2019, Vol. 35中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 白素杭, 杨晓悦, 张楠, 张富涵, 沈宗毅, 杨娜, 张文赛, 喻长远, 杨昭
- Bai Suhang, Yang Xiaoyue, Zhang Nan, Zhang Fuhan, Shen Zongyi, Yang Na, Zhang Wensai, Yu Changyuan, Yang Zhao
- 肿瘤浸润淋巴细胞在实体肿瘤中作用的研究进展
- Function of tumor infiltrating lymphocytes in solid tumors - a review
- 生物工程学报, 2019, 35(12): 2308-2325
- Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(12): 2308-2325
- 10.13345/j.cjb.190300
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文章历史
- Received: July 6, 2019
- Accepted: October 21, 2019
- Published: November 11, 2019
引用本文
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肿瘤是一类严重危害人类生命健康的疾病，《2018年全球癌症统计数据》显示2018年全球约有1 810万癌症新增病例和960万癌症死亡病例，其中发病率最高的前10种癌症均为实体瘤。相比于其他国家，我国癌症发病率、死亡率均为全球第一。在1 810万新增癌症病例中，我国占380.4万例；在960万癌症死亡病例中，我国占229.6万例[1]。2012年我国肿瘤登记年报数据显示，我国发病率最高的前10种癌症均为实体瘤，占全部癌症的比例高达77%。其中，肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和女性乳腺癌的发病率最高[2]。
实体瘤的发生发展涉及大量的基因突变和染色质结构变异，由于该过程非常复杂，其发病机制尚不完全清楚。目前临床上，实体瘤治疗仍以手术切除、放化疗和靶向治疗为主，但这些方法往往不能根除肿瘤病灶，易导致肿瘤复发和进展。
传统的肿瘤治疗方案，更多的是针对肿瘤细胞本身，但事实上肿瘤是在高度复杂且动态的环境中发展而来的。肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)包括肿瘤细胞和肿瘤相关基质，肿瘤基质由肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)、成纤维细胞以及肿瘤周围的细胞外基质等共同构成[3]。TILs是存在TME中具有异质性的淋巴细胞，参与抗肿瘤免疫反应，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和髄源性抑制细胞等[4]。在微环境中，肿瘤组织与免疫系统的相互作用常常呈现双向作用，如机体免疫系统可以对肿瘤产生正向的识别与杀伤，而肿瘤细胞又可通过其表面表达的抑制性分子和分泌肿瘤相关细胞因子来形成免疫抑制性的微环境，介导机体对肿瘤产生免疫耐受，造成免疫逃逸。肿瘤细胞和相关基质之间的相互作用不仅影响疾病的发生和发展，并且与患者预后密切相关[5]。因此揭示各免疫细胞的特性及其与肿瘤的相互作用的机制，对于研究者通过重塑TME进而提高机体的抗肿瘤效应具有重要的科学意义。本文就实体肿瘤中TILs的研究进展作一综述。
1 TILs在恶性肿瘤中的作用 1.1 TILs在肿瘤微环境中的功能TILs是具有高度异质性的淋巴细胞亚群，不同的细胞亚群在TME中发挥着不同的作用。其包含具有正向调节免疫应答的免疫细胞，如树突状细胞(Dendritic cells，DC)、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤(Natural killer，NK)细胞等。它们通过对肿瘤细胞的识别、杀伤和清除，实现肿瘤免疫应答。TME也包含具有负向调节免疫应答的免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞、髄源性抑制细胞等。它们会分泌大量的免疫抑制细胞因子和生长因子，如IL-6、IL-10、VEGF、TGF-β等，抑制上述DC、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞的激活，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视，最终导致肿瘤形成、侵袭与转移[6]。
1.1.1 具有正向调节免疫应答的免疫细胞CD4+ Th1：CD4+ Th1通过与主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC Ⅱ)递呈的多肽抗原反应被激活，Th1主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，介导细胞免疫，Th1可增强NK细胞和细胞毒性T细胞的杀伤能力，同时抑制Th2增殖。
CD8+细胞毒T细胞：CD8+细胞毒T细胞主要功能是特异性识别内源性抗原肽-MHCⅠ类分子复合物，进而杀伤肿瘤细胞。杀伤机制主要有两种：一是分泌穿孔素、颗粒酶等物质直接杀伤把细胞；二是通过表达FasL或分泌TNF-α，分别与靶细胞表面受体结合诱导靶细胞凋亡。
NK细胞：NK细胞是一类表面标志为CD3- CD19- CD56+ CD16+的固有淋巴样细胞，其无需通过提前接触或激活就能发挥肿瘤杀伤能力，某些肿瘤表面表达非MHC Ⅰ类配体分子的杀伤活化受体如NKG2D同源二聚体和自然细胞毒性受体，NK细胞表面识别这些受体选择性攻击肿瘤细胞。NK细胞对肿瘤的杀伤机制和CD8+细胞毒T细胞类似。
M1巨噬细胞：巨噬细胞是一种位于组织内的白细胞。激活的M1巨噬细胞具有促炎和杀伤肿瘤的功能，并分泌TH1细胞因子，如IL-12和TNF-α，以及少量的IL-10和IL-4[7]。
DC：DC是体内功能最强的专职性抗原递呈细胞，其最重要的功能是加工和提呈抗原，从而激活初始T细胞和CD8+ T细胞。DC还能够分泌多种细胞因子和趋化因子调节其他免疫细胞的功能，如DC分泌大量IL-12诱导初始T细胞分化为Th1，产生Th1型免疫应答。
1.1.2 具有负向调节作用的免疫细胞CD4+ Th2：Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等，抑制体内抗肿瘤免疫反应。研究表明肿瘤间质浸润的Th2细胞数量明显高于Th1细胞数量，导致Th1/Th2漂移，产生的免疫抑制状态会严重影响机体的抗肿瘤免疫，最终导致肿瘤的发生和发展[8]。
M2巨噬细胞：巨噬细胞具有可塑性，TME中M1巨噬细胞往往可转变为M2巨噬细胞表型，但这一机制尚不清楚。M2巨噬细胞表达CD163、CD206及CD204等标志物，并分泌Th2型细胞因子，具有较低的抗原提呈能力以及促进血管生成等，具有抑制免疫应答的能力[7]。
调节性T细胞：典型的调节性T细胞是来源于胸腺的CD4+ CD25+ FOXP3+ T细胞(Treg细胞)，Treg细胞在抑制肿瘤相关抗原特异性免疫中发挥重要作用，它会抑制肿瘤引流淋巴结中的肿瘤相关抗原特异性激活，并进一步聚集到TME中，抑制效应细胞或效应分子的功能。目前Treg细胞发挥抑制作用的机理主要有4种：①分泌IL-35、IL-10和TGF-β等可溶性负性免疫分子发挥免疫抑制作用；②高表达IL-2的高亲和受体，竞争性掠夺邻近活化T细胞生存所需的IL-2，导致T细胞的增殖抑制和凋亡；③通过颗粒酶A、颗粒酶B以穿孔素依赖方式使CD8+细胞毒性T细胞和NK细胞等凋亡；④通过表达CTLA-4等膜分子和分泌IL-35等分子抑制DC成熟和削弱其抗原提呈功能，并促进抑制性DC产生。
1.2 TILs对肿瘤的预后评估作用临床预后指标可以帮助评估每一例患者的肿瘤复发和术后生存情况，大量研究证明TILs的密度、亚型和浸润位置在多种肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等的预后判断中占主导地位。且T细胞在多种实体瘤中具有很强的预后价值[9-14] (表 1)。肿瘤浸润T淋巴细胞是免疫治疗过程中最重要的效应细胞类型，其主要包括以下亚型：CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+ T辅助淋巴细胞(Th)、CD45RO+记忆T细胞(Tm)和FOXP3+调节细胞(Tregs)等。其中CD8+ T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中起到核心作用[15]。
| Cancer type | TILs subpopulation | Evaluation indicators | Clinical relevance | Reference |
| NSCLC | CD3+ T cell | TS | Good prognosis | [18] |
| NSCLC | Neutrophil to lymphocyte ratio | TN | Poor prognosis | [19] |
| Lung cancer | CD8+ T cell, CD3+ T cell, CD4+ T cell FOXP3+ T cell |
TS, TN TS TS |
Good prognosis Poor prognosis |
[20] |
| HCC | DC, CD45+ cell, CD8+ T cell, CD3+ T cell | Nodules | Good prognosis | [25] |
| HCC | IL-17+ cell | TN | Poor prognosis | [26] |
| CRCLM | CD8+ T cell, CD3+ T cell | TN & PT | Good prognosis | [27] |
| HCC | FOXP3+ TILs, CD8+ T cell CD3+ T cell |
TN TN & IM TN |
Poor prognosis Good prognosis Poor OS/Good DFS |
[28] |
| Gastric cancer | CD8+ and FOXP3+ TILs | TN | Good prognosis | [35] |
| Gastric cancer | CD8+ T cell, CD3+ T cell | TN | Good prognosis | [36] |
| ESCC | CD4+ T cell | IN | Good prognosis | [48] |
| Esophageal cancer | CD8+ T cell CD57+ TILs FOXP3+ TILs |
TN | Good prognosis Poor prognosis |
[49] |
| CRC | FOXP3+ Tregs | PT TN |
Poor prognosis Good prognosis |
[53] |
| Colon cancer | FOXP3+ TILs CD3+ T cell CD8+ T cell |
TS IM TN |
Good prognosis | [54] |
| Breast cancer TNBC | TILs CD8+ T and T-bet+ cell CD8+ TRM cell |
TS TN |
Good prognosis Good prognosis |
[61] [62] [63] |
| Cervical cancer | CD66b+ cell, CD163+ cell CD204+ M2 macrophages |
PT & TS | Poor prognosis Poor prognosis | [67] [68] |
| TS: tumor stromal; TN: tumor nest; PT: peritumoral; IM: invasive margin; IN: intraepithelial; NSCLC: non-small cell lung cancer; HCC: hepatocellular carcinoma; CRCLM: colorectal cancer liver metastasis; ESCC: esophageal squamous cell carcinoma; TNBC: triple negative breast cancer. | ||||
同时研究者提出运用免疫评分分期系统来预测肿瘤患者的生存周期，他们发现，通过一系列免疫评分分期和TNM分期的对比，显示免疫评分对于预测结直肠癌患者的生存周期具有明显的优势，结直肠癌TILs的类型及密度是影响患者生存预后的主要因素，提示“免疫评分”在预测肿瘤患者生存预后方面，是一个更加优越的分期系统[10, 16]。这些研究也奠定了“免疫评分”技术的基础。2013年Galon等提出了一种图像分析辅助评分系统，命名为“免疫评分”，其是通过检测肿瘤核心部位和肿瘤边缘侵犯部位浸润的CD3/CD45RO、CD3/CD8或CD8/CD45RO淋巴细胞群，并基于免疫细胞的类型、数量和位置3个方面作出评分的方法[9, 17]。免疫评分反映了TME的复杂性和动态性，让我们了解即使在同一肿瘤中，不同部位的免疫细胞也是动态变化的。因此运用免疫评分技术有利于针对不同病例选择合理的个性化治疗方案，防止过度治疗和不恰当治疗，对评价患者的预后具有重要作用。
1.3 TILs介导的肿瘤免疫疗法早在1988年，有研究报道TILs在多种晚期恶性肿瘤中参与积极的作用[18]，提示免疫细胞的抗肿瘤效果。目前实体瘤的治疗手段主要有手术切除、化疗、放疗及靶向药物治疗，但这些方法不能够完全清除病灶，尤其是晚期实体瘤治疗显得相当困难。近年来，肿瘤免疫疗法蓬勃发展，为实体瘤治疗带来了新的机遇。免疫治疗是一种通过增强免疫系统功能达到对抗肿瘤的治疗方式，其中免疫细胞在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。免疫治疗因其疗效显著、毒副作用小、耐药性低而备受关注。肿瘤免疫疗法的核心思想认为：肿瘤的发生是由于自身免疫系统被抑制，造成癌细胞不能被清除；只要将内源自身免疫抑制解除(免疫检查点抑制剂)或者外源补充不会被抑制的免疫细胞(过继免疫疗法)，就可能治疗甚至治愈癌症。
过继免疫疗法(Adoptive immunotherapy，AIT)主要包括TILs、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer，CIK)、DC、NK细胞、T细胞受体嵌合型T细胞(T-cell receptor-T cell，TCR-T)和嵌合性抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法几大类，具体内容如下。
1.3.1 自体TILs过继免疫疗法DC-CIK过继免疫疗法：CIK细胞是自然杀伤T淋巴(NKT)细胞的一类，表达CD3和CD56标志物，与其他报道的抗肿瘤细胞相比，在体外具有快速增殖、更强的抗肿瘤反应和低毒性等特点。近年来CIK细胞已被用于过继免疫疗法，但CIK细胞治疗的临床试验未显示出治愈率或长期生存率方面的显著改善，因此需要进一步改善此疗法[19]。DC细胞可以克服肿瘤相关抑制作用并提高CIK细胞的活性[20]。因此将DC和CIK结合可显著增强抗肿瘤效力[21]。
TILs过继免疫疗法：基于TILs的过继性细胞治疗是将浸润在肿瘤周围的淋巴细胞分离，加入IL-2经体外培养、活化和扩增后回输到患者体内，从而发挥杀伤肿瘤的作用。过继治疗需要回输的细胞数量高达1×1011。自从1986年Rosenberg利用TILs对荷瘤小鼠进行治疗并发现其疗效是淋巴因子激活的杀伤细胞的50-100倍后[22]，TILs成为抗肿瘤研究的热点之一，并且在黑色素瘤的治疗中显示良好的疗效[23-24]。
NK细胞过继免疫疗法：NK过继免疫治疗包括同种异体和自体NK的过继治疗，适用于免疫力低下的病人。自体NK细胞KIRs受体和MCH-Ⅰ配体结合能抑制NK细胞的活化，而同种异体NK细胞KIRs受体和MCH-Ⅰ配体不匹配，故打破了这种限制，有效活化NK细胞，启动抗肿瘤反应[25]。过继的NK细胞与DC相互作用，产生的INF-γ能有效刺激Th1辅助细胞，从而进一步增强T细胞抗肿瘤免疫反应。同时，肿瘤致敏的NK细胞分泌IFN-γ能增加肿瘤细胞MHC-Ⅰ分子的表达，从而促进细胞毒性T细胞的特异性识别和杀伤肿瘤细胞[26]。NK细胞过继治疗肿瘤如乳腺癌、小细胞肺癌等，都显示出其有效性和安全性[27-28]。
1.3.2 基因修饰的过继免疫疗法在许多情况下，运用自体细胞过继疗法策略存在一些不足之处，如在肿瘤组织中没有足够的活检原料，或没有足够的浸润性淋巴细胞。为了克服这些不足，可以采用基因修饰的策略赋予效应细胞特异性，拓宽AIT对其他癌症的影响。目前基因修饰的抗肿瘤T细胞应用最为广泛，且疗效显著，主要包括以下两种策略。
(1) CAR-T细胞免疫疗法
CAR-T细胞是指经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞，CAR由4部分构成，即细胞单链抗体区(Singlechain antibody fragment)、跨膜结构域、细胞内信号传导(通常是CD3ζ链)和协同刺激信号域(CD28、41BB、OX40等)。目前CD19-CAR-T在复发或难治性急性淋巴细胞白血病获得空前成功[29]。2017年被称为“CAR-T”元年，复星凯特生物科技有限公司的Yescarta和瑞士诺华公司的Kymriah被批准上市。但是CAR-T在实体瘤治疗中并不像血液肿瘤一样顺利，在实体瘤中疗效并不显著并伴随严重的副作用，临床应用极为受限。因此要积极开发针对实体瘤的免疫治疗策略，目前主要有：①增加CAR-T细胞的转运和浸润：构建FAP-CAR-T减少肿瘤成纤维细胞的数量或使CAR-T表达趋化因子受体以达到肿瘤部位。②解除肿瘤抑制性微环境：将CAR-T与免疫抑制剂联用如抗TGF-β、PD-1或PD-L1等抗体联用。③提高治疗的特异性和安全性如引入串联基因等[30]。
因此今后联合治疗，寻找特异性靶点及构建通用型的CAR是CAR-T疗法未来的发展方向。
(2) TCR-T细胞免疫疗法
TCR-T细胞免疫疗法是将能识别肿瘤特异性抗原的TCRα和β链基因转染到T细胞中，使T细胞的TCR抗原结合区发生结构改变，从而能特异性识别相应的肿瘤抗原。然后经体外扩增并回输到人体内，表达特异性TCR的T淋巴细胞可识别肿瘤细胞表面的HLA-肽复合物，并通过磷酸化胞内区免疫受体酪氨酸激活基序，来传递抗原刺激信号，进而引发T细胞的免疫效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的[29, 31]。目前，TCR-T细胞免疫疗法在黑素瘤中的临床研究最多且疗效显著[32]。TCR-T细胞免疫疗法在其他实体肿瘤例如宫颈癌、结直肠癌和乳腺癌等中也均有一些尝试性研究，但其治疗效果尚待进一步临床验证。
以上疗法均是将来自患者肿瘤组织、外周血或引流淋巴结中的淋巴细胞在体外修饰、扩增，最后回输至患者的疗法，与其他抗体或靶向药物不同，扩增后的细胞回输到患者体内后将激活并继续增殖，可以形成持续的杀伤力。AIT已在多种实体瘤中取得了积极的临床效果(表 2)。但是，AIT在临床试验中表现出的毒副作用仍然是一个不可忽视的问题。最常见的毒副作用是细胞因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)，CRS指的是由于T细胞增殖和激活，导致细胞因子大量释放，引起患者发烧、低血压、心功能障碍、肾功能衰竭、甚至死亡[33]。此外，AIT还会出现脱靶毒性，即T细胞能够识别表达在正常细胞上的微量抗原。因此除了靶向表达该抗原肿瘤细胞外，还会攻击表达相应抗原的正常细胞，损伤其他正常组织和器官的功能[23]。为了减轻以上的毒副作用，研究者们开发出一系列的管理策略：①目前，大多数CRS毒性可通过升压药，供氧支持，皮质类固醇和IL-6受体拮抗剂等方法来控制和治疗[34]。②针对ACT存在的脱靶毒性，可以构建SynNotch、iCAR、引入自杀基因或小分子开关的策略来实现更特异和更安全地靶向肿瘤细胞[35-36]。下面将对不同实体瘤中TILs的研究进展逐一展开叙述。
| Cancer type | Treatment cell | Clinical relevance | Reference |
| Lung cancer | TILs | Good prognosis | [21-24] |
| Liver cancer | CIK cell | Good prognosis | [30] |
| Liver cancer | TILs | Good prognosis | [31] |
| Gastric cancer | CIK cell, DC | Good prognosis | [37-38] |
| Gastric cancer | CAR-T | Undefined | [43-45] |
| Esophageal cancer | DC | No response | [50] |
| Esophageal cancer | TILs | Good prognosis | [51] |
| Colorectal cancer | NK cell | Good prognosis | [55] |
| Colorectal cancer | CIK cell, DC | Good prognosis | [56-58] |
| Colorectal cancer | CAR-T | Good prognosis | [59] |
| Breast cancer | TRMT | Good prognosis | [64] |
| Breast cancer | CAR-T | Undefined | [65] |
| Cervical cancer | T cell | Good prognosis | [69] |
| Cervical cancer | CIK cell, DC | Good prognosis | [70] |
| TRMT: tumor-reactive memory T cells. | |||
肺癌是全球癌症发病率和死亡率最高的癌症，在美国1/4的癌症死亡是由肺癌引起的[37]。Kim等发现，无论是吸烟人群，还是非吸烟人群，与未接触二手烟人群相比，二手烟暴露者肺癌发生风险增加[38]。最近，ShibliShibli等通过对335个肺癌组织切除的微阵列研究发现，单变量分析中肿瘤基质(P=0.001)和上皮区域(P=0.004)中CD3+细胞的浸润能够显著延长患者肿瘤特异性生存率(Cancer-specific survival，CSS)。在多变量分析中，肿瘤基质中CD3+细胞是CSS (P=0.005)的独立预后因素。CD3+ T细胞的浸润与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中改善的临床结果相关。但在此项研究中，浆细胞和肥大细胞均与预后无关[39]。在另一项研究中，Yin等通过Meta分析研究中性粒细胞与淋巴细胞比率与肺癌预后的相关性，结果表明中性粒细胞与淋巴细胞比率越高，NSCLC患者的总生存期(Overall survival，OS)越差(P=0.001)[40]。Geng等通过对8 600名患者的Meta分析显示，肿瘤基质或瘤内中高水平的CD8+ T细胞和CD3+ T细胞浸润与肺癌患者更好的OS相关。肿瘤基质中高水平CD4+ T淋巴细胞浸润在肺癌患者中表现出更好的OS。而肿瘤基质中高密度的FOXP3+细胞浸润与患者更差的无进展生存期(Progression-free survival，PFS)有关，认为是预后不利的因素[41]。这表明TILs不仅具有明确的免疫功能，还具有预后作用。
2.2 TILs在肺癌中的临床治疗TILs的临床应用开始于20世纪80年代中后期，AIT是继LAK疗法之后又一新的杀伤自体瘤细胞的免疫治疗方法。Kradin等用TILs对6例原发性肺腺癌患者进行多次5.0×108-4.5×109 TILs静脉输注或瘤灶内注入，在无白介素-2 (Interleukin-2，IL-2)和环磷酰胺的情况下，其中4例肿瘤消退且患者有较好的耐受性；他们还对常规疗法治疗无效的转移性肺癌和转移性肾细胞癌等7例患者采用特异性TILs进行治疗，也获得较好的疗效[42]。Ratto等利用AIT并结合放射性疗法治疗113例NSCLC，TILs在术后6-8周静脉回输给患者，数量为4×109-7×1010，前两周剂量逐渐上升，后两周逐渐下降，持续回输2-3个月。结果表明，对Ⅱ期NSCLC，AIT治疗与对照组(无辅助治疗)平均生存期分别为22.3个月和31个月。对Ⅲ A期NSCLC，AIT组OS显著高于常规治疗组(化疗加放疗) (P=0.06)，平均生存期分别为22个月和9.9个月。对Ⅲ B期患者，AIT组OS显著高于常规治疗组(P < 0.01)，平均生存期分别为23.9个月和7.3个月。治疗期间，AIT组生存率无明显变化，而对照组中不少患者死于复发[43]。超过80%的患者未出现严重的毒副作用，因此AIT在未来可以作为NSCLC辅助治疗方案。Kradin等也开展了TILs临床应用研究，他们对7名患有肺转移性腺癌的患者给予T淋巴细胞回输治疗，发现有5名患者的肿瘤减小，但没有患者达到完全或部分缓解；3名患者出现皮肤迟发性超敏反应。因此得出结论，肿瘤浸润T淋巴细胞可以安全地输注到人体中，并且可能会增强免疫反应并介导体内肿瘤的减小[44]。国内也有学者展开了相应的研究，李东复等对7例肺癌患者行TILs回输免疫治疗，结果大部分患者的状态明显改善，免疫功能增强，除有轻度发热及1例血压下降外，无其他明显副作用[45]。
TILs临床初步应用表明，机体能够耐受一定剂量的TILs，且副作用少；IL-2对TILs发挥体内杀瘤效应有协同作用；环磷酰胺能显著增强TILs的体内抗瘤活性，但TILs体外活性与体内效应并非总是一致。
3 TILs与肝癌 3.1 TILs在肝癌预后评估中的作用原发性肝癌包括胆管细胞癌，亦有混合性肿瘤的情况，但是临床上主要以肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)最为常见。大量临床研究发现，TILs的水平与HCC的预后显著相关。Cai等发现肝癌瘤内DC的高浸润度提示较高的无病存活时间(Disease-free survival，DFS)，瘤内CD45+细胞(P=0.003)、CD3+ T细胞(P=0.005)及CD8+ T细胞(P=0.037)浸润均与延长的DFS密切相关[46]。Th17细胞主要效应因子是IL-17，Th17细胞具有强烈的促炎作用，在炎症和自身免疫性疾病中起着积极的作用。Zhang等通过对178例HCC患者采用流式细胞术和免疫组化法测定肿瘤内产生IL-17细胞的分布和表型特征，结果表明Th17细胞在HCC患者肿瘤中富集(P < 0.001)。大多数肿瘤内Th17细胞表现出效应记忆表型，其中CCR4和CCR6的表达增加。肿瘤内产生IL-17细胞的密度与HCC患者的OS (P=0.001)和DFS (P=0.001)显著相关，瘤内产生IL-17的细胞密度的增加预示着不良预后。多变量Cox分析显示肿瘤内产生IL-17细胞的密度是OS (P=0.009)和DFS (P=0.002)的独立预后因素[47]。
在更深入的研究中，Wang等在对249名结直肠癌肝转移患者的肝转移分析中，通过对瘤内和癌周区域中CD3+和CD8+ T细胞进行免疫评分发现，免疫评分高(> 2)组相对于免疫评分较低组(≤2)，其无复发生存率(Relapse-free survival，RFS) (P < 0.001)和OS (P < 0.001)均显著延长，免疫评分高组RFS中位数为21.4个月，OS未达到终点；免疫评分低组RFS中位数为8.7个月，OS中位数为28.7个月。因此，肝转移的TILs可用于预测肝切除术后结直肠癌肝转移患者的预后[48]。另外，来自46项研究涉及7 905名HCC患者的Meta分析显示，瘤内FOXP3+ TILs的密度是最重要的预后因子(P < 0 .001)。其密度越高，HCC患者的预后越差；瘤内或癌周CD8+ TILs浸润的患者OS明显延长(P =0.001)；颗粒酶B表达为阳性的T淋巴细胞在瘤内的浸润与更好的OS (P < 0 .001)和DFS (P < 0.001)相关。有趣的是瘤内高密度的CD3+细胞的浸润预示着更差的OS (P=0.037)，但是预示着更好的DFS (P=0.029)[49]。因此部分TILs亚群可以作为HCC的预后因子，同时需要更高质量的随机对照试验来确定这些TILs是否可以作为HCC免疫治疗的靶点。
3.2 TILs在肝癌中的临床治疗肝癌具有恶性程度高、死亡率高、进展快、复发快、转移快的特点，HCC占肝癌病例的绝大部分，术后HCC患者的五年复发率高达70%[50]。Pan等在对410例HCC患者研究发现，经过CIK免疫治疗的患者OS显著高于单纯手术组(P=0.000 7)。接受≥8周期CIK细胞输注的患者的生存率明显高于 < 8周期组(P=0.027 2)，因此CIK细胞输注术后免疫治疗可能是改善HCC患者预后的有效辅助治疗方法[51]。在另一项Ⅰ期临床实验研究中，15名HCC患者在肿瘤切除后，用其活化和扩增的TILs进行治疗。在过继治疗后观察到T细胞的数量瞬时增加，患者的不良反应主要为轻度流感样症状。中位随访14个月后，15名患者(100%)存活；12名患者(80%)未发现疾病迹象，仅有3名患者肿瘤复发[52]。这些结果表明，用激活并扩增的自体TILs进行免疫治疗具有安全性和有效性的特点，因此可以作为HCC患者的新型治疗方式。
4 TILs与胃癌 4.1 TILs在胃癌预后评估中的作用胃癌在不同地理和人群中的发病率存在很大差异，韩国、日本、我国等东亚国家胃癌发病率和死亡率明显高于北美、西欧及非洲地区的国家[53]。全国肿瘤登记中心数据显示，2015年我国胃癌新发病例约为67.9万例，胃癌死亡病例约为49.8万例，严重危害我国居民健康[54]。微卫星序列是短串联重复序列，是单个碱基或碱基片段(1-6个碱基)的重复序列(通常重复次数在10到60次)，他们分散在基因的编码区或非编码区。错配修复蛋白是一组核酶，在DNA复制完成后发挥作用，错配修复蛋白沿DNA链滑动，当遇到基因错配时便进行修复。如果缺乏DNA错配碱基修复酶，导致复制错误DNA的堆积在增生的细胞中不能被修复，易诱发肿瘤。错配修复缺失会引起基因组中累积重复几十到上百次的核酸碱基短序列的异常，称为MSI，与之相对应的是MSS[55]。在结直肠癌研究中，MSI高频型(MSI-H)患者预后较MSI低频型(MSI-L)和MSS患者好，其5年OS率和DFS率显著高于MSI-L和MSS患者。Kim等进一步研究了99例MSI-H胃癌患者中的瘤内CD8+和FoxP3+ TILs对患者预后的影响，研究表明高密度CD8+或FoxP3+ TILs的浸润比低密度CD8+或FoxP3+ TILs的胃癌患者具有更高的总存活率(P分别为0.017和0.013)；在多变量生存分析中，CD8+和FoxP3+ TILs同时高度浸润与良好的预后相关(P=0.003)，因此CD8+和FoxP3+ TILs可共同作为MSI-H胃癌患者的独立预后因子[56]。另外一项涉及4 942名胃癌患者的Meta分析显示，瘤内CD8+和CD3+ T细胞的高度浸润与延长的OS显著相关[57]。
由此看出FoxP3+ Tregs在不同癌症中的作用有所不同，在胃癌中与良好的预后有关，但在肺癌中与更差的预后相关。
4.2 TILs在胃癌中的临床治疗AIT虽然在胃癌治疗中得到了广泛的应用，但是临床治疗当中仍然存在着很多问题，如对胃癌患者的治疗中仍存在着靶向性不足，肿瘤细胞免疫逃逸机制使其无法发挥杀伤作用等缺点。因此，如果要达到充分发挥免疫细胞的抗肿瘤作用，需要积极联合其他手段增强其对肿瘤细胞的识别能力，避免脱靶效应。Peng等利用IL-15基因转染CIK细胞后，提高了其增殖能力和肿瘤杀伤效果[58]。有随机临床Ⅱ期研究将CIK细胞、脐带血来源的DC和化疗3种方式联合应用于进展期胃癌患者，显著延长了其无瘤生存期，治疗过程中对患者无明显的毒副作用[59]。由此可见，如果要达到充分发挥CIK细胞的抗肿瘤作用，需要积极联合其他手段增强其对肿瘤细胞的识别能力，避免脱靶效应。
CAR-T免疫疗法已成功应用于多种血液系统恶性肿瘤[60-62]，此疗法通过在T淋巴细胞膜直接表达肿瘤抗原的受体，使T淋巴细胞的激活不再依赖MHC分子就能激活相应的效应细胞，从而达到杀伤肿瘤的作用[63]。目前针对胃癌治疗的CAR-T细胞治疗仍在探索当中，其主要难点在于肿瘤抗原的选择。目前已有研究针对CEA、HER-2/neu、NKG2D等作为胃癌肿瘤抗原靶点设计了相应的CAR[64-66]，但均以针对胃癌细胞株的体外实验、动物实验为主，部分项目启动了临床入组计划(NCT02349724、NCT02416466)，大规模的临床应用研究尚未进行，其探索的道路依旧漫长。
5 TILs与食管癌 5.1 TILs在食管癌预后评估中的作用2018年全球癌症生存趋势监测计划CONCORD-3的研究结果显示，近10年来我国食管癌生存率增长了7%左右[67]。食管癌常见的类型为腺癌、鳞癌、肉瘤样癌等，其中以食管鳞状细胞癌最常见[68]。Chen等在对566例食管鳞状细胞癌患者的研究表明，上皮内CD4+ T淋巴细胞的浸润明显高于肿瘤基质区(P < 0.001)。上皮CD4+淋巴细胞的浸润与较长的OS (P=0.001)显著相关。CD3+和CD8+ T淋巴细胞的浸润均与食管鳞状细胞癌患者的预后无关(P > 0.05)。因此上皮CD4+ T淋巴细胞浸润可能是食管鳞状细胞癌患者预后的有利指标[69]。另外一项涉及2 909名患者的Meta分析显示总TILs是食管癌患者OS的有利预后指标(P < 0.001)。对于TILs亚群，CD8+ TILs与改善的OS (P < 0.001)和DFS (P < 0.001)相关；FoxP3+ TILs的浸润与患者减少的DFS相关(P=0.003)，CD57+ TILs浸润预示患者的OS更好(P < 0.001)。此外，其他TILs亚群包括CD3+、CD4+和CD45RO+ TILs与患者的生存期无关(P > 0.05)[70]。因此，一些淋巴细胞可以作为食管癌预后的生物标志物，但关于TILs在食管癌免疫治疗中的应用需要通过大量的临床研究来验证。
5.2 TILs在食管癌中的临床治疗食管癌的治疗主要以手术治疗为主，术后辅以放化疗，但放化疗对机体的免疫功能影响较大，中晚期食管癌治疗的预后仍不乐观。Fujiwara等从5例食管癌患者的外周血中分离了DC细胞并进行体外培养，用111In标记成熟的DC细胞，并注射到瘤体内，再进行根治性手术切除。结果显示，注射到肿瘤组织内部成熟的DC细胞并不能有效地向引流淋巴结迁移，无法获得最佳的临床反应[71]。Toh等进一步报道，将来自食管鳞状细胞癌患者的PBMC在体外用自体肿瘤细胞刺激后，直接注射到原发性肿瘤和转移部位，同时给予静脉注射IL-2。离体产生的自体肿瘤激活的淋巴细胞每2周共13次局部注射到患者锁骨淋巴结，每次注射给药细胞的平均数量为0.8×109个。在免疫治疗期间，观察到患者2级腹泻和发烧，在所有病变中获得临床局部缓解并持续11个月。由于临床毒性较小，因此这种免疫疗法可能对转移晚期食管癌患者有效[72]。针对食管癌的免疫治疗目前多处于临床研究阶段，尚无成熟的药物可应用于临床，需要更多的转化研究进行探索。
6 TILs与结直肠癌 6.1 TILs在结直肠癌预后评估中的作用临床上普遍采用TNM分期系统评估结直肠癌患者的预后。近年来，“免疫评分”技术逐渐成为研究热点。1998年，Naito等运用半定量方法分析了139例结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)患者，首次报道了瘤内的CD8+ T淋巴细胞浸润可能是其独立的预后因素[73]。Salama等对967个Ⅱ期和Ⅲ期CRC病人研究发现，与正常结肠粘膜相比，肿瘤组织中的FOXP3+ Tregs浸润更多，而CD8+和CD45RO+细胞浸润很少。FOXP3+ Tregs的密度是CRC独立的预后指标，CD8+和CD45RO+细胞则与预后无关。正常粘膜中的FOXP3+ Tregs的高度浸润与较差的预后相关(P=0.019)。相反，肿瘤组织中FOXP3+ Tregs的高度浸润与改善的存活率相关(P=0.001)。因此，FOXP3+ Tregs在CRC中具有强烈的预后意义[74]。
近日，一项涉及5 108名患者的Meta分析研究了TILs的亚群组成、位置对CRC患者的预后影响，结肠癌患者结果显示，基于TILs细胞类型分析发现，CD8+和FOXP3+ T淋巴细胞(非CD3+ T细胞)与改善的DFS和OS有关；此外，关于TILs的位置研究显示，只有在肿瘤基质中FOXP3+ T淋巴细胞的高度浸润与改善的OS显著相关(P= 0.000 7)，在肿瘤浸润边缘中，CD3+ T细胞高度浸润预示DFS增加(P=0.008)。瘤内CD8+ T细胞高度浸润与改善的DFS相关(P < 0.000 01)[75]。
总之，肿瘤组织中TILs的密度或亚型与延长的存活率密切相关，此外，在特定的浸润部位仅有一些TILs亚型的高度浸润与良好的预后相关。仍需要进一步的研究来验证TILs在CRC中的预后价值，以进一步增加关于TILs的免疫评分和免疫疗法的有效性。
6.2 TILs在结直肠癌中的临床治疗目前，临床针对结直肠癌的主要治疗方式仍是手术治疗，但是单纯手术治疗效果并不能达到预期，术后复发率较高，且并发症多。Takeshi等运用NK细胞免疫疗法与IgG1抗体联合治疗晚期胃癌或结肠直肠癌来观察其有效性和安全性。施用IgG1抗体3 d后，每周向患者输注扩增的NK细胞3次，以0.5×109、1.0×109和2.0×109细胞的剂量逐渐递增。结果表明，患者体内富集NK细胞(中位数92.9%)且NKG2D (97.6%)和CD16 (69.6%)高表达。联合治疗结果显示此疗法耐受性良好，无严重不良事件。在6名可评估的患者中，4名呈现疾病稳定，2名患者出现疾病进展。在4名疾病稳定患者中，3名患者肿瘤减小，血液中IFN-γ数量增加，Tregs减少。总之，这项Ⅰ期试验为先前接受过治疗的晚期胃癌和CRC患者提供了有希望的治疗方法[76]。DC联合CIK是目前肿瘤免疫治疗的重要组成部分。DC和CIK共同培养使CIK细胞溶瘤活性明显加强，更具特异性杀死肿瘤靶细胞[77]。国内也有研究探讨了DC-CIK免疫疗法联合化疗应用于晚期CRC中的临床疗效。结果显示，观察组治疗缓解率显著优于对照组(P＜0.05)[78]。翁海光等的研究也显示相似的结果，并且DC-CIK组患者的Ⅲ-Ⅳ度不良反应中，血白细胞下降的发生率为22.0% (11/50)，低于单纯化疗组(P < 0.05)[79]。说明DC-CIK免疫疗法联合化疗可显著提高晚期CRC患者的临床疗效，延长患者生存期，提高生存质量。另外在Zhang等的研究中显示，CAR-T细胞免疫疗法对胚胎抗原阳性结直肠患者有良好的耐受性，在10名患者中，两名患者病情稳定超过30周，且肿瘤缩小；接受高剂量CAR-T疗法的患者外周血中CAR-T细胞的持续存在，大多数患者的血清胚胎抗原水平下降明显[80]。因此，AIT在CRC治疗中具有较高的安全性和有效性，具有良好的应用前景。
7 TILs与乳腺癌 7.1 TILs在乳腺癌预后评估中的作用乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的健康。乳腺癌根据表达受体不同分为3个主要亚型：ER/PR阳性型、HER2阳性和三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)。乳腺癌中TILs的数量是改善患者存活率的有利预后因素，尤其是在TNBC和HER2过表达的乳腺癌亚型中[81]。近期一项研究收集了2 148个患者样本探究早期TNBC中TILs的预后价值，共观察到736例侵袭性无病生存和548例无远端疾病生存事件以及533例死亡事件。在多变量模型中，肿瘤基质TILs浸润程度的增加与延长的侵袭性无病生存(P < 0.001)，无远端疾病生存(P < 0.001)和OS (P < 0.001)显著相关。在肿瘤基质中TILs≥30%的淋巴结阴性患者，患者3年侵袭性无病生存率为92%，无远端疾病生存为97%，总生存率为99%[82]。另外一项242例TNBC患者中发现，与T-bet-肿瘤患者相比，T-bet+肿瘤患者的OS更长(P=0.047)。与CD8+ T-bet-肿瘤相比，CD8+和T-bet+的患者具有更好的RFS (P=0.037)和OS (P=0.024)[83]。在更深入的研究中，Savas等对乳腺癌患者中6 311个T细胞进行了scRNA-seq，结果显示乳腺癌患者中含有高度浸润的组织驻留记忆(Tissue-resident memory T cell，TRM) CD8+ T细胞，并且这些CD8+ TRM细胞表达高水平的免疫检查点分子和效应蛋白。CD8+ TRM细胞与TNBC中患者存活率的改善显著相关，并且比单独的CD8+细胞具有更好的预后作用[84]。因此，TILs可作为乳腺癌预后因子。
7.2 TILs在乳腺癌中的临床治疗TNBC患者具有较高的转移和进展风险，医生会根据肿瘤的分期和患者的身体状况，酌情采用手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段。乳腺癌患者的骨髓中含有具有治疗潜力的肿瘤反应性记忆T细胞(Tumor-reactive memory T cells，TC)，过继性T细胞输注会导致循环肿瘤抗原反应性Ⅰ型TC的产生。Domschke等描述了16名转移性乳腺癌患者的长期临床结果及其与肿瘤特异性细胞免疫应答的相关性，TC在体外首先与自体DC细胞和MCF-7乳腺癌细胞的裂解物共培养从而激活，然后扩大培养后输注回患者体内，结果显示16名患者中有7名对治疗有响应，总队列中观察到总体中位生存期为33.8个月，其中3例患者在接受AIT治疗后存活时间超过7年。转移的肿瘤反应性TC的数量与患者的总体存活率显著相关(P=0.017)。AIT治疗后外周血具有免疫应答的患者的中位生存期明显长于无应答者(中位生存期为58.6个月对13.6个月；P=0.009)。AIT治疗后产生免疫反应的患者OS明显延长，此疗法有良好的应用前景[85]。乳腺癌中常表达细胞表面分子C-Met，因此Williams等设计了针对C-Met特异的CAR，进行了0期临床试验(NCT01837602)，以评估通过肿瘤内使用RNA转染的C-Met CAR-T细胞治疗转移性乳腺癌的安全性和可行性。通过RNA转染使CAR分子的瞬时表达限制靶标/肿瘤外效应来确保安全性。单次瘤内注射量为3×107个或3×108个细胞。在瘤内注射后不久，分别在2名和4名患者中检测到外周血和肿瘤组织中的低水平CAR-T mRNA，患者均无细胞因子释放综合征或比研究药物相关的1级更严重的不良事件。因此CAR-T疗法在乳腺癌患者治疗中具有良好的耐受性[86]。目前，AIT疗法在乳腺癌中的研究还较少，仍需要大量临床试验验证此疗法的疗效。
8 TILs与宫颈癌 8.1 TILs在宫颈癌预后评估中的作用宫颈癌是威胁全球妇女健康及生命的主要恶性肿瘤之一，目前其发病率占女性恶性肿瘤第4位，人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是导致宫颈癌最为常见的因素之一[87]。Carus等在对101名宫颈癌患者的研究中发现，在癌周和肿瘤基质中CD66b+中性粒细胞和癌周CD163+巨噬细胞的高度浸润与短RFS显著相关。多变量分析发现癌周中性粒细胞高度浸润(P=0.03)，CD8+淋巴细胞低度浸润(P=0.002)，可以作为短RFS的独立预后因素，而CD163+巨噬细胞与预后无显著相关性[88]。
Asuka等调查了148例宫颈癌患者，发现较高密度的肿瘤浸润性CD204+ M2巨噬细胞与较短的DFS显著相关，但CD4+、CD8+、FOXP3+、PD-1+淋巴细胞和CD68+巨噬细胞与预后无显著相关性。且侵袭性肿瘤基质中TILs和巨噬细胞的密度显著高于原位肿瘤。表达p16的HPV阳性肿瘤中TILs的密度显著高于HPV阴性的肿瘤。因此肿瘤浸润性CD204+ M2巨噬细胞是宫颈腺癌患者预后不良的因子[89]。
8.2 TILs在宫颈癌中的临床治疗宫颈癌起病隐匿，早期症状不明显，不同地区之间存在着宫颈癌筛查手段及治疗技术的差异，半数以上的患者就诊时已处于中晚期。转移性宫颈癌是一种典型的化疗耐受型上皮恶性肿瘤，Stevanović等研究了AIT治疗转移性宫颈癌的疗效，患者需之前接受过铂类化疗或放化疗，再接受单次输注肿瘤浸润性T细胞治疗，结果显示：9名患者中有3名对疗法产生响应，其中2例表现出持久缓解(分别为22、15个月)[90]。另外，杨怡等用DC-CIK治疗60例宫颈癌患者，结果显示与治疗前相比，患者的淋巴细胞亚群的数量如CD3+、CD8+、CD56+、CD3+ CD8+、CD3+ CD56+较治疗前显著升高。颗粒酶B和穿孔素的表达量显著上调；患者的KPS评分明显改善(P < 0.01)，疼痛评分明显降低(P < 0.05)，生活质量提高；肿瘤标志物SCCA和CA125明显下降(P < 0.05)；没有出现明显的毒副反应(P < 0.05)；临床获益率能够达到80%[91]。因此，DC-CIK细胞免疫疗法治疗宫颈癌能使患者得到临床获益，对于促进患者微小残留病灶的清除以及防止肿瘤的复发和转移等有一定意义。
9 总结与展望TME是一个高度复杂且动态变化的环境，TILs在不同实体瘤和不同临床分期中有着不同程度的浸润，大量研究证实了通过检测TILs的亚群组成、数量和区域分布情况对于实体瘤预后具有重要价值。
目前在不同实体瘤中T细胞的研究最多且研究体系较为成熟。且不论是在肿瘤基质、瘤内还是癌旁/周，CD45+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润大多与实体瘤良好的预后相关。FOXP3+ TILs目前在不同肿瘤中的预后作用报道不一，比如结直肠癌和胃癌瘤内FOXP3+ TILs的浸润表明患者的预后良好，而在肝癌和食管癌的报道中，FOXP3+ TILs在瘤内的浸润显示患者的预后更差；肺癌和结肠癌肿瘤基质中FOXP3+ TILs的浸润，表明患者具有更好的预后，而在结直肠癌癌周部位FOXP3+ TILs的浸润则显示更差的预后。因此FOXP3+ TILs在实体瘤的预后作用仍有待进一步探究。CD66+中性粒细胞和CD204+ M2巨噬细胞在瘤内浸润均与宫颈癌不良的预后相关。因此，多个指标的联合使用，用于预测肿瘤患者的预后是今后的发展方向。
不仅如此，抗肿瘤的TILs介导的过继性免疫治疗方法已在多种实体瘤中取得了良好的疗效。TILs作为效应细胞来自患者自体，其杀伤肿瘤细胞作用强。AIT通过增强实体瘤患者免疫系统的功能，使肿瘤缩小，患者病情稳定时间可以超过数十周甚至更长时间，因此AIT是治疗实体瘤患者非常有前景的治疗方法。但TILs在实体瘤临床治疗中仍然存在一些问题：①其治疗对象有一定的限制。患者如果具有严重的自身免疫性疾病、脏器移植病史、哺乳期或妊娠期内、对细胞因子过敏、罹患T淋巴细胞瘤等情况中的一种或几种时，是不适于接受AIT的。②AIT过程中免疫活性细胞的制备、扩增、回输等环节复杂，可能免疫效应产生之前对治疗效果发生显著影响。目前不同种类免疫活性细胞的制备尚无统一的标准，不同研究单位选用的材料、方法不同，细胞扩增后细胞的数量和质量无法保障，这也是当前临床试验需要解决的问题。③在不同肿瘤类型中，AIT还存在缺乏合适的肿瘤特异性靶标的问题，寻找如EGFRvIII和CD19这样的特异性靶点是提高AIT治疗实体瘤有效性和安全性的重要手段。
综上，TILs过继治疗与传统治疗(如手术和放化疗)和新兴疗法(免疫检查点抑制剂和基因改造)联合是未来临床治疗的发展趋势。不同肿瘤中TILs亚群及功能的进一步研究鉴定，是开发肿瘤免疫治疗新方法的基础。
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