生物工程学报  2018, Vol. 34 Issue (8): 1338-1345
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170522
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

徐旋, 曲芬
Xu Xuan, Qu Fen
碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌诊断进展
Progress in the diagnosis of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae
生物工程学报, 2018, 34(8): 1338-1345
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(8): 1338-1345
10.13345/j.cjb.170522

文章历史

Received: December 27, 2017
Accepted: May 23, 2018
碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌诊断进展
徐旋1,2, 曲芬2     
1 北京大学医学部,北京 100083;
2 解放军第三〇二医院 临床检验医学中心,北京 100039
收稿日期:2017-12-27; 接收日期:2018-05-23
基金项目:北京市科技计划课题(No. 2151100003915151)资助
作者简介:曲芬  解放军第三〇二医院临床检验医学中心主任医师,教授。独立承担全军“十二五”重点课题等共8项;以第一作者或通讯作者在国内外期刊发表论文200余篇;主编副主编专著4部;获军队科技成果一等奖1项,获军队医疗成果奖二等奖4项、三等奖5项;中华预防医学会科学技术成果二等奖1项。社会兼职包括解放军第十届医学科学技术委员会检验医学委员、中国药学会抗生素专业委员会委员、中国研究型医院学会检验医学专业委员会委员等
摘要:碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)在全球快速上升,已出现了不同的基因型,为临床诊治提出新的挑战。CRE分为具有不同特点和耐药基因的三大类五大家族;诊断方法包括Kirby-Bauer法初筛试验,碳青霉烯类药物的协同试验(EDTA与美罗培南、苯硼酸与美罗培南的双纸片抑制法)、改良的Hodge试验、显色培养基检测等CRE筛选试验,而Carba NP比色微管试验、PCR及测序等为CRE确认试验。上述方法均各有其优缺点,可根据当地的主要流行CRE型别和实验条件选择应用。
关键词碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌(CRE)     诊断     耐药    
Progress in the diagnosis of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae
Xuan Xu1,2, Fen Qu2     
1 Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China;
2 The Medical Center of Clinical Laboratory of 302th Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Abstract: Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) is rising rapidly all over the world, and challenges clinical diagnosis and treatment by various genotypes. This paper summarizes the characteristics and diagnostic methods of CRE. CRE can be divided into three categories and five families with various characteristics and resistant genes. The diagnosis method include the Kirby-Bauer screening test, double disc synergetic inhibition test with carbapenems collaboration (double disc EDTA and meropenem, phenylboronic acid and meropenem), modified Hodge test, chromogenic medium detection for selected test of CRE, and Carba NP colorimetric test, PCR and sequencing for CRE confirmation test. Each method has its own advantages and disadvantages, and can be applied according to the local main popular CRE genetypes and experimental conditions.
Keywords: carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE)     diagnosis     resistance    

美国疾病控制中心(Center of diseases control,CDC)定义碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)为肠杆菌科细菌对多利培南、厄他培南、美罗培南或亚胺培南不敏感,或者证实肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶[1]。其中肠杆菌科包括62个属,常见引起人类感染的有10个属,是重要的临床感染病原菌[2]。碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强并对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点。随着其广泛应用,耐药快速增长,其中CRE由于高度耐药、传播速度快、致死率高而备受关注,被世界卫生组织(World health organization,WHO)列为全球耐药的紧急威胁。WHO于2014年公布肺炎克雷伯菌的CRE产生率在欧洲、东南亚和地中海东部地区分别高达68%、55%和54%[3];CRE在美国的发生率分别为:肺炎克雷伯菌11%,大肠埃希菌2%,相关死亡率高达40%–50%[4-5];而中国的CRE的产生率在快速上升,最高地区达14.97%,总体病死率达33.5%[6]。入院携带CRE的患者直接增加住院期间的感染率及死亡率[7-9];CRE的出现及种类的不断增加,也造成严重的社会与经济负担[10],更为临床诊治提出新的挑战。有效治疗的前提是及时诊断。本文对CRE的特点及诊断方法作一综述。

1 CRE的特点

CRE根据分子结构分为A (A组丝氨酸酶)、B (B组金属酶)、D (D组丝氨酸酶)三大类,各类酶的种类及特点见表 1。A组酶活性部位为丝氨酸,可被3-氨基苯硼酸抑制,常见基因型包括KPC、IMI、GES、NMC等;B组酶的活性部位为金属锌离子,可被EDTA抑制,常见基因型为VIM、IMP、GIM、NDM等;D组酶也为丝氨酸酶,主要基因型为OXA型[11]

表 1 CRE的种类与特点 Table 1 Types and characteristics of CRE
分组 活性部位 抑制作用 常见基因型 常见肠杆菌科菌种 特性
碳青霉烯酶分类 A组丝氨酸酶,编码基因位于质粒上 丝氨酸 AVB、APBA、ATM水解、CLA可能 KPC,IMI,GES,NMC,SME,PER,AME,SMC 阴沟肠杆菌和黏质沙雷菌种由染色体介导的NMC-A、IMI、SME以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC、GES酶 青霉素酶,对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药
B组金属酶,编码基因位于质粒/染色体上 锌离子 EDTA VIM,IMP,GIM,SME,SPM,IND,NDM-1,SIM,DNM 存在于肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌 金属酶,可明显水解亚胺培南,能水解除单环类氨曲南抗菌药物以外的绝大多数β-内酰胺类抗菌药物
D组丝氨酸酶,编码基因位于质粒上 丝氨酸 AVB、CLA可能 OXA (23–27,40,48,49,54,162,181,204) 肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌 苯唑西林(OXA)酶,对碳青霉烯类和广谱头孢菌素水解作用相对较弱,常合并膜通透性下降
AVB: avibactam; APBA: 3′-Aminophenylboronic acid; EDTA: ethylene diamine tetra-acetic acid; ATM: aztreonam; CLA: clavulanic acid.
2 CRE的诊断方法

目前CRE的筛选及诊断方法在不断地发展与完善,从最简单的Kirby-Bauer法(K-B纸片扩散)初筛试验,到碳青霉烯类药物的协同试验(乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和美罗培南、苯硼酸与美罗培南的双纸片抑制法)、改良Hodge试验(Modified Hodge test,MHT)、显色培养基检测等为CRE的筛选试验,而Carba NP试验、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)及测序为CRE的确认试验。每种方法各有其优缺点,可根据当地的主要流行CRE型别和实验条件选择应用。

2.1 K-B初筛试验

K-B初筛试验是最简便易操作的常规项目,不需特殊设备,适合于开展微生物检验的任何实验室。不同的碳青霉烯类抗生素、不同的细菌、不同的耐药机制,K-B法的选择用药不同,如法罗培南目前被认为是检测产KPC酶菌株最好的指示药物,如果细菌产KPC酶,法罗培南的抑菌圈直径往往是6 mm;厄他培南是检测产碳青霉烯酶菌株最敏感的药物选择,产碳青霉烯酶菌通常耐三代头孢菌素,但SME或者IMI基因型对三代头孢菌素敏感;对亚胺培南天然非敏感的细菌(包括摩根摩根菌、变形杆菌属、普罗威登菌属)的CRE筛选则需要参考亚胺培南以外的其他碳青霉烯类抗菌药物。FDA推荐厄他培南、亚胺培南、美罗培南均可用于肠杆菌科的碳青霉烯类耐药的筛选,而亚胺培南扩展到对碳青霉烯类耐药的不动杆菌属和铜绿假单胞菌的筛选,美罗培南再扩展到对碳青霉烯类耐药的嗜水气单胞菌、蜂房哈弗尼亚菌、多杀巴斯德菌、沙门菌属和志贺菌属的筛选。

2.2 纸片筛选及协同试验

美国临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 2017年推荐的改良碳青霉烯类灭活试验(Carbapenem inactivation method,CIM)简便易行,方法是取1 μL接种环的过夜培养纯菌落于2 mL TSB肉汤中,振荡混匀后放入含10 μg美罗培南的无菌纸片,35 ℃孵育4 h,将美罗培南纸片取出,贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上,35 ℃孵育18–24 h,美罗培南抑菌圈直径为6–15 mm或直径为16–18 mm但抑菌圈内有散在菌落,判断碳青霉烯酶阳性[12]。CIM可以检测出肠杆菌科的多种耐药基因包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48和OXA-23,根据基因的不同,与PCR方法检测的结果符合率达83%–100%[13-14]。美国CDC建议的另一种纸片筛选CRE的方法是将待测细菌接种于2 mL的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中,混匀后加入10 μg的厄他培南或5 μg美罗培南纸片,再转种到麦康凯琼脂平皿,生长的乳糖发酵革兰氏阴性杆菌即为CRE,但此方法存在假阴性。如果在此基础上加入3种抗生素(厄他培南、氟康唑、利奈唑胺)筛选可降低假阴性6倍,且节省时间和费用[15]。相比较,纸片协同试验也不失为一种简单、价廉且可靠的检测和鉴别CRE表型的检测方法,可在7 h内快速鉴定KPC、金属酶和OXA-48型碳青霉烯酶,对指导临床救治和感染控制及流行病学监测意义重大。方法是以美罗培南纸片(10 μg)与美罗培南加EDTA (750 μg)纸片抑菌圈直径大于5 mm为金属酶阳性;美罗培南纸片与苯硼酸(400 μg)加美罗培南纸片的抑菌圈直径大于5 mm为KPC酶阳性;替莫西林纸片(30 μg)抑菌圈直径大于10 mm为OXA-48型碳青霉烯酶,特异性及敏感性均达100%,并证明不同的碳青霉烯类药物筛选的敏感性无差异[16-17]。不同的酶抑制剂可以检测某些类别的耐药机制,如有研究用硼酸、克拉维酸、EDTA协同抑制试验筛选178株CRE,56.7%被硼酸抑制,判断为KPC,7.3%同时被硼酸和克拉维酸抑制,为质粒介导的AmpC酶,3.4%被EDTA抑制,为可能金属酶阳性。另有32.6%硼酸、克拉维酸和EDTA抑制试验均阴性,分析可能产生另一类的β-内酰胺酶和/或其他耐药机制[18]。进一步,Pournaras等应用苯硼酸和EDTA与美罗培南的协同试验可直接检测标本中的CRE (KPC和VIM),显示了很好的敏感性(94.8%)和特异性(100%),进一步加快了报告速度[19]

2.3 Hodge试验

CLSI于2015年推荐改良Hodge试验(Modified Hodge test,MHT)筛查CRE,优点是操作简便、价廉,无需特殊的试剂或培养基,仅适用于肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的筛查。应用厄他培南(10 μg)或美罗培南(10 μg)纸片,放在涂有0.5麦氏浊度稀释10倍的ATCC 25922的大肠埃希菌的平皿上,经孵育16–20 h,标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922与待检菌株抑菌环的交汇处大肠埃希菌生长增强,并呈矢状,为该待检菌碳青霉烯酶阳性[20]。MHT检测CRE的敏感性和特异性分别为89.65%和96.77%[21]。但对金属酶的检测敏感性较差,假阳性和假阴性的存在是此方法的弊端。假阳性出现在质粒和染色体酶过度表达的产ESBL (Extended-spectrum β-lactamase)或AmpC酶合并空蛋白缺失的细菌,假阴性出现在某些产NDM (New delhi metallo-lactamase)、OXA和SME的菌株[22-23],通过加入表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚可以提高金属酶等的检测敏感性[24]

2.4 显色培养基

近年来,显色培养基在临床微生物诊断方面得到广泛应用,美国CDC推荐其为CRE的快速初筛方法。显色培养基检测原理是应用合成显色酶底物来特异性地鉴定病原体,使目标致病体生长成有色菌落,而使非目标生物体受抑制(如使用抗生素或其他抑制剂)。显色培养基具有节约成本、缩短检测时间及减少生化与血清学试验的繁琐与花费,使病原体确诊,并提高了检出率。自2008年Samra等首次应用并评价科玛嘉显色培养基筛选KPC,内含有抑制革兰氏阳性菌和CSE的成分,作者比较科玛嘉KPC筛选用麦康凯琼脂培养(贴碳青霉烯类纸片)和PCR方法检测KPC基因,敏感性和特异性分别达到92.7%和95.9%,而PCR方法为100%和98.4%[25]。此后,很多商用显色培养基的试剂不断开发,并通过选择革兰氏阳性菌和酵母菌的抑制剂、抗生素的浓度、碳青霉烯类敏感肠杆菌科的抑制剂等来增强敏感性和特异性。不同的品牌显色培养基敏感性和特异性不同,如Brilliance CRE为78%–82%和60%–66%;chromID Carba为91%–96%和76%–89%;Colorex KPC为56%–88%和70%–76%;TSB加厄他培南为78%–99%和10%–69%[26]。Simner进一步评价以上3种显色培养基的敏感性、特异性和费用,Brilliance CRE、chromID Carba和Colorex KPC的检测敏感性分别为77.6%、89.8%和83.7%,特异性分别为87.1%、95%和92.1%,费用分别为7.56美元、3.25美元和2.79美元,检测时间均为18–24 h[27]。而标本拭子直接筛选的敏感性和特异性通常低于纯培养菌落的检测,肠拭子标本的预富集可以提高敏感性,但增加培养时间无意义[28]。敏感性和特异性较低与产AmpC酶或者ESBL酶影响有关,如果NDM-1对美罗培南的MIC≤2 μg/mL,则显色培养基筛选效果不佳。提示应根据不同的地域不同的碳青霉烯酶主导基因型来选择显色培养基。

2.5 Carba NP试验

CLSI 2015年(M100-S25)抗微生物药物敏感性试验的执行标准推荐Carba NP (CNP)试验,为检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的表型确证方法。该方法是通过细菌提取物对亚胺培南的水解而改变pH值,导致指示剂的颜色变化而判断,特点是快速、简便、低耗,不需要特殊设备,大部分微生物实验室可以开展,并可检测多种碳青霉烯酶。在一项对比研究中,CNP试验阳性检测66株CRE的敏感性和特异性分别为89%和100%,检测的基因包括KPC、NDM、IMP、VIM和SME,只有OXA-48-like 7株均阴性,被推荐为常规的筛选试验[29]。另有研究体现CNP诊断CRE快速、低耗。CNP试验检测106株CRE的敏感性和特异性分别为66.04%和90.48%,MHT的敏感性和特异性分别为54.72%和93.88%,且有48株CRE用MHT检测阴性而CNP检测阳性,甚至厄他培南纸片敏感的菌株CNP检测阳性18例,每个检测仅花费0.08欧元,提示CNP诊断对指导临床早期用药治疗有重要意义[30]。在另一方法的比较研究中,CNP试验鉴定正确率93.9%,而MHT鉴定正确率90.8%,其中OXA-48、IMP、NDM-1各1株MHT检测阴性,而OXA-48、IMP和VIM各1株CNP试验检测阴性。MHT假阳性31株,CNP试验无假阳性。两种方法比较其敏感性无差异,而特异性CNP高于MHT (分别为100%和60.3%,P<0.000 1),且CNP试验26%在15 min内阳性,85%在1 h内阳性;建议MHT不宜单独用于确证CRE的存在[23]。目前CLSI推荐Carba NP试验主要用于流行病学研究或感染控制,对某些分离株如OXA型及染色体编码型菌株的筛选效果不好,但在临床实验室开展对临床选择治疗有重要参考意义。基于同样的原理,类似的试验方法不断被改良和优化,包括Blue Carba试验、Rosco Rapid Carb筛查和Rapidec Carba NP试验,可在临床实验诊断过程中借鉴和评价[31-33]

2.6 PCR及测序

PCR除检测是否产生碳青霉烯酶外,亦可检测碳青霉烯酶基因类型,具有准确、灵敏、特异的优越性;但其缺点为:需要特殊的实验室条件及仪器设备、只对靶基因特异、对未检测的特异性碳青霉烯酶基因可出现假阴性。在方法学观察研究中,PCR的敏感性为97%,明显高于科玛嘉显色培养或者选择性培养,检测时间仅为24 h,较培养法(64–72 h)明显缩短(P<0.000 1),PCR是最好的筛选CRE的方法[34]。同时PCR的优势是可以精确鉴别一类耐药基因的每个基因型,单链DNA非标记探针法双联溶解高分辨溶解扩增blaOXA-48-like基因,可以清晰区分OXA162、OXA244、OXA181、OXA232等多种基因[35]。多重PCR的精确设计进一步克服单纯PCR方法的某些不足。如有作者设计引物包括4种基因,验证100株产碳青霉烯酶的革兰氏阴性菌,PCR检测有一种或多种耐药基因阳性65株,包括KPC15株、NDM-1 59株、VIM 6株,35株阴性。而MHT检测仅70%阳性,双纸片协同法检测65%阳性,所有的纸片协同试验的菌株,均为金属酶及KPC,体现了分子检测的高敏感性及特异性[36]

2.7 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight,MALDI-TOF)

MALDI-TOF是近年来快速发展的微生物鉴定技术,其工作原理是利用激光作为能量来源辐射样品与基质形成的共结晶体,基质分子吸收能量与样品解吸附并使样品电离,经过飞行时间检测器,将不同质荷比(m/z)的离子分开,形成细菌特异性的质谱图。用于细菌鉴定在于不同微生物的指纹图谱各异,指纹图谱中的某些峰(分子质量)具有属、种甚至亚种特异性。MALDI-TOF用于检测多重CRE耐药基因包括VIM、IMP、KPC和NDM,源于碳青霉烯类药物的特征峰的改变,如将试验菌与美罗培南缓冲液混合,经3 h孵育后,将混合液离心取上清检测,代表美罗培南的特征峰消失,判断碳青霉烯酶活性,灵敏性和特异性分别为96.67%和97.87%,除去孵育时间的周转时间为4 h[37],不同的前处理会影响质谱鉴定CRE的速度和效果。不同的碳青霉烯类药物研究的效果不同,MALDI-TOF MS检测以厄他培南水解的阳性率为100%,亚胺培南水解的阳性率为96.6%[38]。多研究显示质谱仪检测碳青霉烯酶与常规方法100%的一致率,包括KPC、VIM和OXA-48基因型,厄他培南孵育3 h,30 min报告结果,是快速又经济的检测方法[39]。也有作者用改良的美罗培南水解试验(MHA)后进行MALDI-TOF检测,5% CO2、37 ℃血琼脂培养过夜的菌株,配置成4.0麦氏单位美罗培南水化物,分为6份(5个低温1个常温)。美罗培南溶解在20 mmol/L Tris-HCl缓冲悬浮液(pH 6.8),终浓度为10 mmol/L,立即试验或在–20 ℃存储2–3 d。2, 5二羟基苯甲酸酸(DHB)前处理,再加基质上样。结果在2 h内完成KPC或VIM碳青霉烯酶,包括NDM、OXA-48和CRE,可以很好地区分产酶与非产酶株,快速且易操作,但不能检测孔蛋白改变和泵出机制[40]。当然,不同碳青霉烯类药物的稳定性、影响因素的多样性、耐药机制的复杂性等均可能影响MALDI-TOF鉴定CRE的效果。

2.8 其他诊断方法

VITEK AST-N202卡检测CRE的敏感性达93%–100%,特异性为89.9%。不足之处在于需要特异性试剂及引物,只对靶基因特异,对未检测的特异酶可能出现假阴性[41]。环介导等温扩增法(LAMP)检测KPC,在68 ℃条件下能特异性地检测KPC,与其他β内酰胺酶无交叉反应,灵敏度达100 CFU,比常规PCR的灵敏度高10倍,检测时间25 min。LAMP还可以直接检测痰液、尿液、粪便和血液标本[42]。Xpert Carba-R检测的耐药基因包括KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48,检测正确率97.6%,但耗材高并需要特殊设备[43]

3 结语

不同的检测方法对不同的耐药基因的检测敏感性不同,没有一个单一理想的方法可以覆盖所有的耐药基因和解决所有问题,大数据的检测方法评估需要不断丰富,实际工作中可根据肠杆菌科的菌种类型、经济条件、实验设备、速度及准确性、当地流行的主要耐药基因等,综合分析选择检测方法,为临床患者的及时诊治及感染控制提供重要保障。

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