生物工程学报  2018, Vol. 34 Issue (7): 1156-1168
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170517
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

孙雪娃, 何超, 方泽民, 肖亚中
Sun Xuewa, He Chao, Fang Zeming, Xiao Yazhong
云芝NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中
Expression and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase from Trametes versicolor in Escherichia coli
生物工程学报, 2018, 34(7): 1156-1168
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(7): 1156-1168
10.13345/j.cjb.170517

文章历史

Received: December 25, 2017
Accepted: February 8, 2018
云芝NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中
孙雪娃1,2,3, 何超1,2,3, 方泽民1,2,3, 肖亚中1,2,3     
1 安徽大学 生命科学学院,安徽 合肥 230601;
2 现代生物制造安徽省重点实验室,安徽 合肥 230601;
3 安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心,安徽 合肥 230601
收稿日期:2017-12-25; 接收日期:2018-02-08; 网络出版时间:2018-06-08
基金项目:国家自然科学基金(Nos. 31370114, 31170056)资助
摘要:云芝Trametes versicolor具有很强的环境有机污染物降解能力,其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)为细胞色素P450酶(Cytochrome P450s,CYPs)提供电子,参与有机污染物的降解过程。序列分析显示,云芝基因组拥有1个潜在CPR序列和多个潜在CYP序列。为深入研究云芝CPR参与细胞降解有机污染物的分子机制,实验进行了云芝CPR在大肠杆菌中异源表达和酶学特性分析。结果表明,经IPTG诱导后,去除预测的N端膜锚定区域(氨基酸残基1–24)的CPR蛋白(CPRΔ24)可在重组菌中实现可溶性表达,且表达蛋白的分子量与理论值(78 kDa)一致。镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后测得其比活性为5.82 U/mg。酶学性质分析显示,重组CPRΔ24的最适温度和pH分别为35 ℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。酶在35 ℃、pH 8.0反应条件下对NADPH的动力学参数Kmkcat分别为19.7 μmol/L、3.31/s;对底物细胞色素c的动力学参数Kmkcat分别为25.9 μmol/L、10.2/s。以上研究为探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制奠定基础。
关键词云芝     NADPH-细胞色素P450还原酶     大肠杆菌     异源表达     酶学特性    
Expression and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase from Trametes versicolor in Escherichia coli
Xuewa Sun1,2,3, Chao He1,2,3, Zeming Fang1,2,3, Yazhong Xiao1,2,3     
1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China;
2 Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, Hefei 230601, Anhui, China;
3 Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230601, Anhui, China
Abstract: Trametes versicolor has strong ability to degrade environmental organic pollutants. NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) of T. versicolor transfers electron to cytochrome P450s (CYPs) and participates in the degradation process of organic pollutants. Sequence analysis showed that the genome of T. versicolor contains 1 potential CPR and multiple potential CYP sequences. To further study the molecular mechanism for the involvement of T. versicolor CPR in the cellular degradation of organic pollutants, a CPR gene from T. versicolor was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. Subsequently, the main properties of the recombinant enzyme were investigated. A truncated CPR protein lacking the predicted membrane anchor region (residues 1-24), named CPRΔ24, was overexpressed as a soluble form in E. coli. The recombinant CPRΔ24 protein showed a molecular weight consistent with the theoretical value of 78 kDa. Recombinant CPRΔ24 was purified using a Ni2+-chelating column followed by size exclusion chromatography. The specific activity of the purified CPRΔ24 was 5.82 U/mg. The CPRΔ24 enzyme displayed the maximum activity at 35 ℃ and pH 8.0. It has different degrees of tolerance against several types of metal ions and organic solvents. The apparent Km and kcat values of recombinant CPRΔ24 for NADPH were 19.7 μmol/L and 3.31/s, respectively, and those for the substrate cytochrome c were 25.9 μmol/L and 10.2/s, respectively, under conditions of 35 ℃ and pH 8.0. The above research provides the basis for exploring the functional mechanism of T. versicolor CPR in the degradation pathway of environmental organic pollutants.
Key words: Trametes versicolor     NADPH-cytochrome P450 reductase     Escherichia coli     heterologous expression     enzymatic properties    

白腐真菌能够降解许多难降解有机污染物,除了其胞外木质素降解酶系,其胞内的细胞色素P450酶系(Cytochrome P450s,CYPs)的降解功能也越来越引起人们的关注。白腐真菌可以依赖CYP酶系脱毒和降解环境中的各种外源化合物[1-2],如多环芳烃、酚类、固醇类和烷烃等化合物。云芝Trametes versicolor是白腐真菌的一种,能降解多种农药[3]、废水中的药物残留[4-5]以及其他环境污染物[6-7],其CYP系统同样参与这些污染物的降解[4, 6-7]

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR)是一类以FMN (黄素单核苷酸)和FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)为辅基的氧化还原酶,是CYP系统中的重要组成部分。CPR从电子供体NADPH获得电子之后传递给CYPs,而后CYPs才能与底物发生氧化还原反应,发挥代谢活性。CPR是CYP的主要电子供体,与CYP的电子传递反应是CYP氧化还原反应的限速步骤[1]。真核细胞的CPR通常锚定在内质网上而其催化活性中心位于胞质一侧。CPR从N端到C端包括N端膜锚定区、FMN结合域、中间连接域、FAD和NADPH结合域。连接域调节两个黄素辅因子正确的空间构象,使其有效传递电子[8-9]。CPR作为双黄素还原酶,对底物提供电子,使其参与氧化还原反应,其底物包括细胞色素c、微粒体CYPs、细胞色素b5氧化还原酶、血红素氧化酶等[10]

基因组序列分析表明,模式菌黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium有149个CYP和1个CPR[2, 11]。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae只有3个CYP和1个CPR[12]。云芝中目前也只鉴定出一个CPR[13],而有多个CYP[14]。一些CYP受到外来化合物的刺激会上调表达[14],表明云芝化学压力响应系统参与异生物的代谢。另一方面,CPR的mRNA水平在有无化学压力的细胞中几乎不变,表明CPR组成型表达,该CPR对CYP的专一性要求可能不高,可以对一系列的CYPs起到提供电子的作用,也可能支持来源于近源物种的CYP电子传递途径。

一个CPR如何驱动那么多CYPs和其他类型的底物参与氧化还原反应是一个重要的研究领域。已有的研究发现,CPR和CYPs主要通过静电力相互作用[15-16]。电子从FMN转移到CYP的血红素的过程中,CPR经历大的构象变化,使FMN辅因子暴露在溶剂中[9, 17]。有研究推测一些膜上的CYPs在一个CPR分子周围集结成簇,CPR在不同CYPs分子间穿梭,与CYPs接触反应很快[18-19]。磷脂双分子层也会影响CPR和CYPs的相互作用,它可能通过和CPR正电荷区域的弱相互作用而调节CPR的还原电势[20]。目前,对CPR和不同CYPs之间相互作用机制的研究还在发展阶段[21]

为了体外研究CPR和各种底物之间的相互作用,以及构建CYP生物反应酶系,需对CPR进行单独表达和纯化。目前已有一些关于CPR在大肠杆菌中异源表达和功能鉴定的报道[22-24]。为利于CPR在大肠杆菌细胞内高效可溶性表达,通常的策略是对其N端膜结合的疏水区域进行序列改造或者截除[22-24]。真核生物的CYP也是膜结合蛋白,通常也利用N端疏水区域替换或去除的策略实现其在大肠杆菌中的可溶且活性形式的表达[25-27]

本研究通过将云芝的全长CPR和去除预测的N端膜锚定区域(第1–24个氨基酸残基)的CPRΔ24分别在大肠杆菌中异源表达,最终获得可溶性表达的CPRΔ24蛋白,对该蛋白进行纯化,并对其酶学特性进行分析,为体外构建CYP生物反应酶系,研究云芝CPR和不同底物之间的相互作用,以及进一步探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制提供指导。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与质粒

宿主菌大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为本实验室保藏。质粒pET-28_TEV为本实验室在pET-28a(+)基础上改造,即将凝血酶(Thrombin)酶切位点替换成烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEV)酶切位点后保藏(图 1)。

图 1 pET-28_TEV质粒克隆/表达区域图 Figure 1 Schematic overview of the cloning/expression region of plasmid of pET-28_TEV.
1.1.2 试剂及仪器

DNA marker 2K Plus Ⅱ、DNA聚合酶、DNA连接酶、限制内切酶均为TaKaRa产品。柱纯化试剂盒Ni-NTA、蛋白浓度测试试剂盒Bradford为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司;其他试剂为国产和进口分析纯试剂。所用仪器:Eppendorf PCR仪(Thermo Fisher Scientific-US)、DYY-6C电泳仪(上海天能科技公司)、水平式电泳槽以及垂直电泳槽(上海天能科技公司)、超声波细胞粉碎机SCIENTZ-IID (宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.3 引物

云芝全长CPR (GenBank Accession No. AB065368.1,2 190 bp,编码全长CPR蛋白730个氨基酸)由生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成,并将酶切位点NdeⅠ、XhoⅠ引入,与pET-22b(+)载体连接,导入感受态细胞E. coli BL21 (DE3)。设计去除N端膜锚定区域的CPRΔ24的上下游引物分别命名为N1、N2,将酶切位点NdeⅠ、XhoⅠ分别引入,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。

表 1 引物序列 Table 1 Primers used for amplification
Primer name Primer sequence (5'–3') Size(bp)
Forward (N1) CGACATATGCGTGATCAGCTGTTTGCAGCAAG 32
Reverse (N2) CGCTCGAGCTAACTCCAAACATCGGTCAGAAAACGA 36
The underlined letters indicate recognition site of specific restriction enzyme.
1.2 方法 1.2.1 获取目的片段

CPRΔ24片段由全长CPR序列经PCR扩增获得。PCR体系为:模板即公司合成的包含全长CPR质粒(94 ng/μL) 1 μL;上下游引物(10 μmol/L)各1 μL;Premix DNA聚合酶(2×) 25 μL;加水补齐至50 μL。PCR反应条件为:98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min 30 s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应完成后以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并对目的产物进行柱纯化回收。

1.2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR N端24个氨基酸残基组成的疏水膜锚定区域通过TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测得到。应用Clustal X2软件对已获得的云芝CPR氨基酸序列与GenBank已登录的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、肉质显丝菌Phanerochaete carnosa、绵腐卧孔菌Postia placenta、干朽菌Serpula lacrymans、新型隐球菌Cryptococcus neoformans、黑曲霉Aspergillus niger、粗糙脉孢霉Neurospora crassa、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe的CPR氨基酸序列进行多序列对比分析。

1.2.3 构建重组表达质粒pET28-CPR和pET28-CPRΔ24

将含有空载质粒pET-28_TEV和公司提供的含有质粒pET22b(+)-CPRE. coli分别摇瓶过夜培养并提取质粒。将所得pET-28_TEV空载质粒、pET22b(+)-CPR质粒和PCR扩增获得的CPRΔ24分别进行NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切条件为37 ℃反应4 h。胶回收相应的基因片段和pET-28_TEV载体。载体与片段按摩尔比约1:17连接获得重组表达质粒pET28-CPR和pET28-CPRΔ24;连接体系为:载体pET-28_TEV (约30 ng/μL) 1 μL,CPRCPRΔ24酶切回收片段(约50 ng/μL) 4 μL,T4 DNA连接酶1 μL,T4 DNA连接酶缓冲液1 μL,加入超纯水补齐至10 μL,16 ℃连接过夜。

1.2.4 重组质粒pET28-CPR和pET28-CPRΔ24的转化和鉴定

将上述获得的重组表达载体pET28-CPR和pET28-CPRΔ24转化至新鲜制备的表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,并涂布于含有终浓度为30 μg/mL卡那霉素的抗性平板,37 ℃恒温隔夜培养,用已灭菌牙签挑取抗性单克隆菌落,15%甘油保菌并将菌株送样至生工生物(上海)股份有限公司测序鉴定。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达

取经验证无误并冷冻保藏pET28-CPR和pET28-CPRΔ24大肠杆菌转化子各50 μL,分别接入含有30 μg/mL卡那霉素的5 mL LB液体培养基中,37 ℃、220 r/min摇床过夜培养后转接到含有30 μg/mL卡那霉素的400 mL LB液体培养基中,继续37 ℃、220 r/min培养至菌体OD600达到0.6–0.8,加入终浓度为0.2 mmol/L的诱导剂IPTG,转入16 ℃、120 r/min摇床培养,并诱导目的蛋白表达16−24 h。4 ℃、8 000 r/min离心收集菌体,各用80 mL结合缓冲液(20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,pH 8.0)重悬菌体并超声破碎,超声功率250 W,开2 s,关3 s,破碎30 min。将菌体破碎液12 000 r/min离心30 min后对上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重组蛋白纯化

取出保存在4 ℃冰箱的镍柱,用酒精重悬填料并在填料完全下沉后将柱内酒精全部放出。先用3个柱体积去离子水冲洗柱子,然后加入约5 mL的电荷缓冲液(0.2 mol/L NiSO4),使Ni2+结合至柱材料上,然后用适量的去离子水洗去多余的Ni2+,最后用至少3个柱体积的结合缓冲液平衡镍柱。待镍柱平衡好后,缓慢上样破碎上清液。上样结束后用2个柱体积的结合缓冲液洗去非特异性结合在柱子上的杂蛋白,接着用20 mmol/L和50 mmol/L的咪唑洗脱吸附在柱子上的杂蛋白,至洗脱液无蛋白(OD280 < 0.05)后,再用200 mmol/L咪唑洗下目的蛋白并收集洗脱液,至目的蛋白完全被洗脱下来(最后一滴洗脱液OD280 < 0.05)。用分子筛预装柱Hiload 16/60 Superdex 200 column (GE healthcare)继续纯化目的蛋白,分子筛所用缓冲液为:20 mmol/L Tris,200 mmol/L NaCl,pH 8.0。

1.2.7 重组酶酶学特性分析

最适作用pH:分别在不同pH缓冲液(pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)下测定酶活性。pH 5.0–8.0 (1/15 mol/L KH2PO4-Na2HPO4)、pH 7.5–9.0 (50 mmol/L Tris-HCl)、pH 9.0–10.0 (100 mmol/L NaHCO3-Na2CO3)。其他条件按方法1.2.8,计算相对酶活。将pH梯度中对应的最高酶活定义为100%。

最适作用温度:分别在不同的温度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)下测定酶活性。其他条件按照方法1.2.8,计算相对酶活。将温度梯度中对应的最高酶活定义为100%。

添加剂(金属离子、添加物)对酶活的影响:在标准反应体系中分别加入金属离子Na+、K+、Ca2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+和EDTA终浓度为5 mmol/L,甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的终浓度为10% (体积比)。对照组无任何添加剂并将其酶活定义为100%,其他条件按方法1.2.8,计算相对酶活。

1.2.8 重组酶比酶活测定

酶活以氧化型细胞色素c作为重组酶的底物。根据最适pH和最适温度以及动力学参数确定饱和底物浓度(见方法1.2.9),定义标准酶反应体系为:1 mL酶活反应体系中加入4 μg的重组酶,氧化型细胞色素c终浓度为100 μmol/L,NADPH终浓度为120 μmol/L,测定在35 ℃、pH 8.0的反应条件下在5 min初始反应阶段产物还原型细胞色素c在550 nm处的吸收值。OD550的增长速率换算成细胞色素c由氧化型向还原型的转变速率。还原型细胞色素c的消光系数为21.1 mmol/(L·cm)。

1.2.9 重组酶动力学参数的表征

测定重组酶对细胞色素c和NADPH的动力学表征参照Warrilow等的方法[23]。在酶反应体系中加入不同浓度(终浓度为0–200 μmol/L)的氧化型细胞色素c和4 μg的重组酶,添加终浓度为120 μmol/L的NADPH启动反应,测定并记录开始与在35 ℃、pH 8.0反应条件下反应5 min后的OD550。在酶反应体系中加入终浓度为100 μmol/L的氧化型细胞色素c和4 μg的重组酶,添加不同浓度(终浓度为0–200 μmol/L)的NADPH启动反应,测定并记录开始与在35 ℃、pH 8.0反应条件下反应5 min后的OD550OD550的增长速率换算成细胞色素c由氧化型向还原型的转变速率。以上数据均重复测定3次。利用Origin Pro 9.0和公式(1)对测定的数据进行拟合,由公式(1)、(2)计算CPRΔ24对细胞色素c和NADPH的VmaxKmkcat值。

(1)
(2)
2 结果与分析 2.1 目的基因获得和重组表达质粒构建

云芝全长CPR (GenBank Accession No. AB065368.1)由公司合成并连接到pET-22b载体上,导入感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。去除由N端24个氨基酸残基组成的膜锚定区域的CPRΔ24序列的获得是以全长基因为模板,经PCR扩增实现。

将云芝去除膜锚定区域的CPRΔ24扩增片段插入到表达载体。经菌落PCR及对重组质粒酶切验证(图 2),显示成功构建重组质粒pET28-CPRΔ24,同时证明重组质粒pET28-CPRΔ24成功导入表达宿主大肠杆菌细胞中。

图 2 重组质粒pET28-CPRΔ24的构建和双酶切鉴定 Figure 2 Construction and restriction enzymes analysis of the pET28-CPRΔ24 recombinant plasmid. M: DNA marker; 1: double digestion of the recombinant plasmid; 2: the pET28-CPRΔ24 recombinant plasmid.
2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR的氨基酸序列和其他物种多序列比对结果如图 3所示。云芝T. versicolor与白腐菌黄孢原毛平革菌P. chrysosporium、肉质显丝菌P. carnosa及褐腐菌绵腐卧孔菌Postia placenta、干朽菌Serpula lacrymans的氨基酸序列同源性较高,分别为83%、81%和81%、78%。与非木腐菌新型隐球菌Cryptococcus neoformans、黑曲霉Aspergillus niger和粗糙脉孢菌Neurospora crassa的同源性分别为57%、45%、42%。与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe的CPR氨基酸序列同源性较低,分别为37%和39%。

图 3 云芝CPR和其他物种CPR的氨基酸序列比对 Figure 3 Amino acid sequence alignment of CPR.
2.3 重组蛋白的诱导表达及分离纯化

SDS-PAGE检测分析结果显示,未见有重组CPR蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中可溶性表达(图 4A),而重组CPRΔ24获得了明显的可溶性表达,且表达蛋白的分子量与理论值(78.35 kDa)吻合(图 4B)。利用重组CPRΔ24的N端His标签,通过镍柱法分离纯化目的蛋白,并利用分子筛层析法进一步分离纯化目的蛋白。重组蛋白的SDS-PAGE检测结果见图 5图 6

图 4 CPR全长(A)及CPRΔ24 (B)在大肠杆菌中重组表达的SDS-PAGE分析 Figure 4 SDS-PAGE analysis of the CPR full length (A) and CPRΔ24 proteins (B). M: protein marker; 1: supernatant; 2: precipitation.
图 5 重组CPRΔ24镍柱纯化的SDS-PAGE分析 Figure 5 SDS-PAGE analysis of recombinant CPRΔ24 purification. The arrow points to the target protein band. M: protein marker; 1: supernatant; 2: flow through; 3: fraction eluted from 200 mmol/L imidazole; 4: the target protein after purified on a Hiload 16/60 Superdex 200 column (GE healthcare).
图 6 重组CPRΔ24分子筛纯化结果图 Figure 6 Purification of recombinant CPRΔ24 on a Hiload 16/60 Superdex 200 column.
2.4 活性测定及酶学特性分析 2.4.1 比酶活

在35 ℃、pH 8.0的反应条件下测定5 min内OD550的变化,拟合重组CPRΔ24反应初速度阶段,定义酶活单位(U)为在35 ℃、pH 8.0的反应条件下每分钟产生1 μmol还原型的细胞色素c所需要的酶量。计算得出重组酶比酶活为5.82 U/mg。

2.4.2 最适pH和最适温度

测定云芝重组CPRΔ24的最适温度为35 ℃。由图 7分析得出温度在25−35 ℃间酶活逐渐升高,当温度大于40 ℃酶活明显降低,表明该酶不适合在温度较高条件下使用。酶的最适pH为8.0,当pH低于6.5或高于9.0后酶活性均低于60%。

图 7 温度(A)和pH (B)对重组CPRΔ24酶活的影响 Figure 7 Effects of (A) and temperature pH (B) on the activity of recombinant CPRΔ24.
2.4.3 金属离子和有机溶剂等对酶活性的影响

经测定(图 8),没有发现对重组CPRΔ24具有明显促进作用的金属离子,其中5 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+对酶活影响较小,Co2+和Ni2+使酶活明显降低,Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活,EDTA使酶活保持在80%以上。同时,加入不同的有机溶剂对酶活都有不同程度的抑制作用。10%的乙醇、异丙醇和丙酮使酶活降低50%多,10%甲醇存在时酶活保持在60%以上。

图 8 添加剂对重组CPRΔ24酶活的影响 Figure 8 Effects of additives on activity of recombinant CPRΔ24.
2.4.4 对底物细胞色素c和NADPH的动力学表征

酶动力学分析表明,重组CPRΔ24对底物细胞色素c的Km为(25.9±2.09) μmol/L,kcat为10.2/s。对NADPH的Km为(19.7±1.33) μmol/L,kcat为3.31/s (图 9)。

图 9 重组CPRΔ24对细胞色素c和NADPH的动力学参数 Figure 9 The enzyme kinetics of recombinant CPRΔ24 for cytochrome c and NADPH.
3 讨论

白腐真菌能利用细胞色素P450酶系代谢一系列内源和外源的化合物。黄孢原毛平革菌P. chrysosporium[11]、肉质显丝菌P. carnosa[28]、灵芝Ganoderma lucidum[29]和毛栓孔菌T. hirsuta[30-31]等真菌已完成基因组测序,已有多个CPR得到鉴定,而关于白腐真菌CPR异源表达和酶学特性的研究还较少。实验成功构建云芝CPRΔ24 (去除N端膜锚定区域)的表达载体pET-CPRΔ24,并实现其在大肠杆菌中的异源表达,利用镍柱亲和纯化和分子筛层析后测得重组CPRΔ24的比酶活为5.82 U/mg,酶的最适温度与最适pH分别为35 ℃和8.0;金属离子Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活,Co2+和Ni2+使酶活明显降低,Na+、K+、Ca2+、Mg2+对酶活影响较小,EDTA使酶活保持在80%以上。同时,加入不同的有机溶剂对酶活都有不同程度的抑制作用。乙醇、异丙醇和丙酮使酶活降低50%以上,而甲醇存在时相对酶活保持在60%以上。重组CPRΔ24对细胞色素c的动力学参数Kmkcat分别为25.9 μmol/L和10.2 /s;对NADPH的动力学参数Kmkcat分别为19.7 μmol/L和3.31/s。

黄孢原毛平革菌重组CPRΔ23 (去除N端膜锚定区域)在25 ℃、pH 7.8的反应条件下对细胞色素c的动力学参数Km为(11.54±0.29) μmol/L,比酶活为14.76 U/mg[23];而云芝重组CPRΔ24在35 ℃、pH 8.0的反应条件下对细胞色素c的动力学参数Km为(25.9±2.09) μmol/L,比酶活为5.82 U/mg。二者在动力学参数和比酶活数值上的差异可能与测试温度和pH条件,以及二者因氨基酸序列上的不同导致的酶学特性的差异相关。

云芝T. versicolor的CPR在大肠杆菌中重组表达、纯化和酶学特性的研究为体外构建CYP酶反应系统,以及体外研究云芝CPR和不同CYPs及其他类型底物之间的相互作用奠定基础。此外,研究者还发现一些不依赖于CPR的CYP电子传递体,如细胞色素b5和NADH依赖的细胞色素b5还原酶[32-34]。本研究也为分析云芝中其他类型的CYP电子传递体和CPR之间的差异和联系提供指导。

基于CPR和CYPs之间的作用关系及其电子供体的特性,CPR已被运用到生物转化及药物代谢等多个研究领域。例如,在酵母细胞中共表达酵母的CPR和担子菌的CYPs从而构建有毒异生物转化的功能筛选系统[35-36];在酵母细胞中构建人源CPR和CYP共表达的体系用作体外药物代谢的筛选[37]等。虽然将某个CPR和一系列的CYP编码蛋白共表达以构建功能筛选体系是对CYPs催化潜力更为系统的评价,但是在研究某个CYP的具体功能和电子传递路径时往往需要将该CYP和特定的CPR分别表达、纯化以进行体外酶活检测[27, 38]。本实验室前期异源表达和纯化了来源于毛栓菌T. hirsuta AH28-2的一个CYP编码蛋白。鉴于云芝T. versicolor的CPR专一性不高,我们正在将该CYP编码蛋白和本研究中的CPR适配,进行体外酚化合物脱毒反应体系的构建。这也为进一步探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制提供帮助。

参考文献
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