为全长抗体,抗原结合片段(Antigen-binding fragment,Fab)[15],单链抗体(Single chain antibody fragment,scFv)[16],单域抗体,最小识别单位等。此外,随着技术进步,出现了能够识别两个或多个靶点的双特异性抗体[17]、多特异性抗体[18],以及抗体偶联小分子药物[19] (Antibody-drug conjugates,ADC)或免疫毒素[20] (Immunotoxin)等新型抗体药物。

机体分泌抗体的细胞是B细胞,将其与骨髓瘤细胞融合在一起就可获得既能够产生单克隆抗体又具有永生化能力的杂交瘤细胞,从而实现抗体的长期制备[21-22]。然而,杂交瘤细胞基因组通常不稳定,且天然免疫动物产生的抗体注射到人体内易产生免疫原性[23],目前杂交瘤技术所制备的抗体多用于诊断试剂类产品,而临床应用的抗体类药物则需采用稳定性较好的工程系统进行制备,包括哺乳动物细胞表达系统、大肠杆菌表达系统、转基因动物反应器与无细胞系统。而这些领域的关键技术在最近几年取得令人瞩目的进展,文中将对其进行综述和分析。

1 哺乳动物细胞表达系统

重组蛋白生产系统分为原核表达系统和真核表达系统,真核表达系统包括昆虫细胞表达系统、植物细胞表达系统、酵母细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要的真核重组蛋白生产系统类型,与原核及其他真核表达系统相比具有以下优势:1)能够完成产物的翻译后修饰,可形成正确的二硫键和高级结构,且分泌表达便于下游纯化;2)生产过程无内毒素污染;3)技术成熟,单克隆抗体表达水平高,产量可达10−20 g/L[24-25]。常用的哺乳动物细胞有中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),人类胚胎肾(Human embryonic kidney cell,HEK) 293细胞,小鼠骨髓淋巴瘤细胞(NS0和Sp2/0-Ag14)等[26]

对于哺乳动物细胞表达系统,人们仍致力于提高产量及产品的质量稳定性,从各个方面不断进行研究,主要包括:1)通过基因编辑对细胞翻译修饰和分泌能力进行改进,包括靶向参与糖基化相关基因来提高抗体依赖性细胞毒性(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)等的功能或整合目标基因至特定位点,提高细胞株稳定性;2)延长细胞存活及生产时间,从而提高产量,如通过靶向促凋亡基因,改变细胞代谢和采用生产过程控制[27];3)在瞬时转染系统中优化表达载体,提高抗体工业生产中哺乳动物细胞的生产滴度,并研究瞬时表达系统的稳定性,实现快速临床前样品的制备和筛选[28]

1.1 基因编辑技术改造哺乳动物细胞

基因编辑技术是对基因组进行精确修饰的一种生物技术,通过DNA双链的断裂,引发DNA修复系统进行非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)[29]从而导致基因的定点突变、敲除和插入。常用的三大基因编辑技术包括锌指核酸酶技术(Zinc finger nucleases,ZFNs)、转录激活效应因子核酸酶技术(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术[30]。研究人员目前能够采用基因编辑技术高效地改造哺乳动物细胞基因组,从而使其获得理想的表达性能。

单个ZFNs单位是由3−4个锌指蛋白串联而成的DNA识别域与一个非特异性限制性内切酶单体融合产生的。两个锌指核酸酶单位通过结合DNA的两条相反链,使该非特异性限制性内切酶形成二聚体,从而对DNA链进行切割,再通过DNA修复系统进行修复,从而达到基因编辑的目的[31]。但ZFNs容易形成同源二聚体,也存在单个ZFNs单位切割的现象。虽然研究人员对其特异性进行了相关改造,但还是存在脱靶现象和细胞毒性。单个TALENs单位由能特异性识别DNA序列的TAL效应子和核酸酶组成。其DNA识别域识别单个核苷酸,故在构建TALENs质粒载体时需要根据靶位点编码区构建DNA识别模块[32]。TALENs相比ZFNs有更长的识别区域,但其识别区域模块化的组装复杂且昂贵,大多依靠相关公司进行构建和生产。在2013年,张锋团队开发出了CRISPR/Cas9基因编辑技术,是目前最简便高效的基因编辑系统[30]。该技术利用一种来源于原核生物中的抵抗外源基因入侵的获得性免疫系统,由RNA指导的Cas蛋白对靶基因进行修饰[29],可以实现多位点编辑。虽然CRISPR/Cas9伴随着不容忽视的脱靶效应,但它操作简便、成功率高,是至今为止最先进的基因编辑技术和生物医药领域的研究热点。

1.1.1 改善糖基化修饰提高抗体产品抗肿瘤活性

在免疫过程中,抗体常通过两种途径杀死靶细胞来执行其免疫功能:1) Fc区被C1q结合,激活补体级联并形成膜攻击复合物的补体依赖性细胞毒性(Complement dependent cytotoxicity,CDC);2) Fc区与天然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)的Fc受体FcgR Ⅲ识别,并释放导致细胞溶解物质的ADCC作用[33]。研究发现,人类lgG1抗体的N-聚糖中去除核心岩藻糖,能够提高Fc与FcgRⅢ受体的亲和力,从而可显著提高ADCC[34]

核心岩藻糖通常由两个关键步骤合成:1) α-1.6-岩藻糖基转移酶(Fucosyltransferase-8,FUT-8)能将核心岩藻糖转移到抗体的N-聚糖上[35];2) Slc35c1基因合成GDP-岩藻糖转运蛋白,使GDP-岩藻糖转运到高尔基体中,使其核心岩藻糖化[33]。研究人员已成功使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在CHO细胞中敲除合成FUT-8的基因[34],并通过ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9基因编辑技术来敲除Slc35c1基因,以产生去岩藻糖基化抗体。通过比较这3种基因编辑技术在敲除Slc35c1基因中的作用,研究人员发现CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然具有脱靶现象,但具有最高的基因修饰活性。与之相比,ZFNs由于受锌指之间的串扰和3 bp目标位点的重叠效应引起的锌指单元的上下依赖效应而变得复杂,而TALENs技术由于不能在设计阶段预知其作用的效果以及发挥作用的部分而受到限制[33]

在Fc区的Asn297残基处的双触角N-聚糖分支中的半乳糖对抗体功能也起着十分关键的作用,研究报道在此位点半乳糖的增加同样可以提高ADCC和CDC的活性[36]。在野生型CHO细胞中,lgG的糖型主要是G0F和G1F。最近的一项研究中,研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除CHO细胞中Fc区的两种α-2.3-唾液酸转移酶位点,使Asn297残基更容易接受糖基转移酶,从而实现了80% G2F糖型的表达。但在后续敲除FUT-8后,总体完全半乳糖基化聚糖的相对比例下降,提示岩藻糖基转移酶与半乳糖基转移酶或N-乙酰葡萄糖氨基转移酶的活性之间可能存在相关性[37]

除了对糖基化程度的改造,研究人员还利用CRISPR/Cas9和TALENs技术进行糖链缺陷型细胞系的开发。CLEC-2通过唾液酸结合其内源性受体hPDPN,从而参与血小板聚集和癌症转移。若hPDPN存在于癌细胞或者癌相关成纤细胞,则表明预后不良。该研究利用基因编辑技术,建立了聚糖缺陷的CHO-S与HEK293K细胞系,并通过该细胞系确定唾液酸是新型抗hPDPN mAb LpMab-21的表位之一[38]。这为其他抗膜蛋白的新型抗体的表位是否具有唾液酸和N-聚糖研究提供了思路。

1.1.2 高产稳转细胞株的筛选和建立过程优化

经典方法建立高产稳定细胞株依赖于外源基因对宿主细胞基因组的随机整合,因此很难保证插入位点表达水平以及细胞株生长特性的稳定。而采用CRISPR/Cas9等技术目前已经能够实现将感兴趣的目的基因(Gene of interested,GOI)定点整合到染色体基因组的特定位点。Grav等介绍了确定靶向基因序列、构建sgRNA表达的质粒、进行转染、利用流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)进行阳性筛选、扩大克隆以及进行基因分析等一系列操作,从而成功敲除CHO细胞中谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的过程,验证了这一可广泛使用的单基因敲除通用方案[27]

而通过定点整合获得高产的稳转细胞株,其前提是能够插入到具有较高转录活性的位点。本实验室通过筛选不同位点,最终确认CHO-S细胞C12orf35位点的定点整合能够获得产量及稳定性俱佳的重组细胞株,而且采用CRISPR/Cas9介导该位点的定点整合,能够使稳转细胞株的构建时间缩短到2个月[39],具体方法如图 1所示。

图 1 目的基因插入特异性位点流程图(改自Zhao[39] Fig. 1 Site- specific integration flow chart (adapted from Zhao et al[39])

在CRISPR/Cas9技术实施过程中,合适的同源臂是介导成功整合的要素之一,日本的研究人员使用插入位点侧翼极短的微同源臂,将ScFv-Fc抗体基因靶向敲入CHO细胞的hprt基因座,获得了生产效率满意的细胞株[40]

为了能够对所产生的蛋白进行定量,有报道利用CRISPR/Cas9技术在导入GOI的同时导入一个蛋白定量报告基因(Protein quantitatively reports genes,PQR),用荧光连续监测内源蛋白和重组蛋白的表达水平,从而实现蛋白产量荧光强度的量化[41]。此外,建立稳转细胞系的经典过程一般采用携带重组抗体和选择标记基因质粒载体转染CHO细胞,然后利用选择标记进行筛选,只要成功转染并表达相应抗性蛋白的细胞都可以被加压筛选出来,但却很难筛选出目的蛋白高产的细胞系。一项研究对CHO-K1细胞中的5种抗生素抗性基因以及CHO-DG44细胞中的二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,DHFR)基因进行优化,提出可以减弱选择标记蛋白的表达水平,以筛选出质粒整合到基因活性位点或者是具有高拷贝数的细胞系,从而筛选出高产细胞系[42]。虽然存在选择标记过度弱化将导致细胞存活率下降的问题,但这给筛选高产细胞株提供了新思路。

1.2 细胞生长和生产过程的优化

哺乳动物细胞对抗体的表达是一个整体的过程,在整个细胞培养和生产过程中,细胞生长代谢直接决定产品产量和质量,过程控制也影响到细胞的生理活动,从而间接影响抗体工业生产。培养工艺的开发通常涉及到培养的温度[43]、pH[44]、培养介质、培养基配方[45]以及氧的摄取与氨基酸的消耗[46]、渗透压、乳酸生成等代谢产物的变化[47]并以此为基础进行各类优化,最终实现抗体产量和质量的提高。

1.2.1 细胞代谢优化

对于细胞而言摄食不足会导致胞内营养物质消耗和生产力下降,而过度摄食就会导致代谢副产物的不良积累和高渗透压。为了在哺乳动物细胞系统中实现有效的合成代谢,Gupta等发现工程细胞中的丙酮酸盐通量改变可减少细胞培养物中的乳酸积累。其在CHO细胞中过度表达酵母细胞质丙酮酸羧化酶2 (Pyruvate carboxylase 2,PYC2)以增加丙酮酸流向三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)的通量,发现随着酵母细胞质PYC2表达量的增加,丙酮酸通量增加,乳酸积累可减少达4倍,细胞密度和寿命都有显著增加。与亲本相比,该工程细胞将抗体产量提高了70%[36]。此外,细胞内外的氧化环境对于细胞的氧化应激[48]、未折叠蛋白反应途径(Unfolded protein response,UPR)的活化[49]、蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)表达[50]以及mRNA的水平[51]都是至关重要的。研究人员通过在细胞中引入氧化还原修饰剂,使得哺乳动物细胞增加了对培养基中胱氨酸的摄取,从而合成更多的谷胱甘肽,细胞在第14天培养结束时仍然保持氧化状态,并且在表达抗体方面减少了20%的聚体生成[52]

为了改善细胞生长状况,可在培养过程中采用瞬时表达导入需要表达的基因,或者是导入改善细胞生长的基因对细胞生长状况进行调控。其中,抑制细胞凋亡是延长细胞寿命、增加产量的最显著的策略。有研究报道在生产人源化抗TNF-αmAb的CHO稳定细胞中瞬时表达抗凋亡蛋白Bcl-XL,显著提高了TNF-αmAb的产量[53]。有望用于大规模抗体生产,节约成本、提高生产效率。

1.2.2 生产过程的优化

除了对细胞的代谢调控,对温度、氧含量、渗透压等过程参数的控制是大规模生产中重要的优化策略。Lee等在生产过程中探究不同培养温度对细胞生存状况和产物的影响。该研究利用CHO细胞在转染后比较了在生理温度下(36.5 ℃)和转染24 h中温度由36.5 ℃变为32 ℃的特异性单克隆抗体生产力和糖基化程度,结果表明在32 ℃培养过程中,糖基化产物通过N-乙酰葡萄糖氨基转移酶Ⅱ表达增加从而促进聚糖结构的产生。在比较每种条件下半乳糖基化单克隆抗体的特定生产速率时,32 ℃下的半乳糖基化程度更高,但其对培养基中葡萄糖的消耗率比在36.5 ℃下培养高出60%[54]。相关研究人员通过监测在线培养物的氧吸收并将该生理参数与产物形成速率联系起来获得关于细胞生理学的实时信息,并定量测定每个细胞和时间单位的蛋白表达速率。在该项研究中,开发出一种控制策略,其中包括特定的生产力作为参数,并研究特定生产力与重组产物的糖基化模式之间的相互作用。研究表明酪氨酸消耗可导致细胞代谢活性和生产力下降,且观察到当pH从7.2变为6.9时,高甘露糖化糖型增加[55]。该项研究为开发新的控制策略,以及控制产品质量属性方面提供了新方法。此外,重组蛋白的最终浓度受细胞密度、存活细胞培养寿命和重组蛋白的特定生产速率的影响。渗透压对这3个重要参数有强烈作用。超渗透压抑制细胞生长。为了减少高渗透压对于细胞生产的负面影响,研究人员在超渗透压下传代培养CHO细胞,开发了高渗透抗性的CHO细胞系,其最大存活细胞浓度是野生型细胞的132%[56]

1.3 瞬时表达系统的应用

瞬时转染(Transient transfection)通常利用质粒载体将GOI转染入宿主细胞,而基因不整合入宿主细胞染色体,在短时间内就能使宿主细胞产生所需的性状表达。该表达系统从操作到收获时间周期短,不用对细胞进行长期的筛选和克隆[57]。虽然在临床上还未有利用瞬时转染技术在HEK293细胞表达重组抗体药物的先例,但其在未来的工业生产中具有很大的发展空间。本实验室利用瞬时转染技术在HEK293细胞表达9批重组lgG抗体,证明利用该方法生产的抗体在活细胞密度、存活力、凋亡状态、抗体产量的可再现性以及物理性质和不同批次的糖基化程度上都具有高度一致性[28],证实瞬时转染系统可为抗体生产提供快速可靠的策略,节约稳转细胞株构建的成本,对需要进行多个产品验证和筛选的情况尤为合适。

在瞬时转染系统中,为获得蛋白的高效表达可对转入的质粒载体进行修饰。表达载体多采用单顺反子、多顺反子或者是反式互补策略来对GOI进行优化,同时也对启动子、终止子、增强子等调控表达的载体功能元件的功能进行提高[58]。在哺乳动物表达系统中使用的质粒载体通常由两部分组成,即细菌骨架和真核表达盒。研究表明细菌骨架可能由于炎性非甲基化CpG基序与多种细胞因子相互作用,从而导致相关基因沉默。针对该现象,研究人员利用噬菌体ΦC31整合酶介导的重组效应在大肠杆菌中构建了携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的新型微环DNA载体,不但可以避免基因沉默,且其在CHO-K1细胞与HEK细胞中瞬转可表达至14代[59]。另一项研究开发了一种含有恶臭假单胞菌Pseudomonas putidacumate基因诱导的CHO BRI/rcTA细胞系,该细胞系携带反式激活子诱导系统的组分,当利用瞬转系统转染cumate基因开关启动子的质粒载体,就可驱动该质粒载体DNA的表达[60]

2 原核大肠杆菌表达系统

从1973年左右质粒DNA技术开始得到发展[61]。这使得人们能够将目的基因插入质粒转入大肠杆菌中使其进行扩增,并利用热诱导或化学诱导控制基因表达启动子使其进行表达[62]。20世纪80年代,FDA批准了由大肠杆菌生产的胰岛素用于治疗糖尿病。目前,FDA批准的包括抗体片段、细胞因子等近30%的治疗性蛋白是在大肠杆菌中生产的,例如利尿素钠、白介素-2、白介素-11、白介素-ⅠRα、甲状腺激素(1-34)以及干扰素α、β和γ等[63]

大肠杆菌原核表达系统缺乏翻译后修饰所需的酶,因此较适合无需糖基化的抗体片段类药物的生产,例如scFv、Fab等。此外,大多数抗体产品含有二硫键,对维持其空间结构和生物学活性非常重要,而大肠杆菌胞内的氧化还原环境难以满足二硫键折叠的需要,因此大多数情况下以包涵体形式进行产品的表达,并需要对包涵体进行变复性处理,或者采用分泌型信号肽,将其运输到周质进行折叠,实现可溶性的表达,并形成正确的二硫键结构[64]。研究人员将靶向卵巢上皮癌CA125位点的scFv基因亚克隆至pET-22b (+)载体中,利用Pel B前导肽进行周质定位,通过优化密码子使scFv抗体可溶表达增加了14倍[65]。大肠杆菌表达系统具有低成本、易放大以及生产周期短等优点,在不需复杂修饰的抗体片段类产品的生产中具有很大潜力。

3 转基因动物反应器

转基因动物反应器是利用转基因技术改造动物基因,使其在特定器官产生所需生物药物的动物。目前可在转基因动物的血液、尿液、精液、乳汁或者是蛋清甚至是蚕茧中得到所需的生物药物[66]

早在20世纪90年代初,研究人员就研制成功利用转基因动物的乳腺大规模生产供人类疾病治疗的生物活性物质和药用蛋白[67]。其生产的外源蛋白种类广泛,从小分子肽到大分子复杂蛋白质,从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产,通常用于生产重组人蛋白和单克隆抗体[68]。该技术通常使用显微注射技术直接注射线性化的DNA到成熟的卵细胞中[69],而在反刍动物中,使体外培养的受精卵发育到囊泡期再进行显微注射[70]。2006年由EMA批准的第一个转基因动物生物制药产品重组抗凝血酶Atryn®被批准用于人类医疗用途,并于2009年被FDA批准。在2014年,一种重组人C1酯酶抑制剂蛋白药物Ruconest®得到FDA的批准[71]。这验证了转基因动物反应器的动物平台,增加了重组蛋白生产系统的可靠性。

该技术生产的药物产量和活性一般都较高。有报道称在其构建的转基因奶牛中生产人重组白蛋白产量可达到1−5 mg/mL[72],产物无污染、成本低廉。但也存在一些问题,如显微注射难度大,不便于普及,且需要通过进一步完善表达载体来提高表达量。除转基因动物反应器适宜于单克隆抗体的生产,也出现了乳腺瞬时表达系统,但下游纯化等开发过程十分昂贵[71],且不同个体的动物所产生的药物在质量均一性上可能存在差异,不便于对药物质量进行控制。此外,对于大动物来说,待其能够生产药物需要几年时间,且存在动物伦理方面和基因污染的问题,因此该系统仍需进一步研究和完善。

4 无细胞蛋白质合成系统

近年来,无细胞蛋白质合成系统(The cell-free protein synthesis system,CFPS)已经成为一个强大的技术平台,以满足日益增长的简单和高效制备蛋白质生产的需求。CFPS技术是指在进行蛋白表达时将DNA或所需要的基因作为模板加入由RNA聚合酶、核糖体等其他细胞提取物组成的反应混合物中,添加能量源与需要的氨基酸、一些辅助因子和提高原核无细胞体系的生产力的翻译延伸因子和转录因子[73]。该系统表达迅速,表达时间通常为数小时到数天。有研究利用Hela细胞与CHO细胞提取物进行反应,以利用CFPS系统进行绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)与链激酶(Streptokinase,SK)的表达,并使用自切割内含子技术对链激酶产物进行纯化[74]。该系统在生产结构简单的蛋白产物方面的确具有十分迅速、高产以及产品无差异的优点,但是其在具有二硫键和高级结构的复杂蛋白生产方面还具有较大缺陷,目前主要应用于科学研究。近年来,它的应用扩大到了IgGs和抗体衍生物的生产,以及抗体-药物共轭物、疫苗、膜蛋白、金属蛋白和病毒蛋白的研究型制备[75],虽然生产类型广泛,但其试剂昂贵,难以规模放大。

5 其他表达系统

除了传统的表达系统,在抗体生产方面还有一些比较有特色的表达系统,例如枯草芽孢杆菌系统,由于其生产蛋白不形成包涵体、分泌能力强、产物易纯化,被认为是大肠杆菌表达系统的理想替代品[76]。在真核表达系统中植物表达系统由于其不会感染人源病毒,在抗体制备中具有很高的安全性,具有十分广阔的发展空间[77]。但植物和哺乳动物在O型糖基化水平及多糖结构上有所不同[78],有研究报道其产生的抗体可产生致敏作用[79]。另一个常用的系统是酵母表达系统,其表达水平一般经过5 d发酵可以达到2−5 g/L,且表达产物不含内毒素。虽然酵母具有一定的糖基化能力,但糖基化模式与人类细胞不同,阻碍了其在抗体生产领域的应用[80]。而在昆虫表达系统中,应用最广泛的是昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统。该表达系统表达蛋白可以从细菌到人体组织等任何有机体表达任何细胞位置的基因产品,且杆状病毒对脊椎动物的非传染性保证了该表达系统的安全性。该系统的特点是依赖于工程载体的优化,而不是宿主细胞系的建立,且其工程载体可以容纳长达20 kb的外源DNA片段[81]

6 总结与展望

抗体药物特异性强,快速准确,具有良好的治疗效果。抗体生产技术发展了几十年,根据不同的需求,开发了不同的生产模式,包括文中所总结的各类表达系统的使用。临床上主要采用哺乳动物细胞和原核细胞发酵技术来获得抗体药物。由于哺乳动物细胞表达系统的复杂性,工业上针对该系统开展的工作较多,主要通过改变细胞代谢和采用生产过程控制以延长细胞生长和生产的有效时间,从而提高抗体产量。近年来,以CRISPR/Cas9为代表的新兴技术正广泛用于工程细胞株的开发,且该技术本身正经历不断更新和优化。有研究人员开发出新的Cas蛋白表达系统xCas9,不但能够识别更为广泛地候选识别位点的毗邻基序(Protospacer adjacent motif, PAM)序列[82],扩大CRISPR/Cas9适用范围,同时极大减少脱靶效应。各类新技术的发展将大大推动抗体药物生产水平及产品质量的提高。

抗体工业蓬勃发展的同时仍存在一些尚未解决的问题,例如抗体分子结构上存在多种翻译后修饰形式、具有显著的“非均一性”、高产细胞株的筛选困难等问题,产生了各种针对高产稳定细胞株筛选的组学研究,并带动了相关基础研究的发展[83]。随着抗体药物相关种类被纳入中国医保目录,在将来的一段时间内,抗体药物在国内将会有更好的市场和发展前景。同时这也对抗体药物生产发展、工艺优化、质量检测等提出了更高的要求。

参考文献
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