猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原^[1]。该病流行范围广、传播速度快，是严重影响养猪业发展的重要传染病之一^[2]。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是迄今发现的能在哺乳动物细胞内自主复制的最小动物病毒，病毒粒子直径约为17 nm，无囊膜，基因组为单链环状DNA^[3]。PCV2基因组全长1 766–1 768 nt，预测含有11个开放阅读框(Open reading frame, ORF)^[4]。目前仅5个orf的编码产物被证实，orf1编码的Rep和Rep’蛋白，是病毒的复制酶^[5]；orf2编码衣壳蛋白Cap，是病毒的结构蛋白，也是病毒引起宿主免疫应答的主要抗原^[6-7]；orf3、orf4和orf5编码的蛋白非病毒复制所必需，前两者与病毒诱导的细胞凋亡相关^[8-9]，后者可能与内质网压力及NF-κB的激活相关^[10]。

前期研究报道，ORF4蛋白的缺失不仅影响病毒诱导的细胞凋亡水平，还影响了宿主体内的免疫细胞数量^[9]，提示ORF4蛋白与病毒致病力密切相关。Gao等对比orf4缺失毒与野毒感染情况下病毒各蛋白转录水平，发现缺失毒感染后orf3转录水平显著高于野毒，从而推测ORF4蛋白通过降低orf3转录量间接抑制凋亡诱导^[11]。Lv等通过酵母菌双杂交试验筛选出4个与ORF4结合的宿主蛋白，利用激光共聚焦、免疫共沉淀及GST pull down试验证实重链铁蛋白(Ferritin heavy chain，FHC)与ORF4蛋白结合^[12]。深入探究发现FHC与ORF4结合致使胞内FHC浓度减少，随后抑制活性氧簇(Reaction oxygen species，ROS)的大量聚集，最终拮抗凋亡^[13]。最近，本实验室研究发现ORF4具有核质双重定位特征，定位胞浆的ORF4蛋白与线粒体内膜蛋白腺嘌呤易位体3 (Adenine nucleotide translocator 3，ANT3)结合激活线粒体凋亡通路，从而诱导细胞凋亡^[14]。现今，对ORF4的研究主要与凋亡相关，该蛋白的其他特性及功能仍不甚明了。因此，探讨并揭示ORF4的胞内互作蛋白有助于对ORF4功能的研究。文中通过GST pull-down联合质谱技术，对细胞中与ORF4互作的潜在蛋白进行筛选和鉴定。尝试寻找ORF4参与病毒感染的具体通路，为ORF4蛋白的生物学功能及其作用机制研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 生物材料及主要试剂

PCV2 HZ0201株(AY188355)由本实验室分离、鉴定并保存^[4]；HEK293T cells (ATCC，CRL-11268)购自ATCC细胞库并由本实验室传代保存；克隆宿主菌DH5α由本实验室保存；质粒pGEX-4T-1购自GE Healthcare Life Biosciences公司；pCMV-N-Flag真核表达载体及pDsRed2-Mito购自Clontech Laboratories公司；UNIQ-10柱式病毒基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ClonExpress^® Ⅱ One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Flag鼠单抗购自Sigma-Aldrich公司；GST鼠单抗购自杭州华安生物技术有限公司；ORF4鼠单抗6A5由本实验室保存；FITC标记羊抗鼠IgG (H+L)购自美国KPL公司；DAPI购自Roche Life Science公司；谷胱甘肽琼脂糖珠(GST)购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 pCMV-N-Flag-GST真核表达载体改造及pCMV-N-Flag-GST-ORF4重组质粒构建 1.2.1 pCMV-N-Flag-GST真核表达载体改造

以pCMV-N-Flag质粒为骨架构建含Flag以及GST双标签的重组质粒用于后续研究。首先，使用Hind Ⅲ酶切载体pCMV-N-Flag，回收备用，同时以原核表达载体pGEX-4T-1为模板扩增gst片段，再通过同源重组方法将gst片段插入至pCMV-N-Flag载体多克隆位点(MCS)中Hind Ⅲ下游，且保证不影响Hind Ⅲ下游MCS的使用。扩增gst的引物序列为：GST-上游引物：5′-CAAGGACGACGATGACAAGCTTATGATTAGTGTACACCACC-3'，GST-下游引物：5'-CGAATTCGGGCCTCCATGGCCATTATATCAGCAGAATTTC-3' (下划线部分为同源重组臂)。

1.2.2 构建pCMV-N-Flag-GST-ORF4重组质粒

使用病毒基因组抽提试剂盒提取的PCV2 HZ0201的基因组为模板，引物：ORF4-上游引物：5'-CGGAATTCGGATGACGTGTACATTAGTCTTCC-3'，ORF4-下游引物：5'-CCCTCGAGTCAGGGACAACGGAGTGACCTGTC-3' (下划线部分为酶切位点)，PCR扩增获得orf4片段，利用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切改造过的pCMV-N-Flag-GST载体及orf4目的片段，连接后转化DH5α感受态，阳性克隆经测序完全正确后，提取质粒用于后续研究。

1.3 细胞培养及细胞转染

长满单层的293T细胞，使用0.05%胰酶消化1–2 min，待细胞间隙变大后，使用含2%血清的培养基终止消化，并按1: 2的比例传代到指定的培养皿内，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养12–16 h，待细胞长满70%–80%，即可用于转染。转染过程参见说明书。转染后继续培养24 h用于后续试验。

1.4 总蛋白提取、SDS-PAGE和免疫印迹

收集并裂解细胞样品。首先，弃掉培养基，加入预冷PBS润洗3次，最后一次加入PBS后将细胞收集到1.5 mL EP管内，3 000 r/min离心5 min，弃上清，加入90 μL的细胞强裂解液(主要成分为2% SDS、1% Triton X-100) (以六孔板为例)，并将细胞沉淀吹悬后完全裂解，随后按比例加入4×蛋白上样缓冲液，混匀煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清上样。

按照《精编蛋白质科学实验指南》^[15]中的方法配制12%聚丙烯酰胺凝胶，将待检样上样电泳，80 V、30 min将样品压成线后再以120 V恒压电泳至条带充分分离，结束电泳。通过半干转印法将蛋白转移到0.45 μm硝酸纤维素膜(Nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)上，NC膜经5%脱脂乳封闭处理后进行抗体孵育，并显色。其中孵育的一抗包括抗Flag鼠单抗(1: 2 000)，GST鼠单抗(1: 4 000)，ORF4鼠单抗(1: 200)，对应的二抗为HRP标记的羊抗鼠二抗(1: 8 000)。

1.5 激光共聚焦显微镜试验

细胞传代后接种到共聚焦小皿内，待长满40%–50%，将DsRed-mito分别与pCMV-N-Flag- GST和pCMV-N-Flag-GST-ORF4共转染细胞。转染24 h后，使用4%多聚甲醛，室温固定细胞20 min，0.2% Trinton X-100透化细胞2 min，经5%脱脂奶封闭后，孵育一抗Flag鼠单抗，并用FITC标记的羊抗鼠二抗(1: 200)指示蛋白，DAPI (10 μg/mL)室温染核10 min指示细胞核，洗涤加入PBS，使用蔡司LSM780激光共聚焦显微镜观察。

1.6 GST pull-down试验

分别收集转染pCMV-N-Flag-GST及pCMV- N-Flag-GST-ORF4细胞样品(约1×10⁷个细胞)，加入1 mL NP40裂解液(PMSF终浓度1 mmol/L)，冰浴裂解细胞30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清；随后向上清中加入GST琼脂糖珠50 μL，4 ℃混悬仪孵育4 h，1 000 r/min离心5 min后弃上清，再加入1 mL的PBS洗涤4次，最后一次洗涤后，弃上清并加入45 μL PBS，同时加入15 μL的4×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，进行SDS-PAGE (12%凝胶)分离蛋白。

1.7 银染试验

GST pull-down样品经SDS-PAGE分离后，将聚丙烯酰胺凝胶转入固定液(V_无水乙醇: V_冰乙酸: V_双蒸水= 4: 1: 5)中室温固定30 min；双蒸水清洗后转入敏化液(醋酸钠68 g，硫代硫酸钠3.14 g，无水乙醇0.3 L，加入双蒸水定容至1 L)孵育30 min，随后双蒸水漂洗3次；再将凝胶放入银染液(硝酸银2.5 g，37%甲醛100 μL，双蒸水配平至1 L)中避光孵育25 min，双蒸水淋洗后加入显色液(无水碳酸钠25 g，甲醛0.4 mL，硫代硫酸钠0.031 4 g，加入双蒸水后定容至1 L)孵育3–7 min，以终止液(5%冰乙酸)终止显色，双蒸水洗涤后使用ImageScanner Ⅲ扫描仪扫描凝胶并保存图片。选择实验组与对照组之间差异显著的条带进行质谱鉴定。

2 结果与分析 2.1 pCMV-N-Flag-GST质粒的构建

以pGEX-4T-1质粒为模板经PCR扩增gst基因片段，获得约700 bp产物，与预期gst片段分子大小吻合(图 1A)。将目的片段按同源重组的方法插入pCMV-N-Flag载体中，pCMV-N-Flag载体以及经改造后的pCMV-N-Flag-GST的图谱见图 1B。经过测序验证，插入的gst序列位于pCMV-N-Flag载体中Hind Ⅲ限制性内切酶位点下游且序列完全正确。

2.2 ORF4重组质粒构建及融合蛋白表达

以PCV2 HZ0201基因组为模板经PCR扩增获得orf4片段，如图 2A所示。经双酶切后插入到改造成功的pCMV-N-Flag-GST载体中。将构建成功的pCMV-N-Flag-GST及pCMV-N-Flag-GST- ORF4瞬时转染到293T细胞中，转染24 h后收集细胞，制备蛋白样品。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blotting后，分别使用Flag鼠单抗、GST鼠单抗以及ORF4鼠单抗检测融合蛋白的表达，结果如图 2所示，Flag-GST融合蛋白分子量约为30 kDa，与预计大小一致，能够被Flag及GST标签抗体识别，但无法与ORF4抗体反应；Flag-GST-ORF4蛋白分子量约为37 kDa，能同时与3种抗体反应。该结果表明上述构建的重组质粒转染后可成功表达。

2.3 ORF4融合蛋白定位分析

ORF4蛋白分子量仅有6.5 kDa，与大标签融合后有可能会影响蛋白定位。根据前期研究发现ORF4蛋白定位于线粒体，为了检测GST标签蛋白是否会影响ORF4的胞内定位，将pCMV-N-Flag-GST与pCMV-N-Flag-GST-ORF4分别与pDsRed2-Mito共转293T细胞，转染24 h后，进行间接免疫荧光试验，通过激光共聚焦显微镜观察荧光分布。结果如图 3所示，pDsRed2-Mito在细胞内呈红色荧光并以点状或杆状分布于胞质内，指示线粒体；pCMV-N-Flag-GST转染细胞后呈绿色荧光，在胞质中呈弥散分布；pCMV-N-Flag-GST-ORF4转染后呈绿色点状分布，与线粒体存在共定位。上述结果表明融合蛋白并没有改变ORF4蛋白的定位，重组质粒可用于后续实验。

2.4 GST pull-down及银染结果

分别收集转染的细胞样品，一部分样品裂解后直接进行SDS-PAGE和Western blotting实验，检测结果如图 4A显示，实验表明质粒转染后可正常表达1、3、5泳道；一部分裂解样品中加入GST琼脂糖珠进行pull-down试验，显示融合GST标签的蛋白能与GST琼脂糖珠成功结合2、4、6泳道。所有蛋白经过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染。如图 4B所示，与Flag-GST经GST pull-down捕获的蛋白条带相比，Flag-GST-ORF4两个重复样品中，在170 kDa以上，70–50 kDa、35–40 kDa处均有1条差异性条带，在40–55 kDa处有2条差异性条带，对差异性条带进行割胶回收和质谱分析。

2.5 质谱分析结果

以得分高于40为筛选标准，如表 1所示，共筛选到5个潜在与ORF4互作的蛋白，它们分别是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶6催化亚基、α心肌蛋白、肌动蛋白、SEC-14样蛋白5和肌球蛋白myosin 9。其中分数相对较高蛋白有肌动蛋白和myosin 9，两者均与细胞骨架调节相关，这预示着ORF4蛋白很可能与细胞骨架有关联。这一发现为后续ORF4蛋白特性及功能的研究提供指向性及理论依据。

3 讨论

猪圆环病毒ORF4蛋白是近几年发现的蛋白，其相关功能的研究还处于初步探索阶段。迄今为止，人们对ORF4蛋白在病毒感染中到底发挥何种作用知之甚少。病毒蛋白通常与宿主蛋白相互作用来发挥其生物学功能，因此，探寻宿主细胞内与ORF4的潜在互作蛋白可为后续ORF4功能的研究奠定基础。研究利用了真核表达的Flag-GST-ORF4蛋白进行GST pull-down试验来捕获与ORF4蛋白互作的宿主蛋白。将gst融合到pCMV-N-Flag载体上，使用真核表达的GST融合蛋白进行试验，而非使用原核表达的GST融合蛋白，更有效地筛选出哺乳动物细胞内可能与ORF4结合的蛋白；利用该筛选方法较传统的原核GST pull-down可信度更高，已有文献通过此种方法成功筛选到了与流感病毒PB1-F2互作的两个蛋白^[16]。

本研究利用上述的方法筛选到5种宿主蛋白，其中actin与myosin 9的分值明显高于其余几种蛋白，预示着它们与ORF4互作的可能性很大。Actin (肌动蛋白)是一种重要的细胞骨架蛋白，几乎所有的真核细胞内均含有肌动蛋白。该蛋白对真核细胞的存活至关重要，它为细胞形态维持提供了内部机械支撑，在细胞内部形成微丝，为细胞内物质的运输提供重要通道，并且也是细胞运动的驱动源^[17]。而myosin 9蛋白是肌球蛋白超家族中的一员，也是细胞骨架重要组成成分。该家族蛋白是与肌动蛋白actin结合的分子马达蛋白，可调节actin的作用，与肌丝结合后被活化，活化后蛋白具有ATP酶活性，水解ATP后产生化学能，从而推动肌丝活动或产生张力^[18]。此外，myosin 9还参与细胞内许多重要的生理过程，例如细胞骨架重组、肌动蛋白纤维运动、蛋白转运等^[19]。近年来很多研究报道细胞骨架，特别是肌动蛋白微丝对病毒运输起着很重要作用。病毒侵入细胞后，为实现有效复制，首先需要将自身遗传物质输送到核内或特定的内膜系统膜上。在高度复杂的细胞内部，蛋白大分子若单纯依靠扩散运输效率极低。因此，大部分的病毒会利用细胞骨架或细胞内运输通道来实现胞内运输^[20-21]。很多病毒通过这种方式进行胞内运输，例如杆状病毒利用肌动蛋白微丝实现病毒基因组由胞质到胞核的过程^[22]；本实验室前期也证明了圆环病毒可通过病毒衣壳蛋白(cap)劫持宿主细胞原有的微管运输系统进行核靶向运输活动^[23]。此外，本实验室也分析了猪圆环感染后的宿主免疫组织基因表达谱，结果显示解聚因子confilin1和肌动蛋白结合蛋白(DSTN)的非磷酸化活性形式发生了上调表达，这提示PCV2感染可能促进了肌动蛋白actin的解聚和重排，利于病毒入侵与运输^[24]。肌动蛋白参与不同细胞的运动过程是基于微丝的组装及肌球蛋白myosin的活化^[25]，病毒可利用actin或actin结合蛋白来实现自身的运输过程^[26-27]。有文献报道myosin IIA与HIV病毒gB蛋白结合后促进病毒入侵^[28]。根据本文研究结果，我们推测ORF4蛋白与myosin结合，调节actin的作用从而间接影响病毒的运输过程；而与actin结合很可能直接影响着细胞骨架的排列，进而调控病毒的运输。这为后续研究ORF4蛋白是否影响细胞骨架以及病毒的入侵与运输提供了有利的依据。另外，也有研究表明小GTP酶Ras蛋白通过cAMP/PKA信号通路来调控线粒体功能，而actin参与调控小GTP酶Ras蛋白^[29-30]。药物处理使actin稳定性下降，可诱发细胞凋亡^[31]。因此，actin与细胞凋亡息息相关，本实验室已发表数据显示ORF4定位线粒体并且与猪圆环病毒诱导线粒体凋亡相关^[14]。然而，ORF4是否还能通过结合actin来间接发挥其诱导线粒体凋亡有待进一步研究。后续研究我们将深入阐明ORF4在病毒感染中发挥的作用，尝试揭示影响病毒感染的潜在机制。