生物工程学报  2018, Vol. 34 Issue (4): 537-547
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170309
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

张爽, 陈全姣, 毕玉海, 刘文军, 盛望, 张涛, 李晶
Shuang Zhang, Quanjiao Chen, Yuhai Bi, Wenjun Liu, Wang Sheng, Tao Zhang, Jing Li
2015年湖南部分地区H9N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化
Genetic evolution of HA and NA genes of H9N2 influenza viruses isolated in regions of Hunan Province, China, in 2015
生物工程学报, 2018, 34(4): 537-547
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(4): 537-547
10.13345/j.cjb.170309

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Received: August 8, 2017
Accepted: October 27, 2017
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文
张爽, 陈全姣, 毕玉海, 等. 2015年湖南部分地区H9N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化. 生物工程学报, 2018, 34(4): 537-547
Zhang S, Chen QJ, Bi YH, et al. Genetic evolution of HA and NA genes of H9N2 influenza viruses isolated in regions of Hunan Province, China, in 2015. Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(4): 537-547.
2015年湖南部分地区H9N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化
张爽1,2, 陈全姣3, 毕玉海2, 刘文军2, 盛望1, 张涛3, 李晶2     
1 北京工业大学，北京 100124;
2 中国科学院微生物研究所 病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101;
3 中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉 430071
收稿日期：2017-08-08; 接收日期：2017-10-27
基金项目：中国科学院东南亚生物多样性研究中心青年人才培养计划项目(No. Y4ZK111B01)，国家自然科学基金(No. 31402216)，国家重点研发计划(Nos. 2016YFC1201303，2016YFC1200803)资助
摘要：我国湖南地区因水禽家禽饲养较多且密集，是流感病毒高发省份。为了监测流感病毒的变异情况，采用RT-PCR技术扩增了10株H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因，并进行了序列测定和分析。结果显示，10株分离株均属于欧亚分支中的Y280亚系；HA碱性裂解位点序列均为RSSR↓GLT，为低致病性流感病毒特征；HA受体结合位点234位均为L，具有与人唾液酸α-2, 6受体结合的特性；NA蛋白均在颈部(63–65位)出现氨基酸缺失，这种缺失能增加流感病毒在哺乳动物中的复制能力。提示H9N2亚型毒株近年有毒力和致病力趋于转强的可能性，因此，要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测，密切关注它的重组趋势。
关键词：遗传进化     H9N2亚型流感病毒     HA基因     NA基因    
Genetic evolution of HA and NA genes of H9N2 influenza viruses isolated in regions of Hunan Province, China, in 2015
Zhang Shuang1,2, Chen Quanjiao3, Bi Yuhai2, Liu Wenjun2, Sheng Wang1, Zhang Tao3, Li Jing2     
1 Beijing University of Technology, Beijing 100124, China;
 2 Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
 3 Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, Hubei, China
Received: August 8, 2017; Accepted: October 27, 2017
Supported by: The Southeast Asia Biodiversity Research Institute, Chinese Academy of Sciences (No. Y4ZK111B01), National Natural Science Foundation of China (No. 31402216), National Key Research Program (Nos. 2016YFC1201303, 2016YFC1200803)
Corresponding author: Tao Zhang. Tel/Fax: +86-27-87198167; E-mail: zonetone@msn.com
Jing Li. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lj418@163.com
Abstract: The high prevalence of influenza A virus is identified in Hunan Province because of the high density of poultry farms. To survey the variations of H9N2 subtype avian influenza virus in Hunan province, we analyzed HA and NA genes of 10 virus strains isolated from different areas of Hunan Province. All these strains belong to the Eurasian lineage, Y280-like sub-lineage. The cleavage sites in their HA genes were all RSSR↓GLT, corresponding to the feature of low pathogenic AIV. All strains had an L (Leu) at the site 234 in the HA genes, indicating the ability of binding with the SAα-2, 6 receptor. NA gene stalk deletions at aa 63–65 were also detected from all the isolates, indicating a possibility of increased virus replication in mammals. Our findings suggest that more attention should be paid to the surveillance of H9N2 influenza virus and its direction of reassortment.
Key words: genetic evolution     H9N2 subtype influenza viruses     HA genes     NA genes    

A型流感病毒(AIV)属于正黏病毒科流感病毒属，单股负链包膜RNA病毒。AIV基因组由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等8个基因片段组成。血凝素和神经氨酸酶组成不同的血清亚型，目前已报道有18种HA (H1–H18)亚型和11种NA (N1–N11)亚型[1-2]。AIV根据致病性可分为高致病性流感病毒(HPAI)、低致病性流感病毒(LPAI)和非致病性流感病毒(NPAI)。

A型流感病毒四季均可发病，冬春两季为疾病的暴发期[3]。病毒传播范围较广，可随候鸟的迁徙路线传播；传染源多为染病禽类排泄物污染的水，禽类经消化道或呼吸道感染病毒。段晓东等[4]报道称2013年我国广东省91个活禽市场的流感病毒感染阳性率高达46.05%。随后蒋文明等[5]报道2014–2016年间华东地区某市94.12%的活禽市场中均可检测出禽流感病毒。2014年，Shi等[6]在我国湖南省洞庭湖东部共检测出12种不同血清亚型禽流感病毒，2015年之后病毒的变异情况及畜禽的感染情况未见系统报道。

AIV HA蛋白影响着病毒致病力及宿主特性；致病力强弱与HA蛋白在裂解位点处有无连续的碱性氨基酸插入相关，LPAI无连续的碱性氨基酸插入，不容易被切割，而HPAI为连续插入，因此HPAI表现出更强的致病力[7]。此外，HA基因的受体结合位点决定着宿主特性，当氨基酸序列第226位(H2、H3序列位)或第234位(H9序列位)是谷氨酰胺(Q)时可与唾液酸α-2, 3半乳糖受体结合感染禽类；当是亮氨酸(L)时可与唾液酸α-2, 6半乳糖受体结合，感染哺乳动物[8-9]。同时，HA蛋白糖基化位点的增加或缺失，以及NA蛋白颈部基因的缺失与否，同样是AIV毒力改变的潜在决定因素[10-11]。

为了实时监测湖南省AIV毒株的遗传进化、病毒变异特点及分子特征，探究流感病毒的复制和传播机制以及其毒力和致病机理，我们分析了2015年湖南省部分活禽市场的感染情况，旨在通过对比AIV的HA和NA基因序列，根据新分离AIV毒株的遗传变异情况对流感高发地区的流感防控提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 病毒株

2015年收集于湖南省部分岳阳活禽市场的10份病死禽的组织样品和健康家禽的咽拭子，由中国科学院武汉病毒研究所完成病毒分离、中国科学院微生物研究所完成病毒鉴定与保藏。

1.2 鸡胚

SPF鸡胚(10日龄)购自(北京)梅里亚动物保健有限公司。

1.3 主要试剂

TRIzol LS试剂购自Invitrogen公司；反转录酶、RNase抑制剂、Taq DNA聚合酶、DNA marker DL5000由北京诺派生物科技有限公司惠赠；dNTPs、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、蔗糖购自北京化工厂；青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司；所有引物均由深圳华大基因科技有限公司合成。

1.4 病毒样品的收集、鉴定

将采集的样本进行样本量统计，向样本中加入青霉素、链霉素10 000 IU/ m L，4 ℃作用6 h后，7 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清接种10日龄SPF鸡胚，每枚0.1 mL；增殖72 h后收集鸡胚尿囊液，弃去24 h内死亡鸡胚。按照TRIzol试剂说明书，提取尿囊液中病毒RNA，以提取的RNA为模板，应用M-F和M-R为检测流感病毒不同亚型通用型引物(表 1)进行病毒毒种鉴定[12]。

表 1 检测流感病毒H9及N2亚型特异性引物 Table 1 Primers for detection of M, H9 and N2 genes by RT-PCR
Primers Primer sequences (5′–3′)
M-F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG
M-R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT
H9-F CTYCAACAGARCAYAATGG
H9-R GYCACACTTGTTGTTGTRTC
N2-F TGATGARYGARYTGGGTGT
N2-R TGTCDCCMACAAGYCCTGA
表选项
1.5 HA基因的RT-PCR扩增

以GenBank上收录的A/environment/Changsha/ 481/2014 (H9N2)的HA基因(登录号：KX247907.1)为参考序列，应用Primer Premier 5.0软件设计H9-F、H9-R引物(表 1)，引物用于H9亚型鉴定以及基因扩增。按照TRIzol试剂说明书提取纯化后病毒RNA，逆转录反应体系共25 μL，包括5× MMLV 5 μL、MLV 1 μL、dNTPs 2 μL、RNase 1 μL、随机引物1 μL、ddH2O和病毒RNA模板14 μL。逆转录反应程序为42 ℃ 60 min；80 ℃ 10 min。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物进行测序及序列分析。

1.6 NA基因的RT-PCR扩增

以A/environment/Changsha/481/2014 (H9N2)的NA基因(GenBank登录号：KX247908.1)为参考序列，设计N2-F、N2-R引物(表 1)，引物用于N2亚型鉴定及基因扩增。病毒RNA提取、逆转录及PCR反应方法同1.6。取5 μL PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7 PCR产物序列测定

按照DNA凝胶回收试剂盒和pMD18-T载体说明书，对PCR产物进行纯化、连接、转化、酶切鉴定；将阳性菌落测序。

1.8 HA和NA基因关键氨基酸位点分析

利用ExPASy软件对HA、NA基因进行潜在糖基化位点预测。利用DNAStar中MegAlign软件，将10株分离株与经典株已知的潜在糖基化位点、蛋白分裂位点、颈部缺失位点和受体结合位点进行比对。

1.9 进化树建树及分析

利用Mega 6软件中ClustalW对分离株及2012–2016年新增流行株的HA、NA基因序列进行整理，用DNAStar软件包进行遗传分析，用Neighbor-Joining Tree方法分别建立HA、NA基因遗传进化树。

2 结果与分析 2.1 毒株分离与鉴定

在家禽市场采集197份样本，其中10份样本经鸡胚扩增后鉴定为H9阳性。对其HA和NA基因进行扩增鉴定，分别在638 bp (H9)和495 bp (N2)处出现阳性特异性条带，结果见图 1。确定该10株为H9N2亚型禽流感分离株。根据宿主、采样地及采样日期将10株H9N2亚型分离株进行命名(表 2)。

图 1 H9 (A)和N2 (B)亚型PCR产物电泳结果 Figure 1 Identification of H9 and N2 subtype. M: DL5 000; NC: negative control; PC: positive control; 1‒10: isolated strains: YYFQH661-O, YYGK507-O, YYGK521-P, YYGK522-O, YYGK563-P, YYXS832-O, XKY 46, 0501, 0506, YYFQH689, respectively.
图选项
表 2 阳性分离株代号及简称 Table 2 Codes and abbreviations of isolated viruses
No. Isolated viruses code (H9N2) Abbreviated
1 A/chicken/Hunan/04.14
YYFQH661-O2015		 YYFQH661-O
2 A/chicken/Hunan/04.14
YYGK507-O2015		 YYGK507-O
3 A/chicken/Hunan/04.14
YYGK521-P2015		 YYGK521-P
4 A/chicken/Hunan/04.14
YYGK522-O2015		 YYGK522-O
5 A/chicken/Hunan/04.14
YYGK563-P2015		 YYGK563-P
6 A/chicken/Hunan/04.14
YYXS832-O2015		 YYXS832-O
7 A/chicken/Hunan/XKY
46201504.22		 XKY 46
8 A/chicken/Hunan/YueYang0501201504.14 0501
9 A/chicken/Hunan/YueYang0506201504.14 0506
10 A/chicken/Hunan/YYFQH689-O2015 YYFQH689
表选项
2.2 分离株HA、NA基因核苷酸和氨基酸序列比较

对测序结果拼接校正，得到10组H9N2亚型AIV的HA、NA基因核酸序列，全长分别为1 683 bp和1 401 bp，分别共编码560个和466个氨基酸。10株分离株HA、NA核苷酸同源性为94.7%–100%和95.6%–100%，氨基酸同源性为96.1%–100%和95.9%–100%。与Y280 (A/Duck/Hong Kong/Y280/97)标准毒株核苷酸同源性分别为91.2%–91.4%，氨基酸同源性为91.2%–91.6%。

2.3 HA蛋白潜在糖基化位点及裂解位点分析

对其HA蛋白进行潜在糖基化位点分析，结果显示，10株分离株均具有7–8个潜在糖基化位点，其中8株分离株在220位由苏氨酸(T)变异为异亮氨酸/缬氨酸(I/V)，导致1个潜在糖基化位点丢失。10株分离株与经典株BJ94 (A/chicken/ Beijing/1/1994 KF188294.1)、Y280 (A/Duck/Hong Kong/Y280/97 AF156376.1)、Y439 (A/Duck/Hong Kong/Y439/97 AF156377.1)、Wisconsin66 (A/ turkey/Wisconsin/1/1966 CY130054.1)比对后发现，在315位均发生脯氨酸(P)变异为丝氨酸(S)，从而在313位新增1个潜在糖基化位点NCS。另外，分析发现经典毒株的蛋白分裂位点有3种模式：RSSR↓GLT (Y280、BJ94)、VSSR↓GLT (Wisconsin66)、ASNR↓GLT (Y439)。10株分离株均为RSSR↓GLT，与经典毒株Y280、BJ94一致，符合低致病性流感的特征(表 3)。

表 3 H9N2亚型AIV分离株HA潜在糖基化位点及裂解位点比较 Table 3 Potential glycosylation sites and cleavage sites of HA of H9N2 AIV isolates
Viruses Potential glycosylation sites (HA) Cleavage sites
29 141 218 298 305 313 492 551
NST NVS NRT NTT NVS NCS NGT NGS PSRSSR↓GLT
BJ94 + + + + + – + + PARSSR↓GLT
Y280 + + + + + – + + PARSSR↓GLT
Y439 + NVT + + + – + + PAASNR↓GLT
Wisconsin66 + + + + NIS – + + PAVSSR↓GLT
YYFQH661-O + + + + + + + + +
YYGK507-O + + – + + + + + +
YYGK521-P + + – + + + + + +
YYGK522-O + + – + + + + + +
YYGK563-P + + – + + + + + +
YYXS832-O + + NET + + + + + +
XKY 46 + + – + + + + + +
0501 + + – + + + + + +
0506 + + – + + + + + +
YYFQH689 + + NET + + + + + +
Annotation: “+” unchanged; “–” deleted.
表选项
2.4 NA蛋白潜在糖基化位点分析

对其NA蛋白进行潜在糖基化位点分析，结果显示，10株分离株均具有7个潜在糖基化位点。10株分离株与经典株BJ94 (A/chicken/Beijing/ 1/1994 KF188296.1)、Y280 (A/Duck/Hong Kong/ Y280/97 AF156394.1)、Y439 (A/Duck/Hong Kong/ Y439/97 AF156395.1)、Wisconsin66 (A/turkey/ Wisconsin/1/1966 CY130056.1)比对后发现，在45位发生脯氨酸(P)变异为丝氨酸(S)，368位、369位发生赖氨酸/谷氨酸(K/E)变异为天冬酰胺/谷氨酸(N/G)，从而在44位和368位各新增1个潜在糖基化位点NSS和NGS；在402位由天冬酰胺(N)变异为天冬氨酸(D)导致1个潜在糖基化位点丢失(表 4)。

表 4 H9N2亚型AIV分离株NA潜在糖基化位点比较 Table 4 Potential glycosylation sites of NA of H9N2 AIV isolates
Viruses Potential glycosylation sites (NA)
44 61 69 86 146 200 234 306 368 402
NSS NIT NST NWS NGT NAT NGT NMT NGS NWS
BJ94 – + + + + + + – – +
Y280 – – + + + + + – – +
Y439 – + NNT + + + + + – +
Wisconsin66 – + NNI + + + + – – +
YYGK507-O + – + + + + + – + –
YYGK521-P + – + + + + + – + –
YYGK522-O + – + + + + + – + –
YYGK563-P + – + + + + + – + –
YYXS832-O + – + + + + + – + –
XKY 46 + – + + + + + – + –
0501 + – + + + + + – + –
0506 + – + + + + + – + –
YYFQH689 + – + + + + + – + –
Annotation: “+” unchanged; “–” deleted.
表选项
2.5 HA受体结合位点分析

按照H9序列位，H9N2亚型HA基因的受体结合位点由109、146–150、161、163、191、198、202、203、232–237氨基酸构成袋状结构。10株分离株受体结合位点分析表明，受体结合位点的变化主要发生在198位，参照经典毒株突变类型有4种，即缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)，其中分离株YYFQH661-O为丙氨酸(A)，其余分离株为苏氨酸(T)。受体结合位点右侧臂(146–150)主要氨基酸组成模式为GTSKA，10株分离株和经典株均为此模式；左侧臂(232–237)有两种组成模式NGQQGR (BJ94、Y439、Wisconsin66)和NGLQGR (Y280)，10株分离株与Y280相同，均为NGLQGR。H9第234位(H3中226位)氨基酸残基决定宿主结合受体的类型，10株分离株第234位均为赖氨酸(L)，具有与哺乳动物SA α, 2-6受体结合的特性(表 5)。

表 5 H9N2亚型AIV分离株HA受体结合位点比较 Table 5 Receptor binding site of HA of H9N2 AIV isolates
Viruses Receptor binding sites (HA) Left edge Right edge
109 161 163 191 198 202 203 232–237 146–150
Y W T N T L Y NGLMGR GTSKA
BJ94 + + + + V + + NGQQGR +
Y280 + + + + + + + + +
Y439 + + + + E + + NGQQGR +
Wisconsin66 + + + + E + + NDQQGR +
YYFQH661-O + + + + A + + + +
YYGK507-O + + + + + + + + +
YYGK521-P + + + + + + + + +
YYGK522-O + + + + + + + + +
YYGK563-P + + + + + + + + +
YYXS832-O + + + + + + + + +
XKY 46 + + + + + + + + +
0501 + + + + + + + + +
0506 + + + + + + + + +
YYFQH689 + + + + + + + + +
Annotation: “+” unchanged; “–” deleted.
表选项
2.6 NA蛋白红细胞结合位点分析

细胞吸附位点分析结果得出10株分离株均存在颈部缺失的现象；红细胞结合位点分别位于367–372位、400–403位和432–433位。在367–372位，分离株均为KNGSRS模式，与BJ94、Y280比对后显示，在368位、369位分别由赖氨酸/谷氨酸(K/E)变异为天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)变异为甘氨酸(G)；在402位由天冬酰胺(N)变异为天冬氨酸(D)，9株分离株为SDDW模式，1株分离株为SADW模式；在431–433位经典毒株和分离毒株均为PQE，未发生改变(表 6)。

表 6 H9N2亚型AIV分离株NA红细胞结合位点比较 Table 6 Erythrocyte adsorption sites of NA of H9N2 AIV isolates
Viruses Stalk deletion sites Erythrocyte adsorption sites
63–65 367–372 400–403 431–433
TEI KNGSRS SDDW PQE
BJ94 + KKDSRS SDNW +
Y280 – KEDSRS SDNW +
Y439 – SKDSRS NNNW +
Wisconsin66 + SKDSRS SNNW +
YYFQH661-O – + + +
YYGK507-O – + + +
YYGK521-P – + SADW +
YYGK522-O – + + +
YYGK563-P – + + +
YYXS832-O – + + +
XKY 46 – + + +
0501 – + + +
0506 – + + +
YYFQH689 – + + +
Annotation: “+” unchanged; “–” deleted.
表选项
2.7 HA、NA基因进化树分析

H9N2亚型AIV分为欧亚分支和北美分支，欧亚分支代表毒株为BJ94 (A/chicken/Beijing/ 1/1994)、Y280 (A/Duck/Hong Kong/Y280/97)，北美分支代表毒株为Wisconsin66 (A/turkey/Wisconsin/1/1966)、Y439 (A/Duck/Hong Kong/ Y439/97)。从NCBI中获得已报道的20株H9N2亚型AIV HA、NA基因作为参考序列。进化分析结果显示，本研究中的10株病离株均属于欧亚谱系的Y280亚系(图 2、3)。与2012–2016年流行的分离毒株亲缘关系较近，主要分布在我国华东(江苏、浙江、江西、日照)、华南(广东、中山、东莞)、华中(湖北、湖南)等省市以及日本等地。

图 2 H9N2亚型AIV分离株HA基因遗传进化树 Figure 2 HA genes of H9N2 subtype AIV phylogenetic tree. ●: isolates; ▲: typical strain; empty: reference strain.
图选项
图 3 H9N2亚型AIV分离株NA基因遗传进化树 Figure 3 NA genes of H9N2 subtype AIV phylogenetic tree. ●: isolates; ▲: typical strain; empty: reference strain.
图选项
3 讨论

H9N2亚型AIV属于低致病性流感病毒，但其危害不能忽视。自1994年首次从鸡群中分离到H9N2亚型AIV以来[13]，H9N2亚型AIV在我国各个地区广泛流行，对家禽感染率较高。H9N2亚型AIV抗体在禽类及人、猪、犬等哺乳动物体内均可检测出[14-16]，表明H9N2亚型流感病毒在动物中存在大规模隐性感染流行，具有引发一系列公共卫生问题的潜在可能。

当AIV入侵宿主时，HA蛋白在裂解位点处会被细胞内蛋白酶裂解为HA1和HA2，HA1主要促进病毒与宿主的受体结合，HA2主要促进病毒包膜和宿主细胞膜的融合[17]。低致病性AIV HA裂解位点区的氨基酸主要模式为PARSSR↓GLT，其裂解位点通常只有一个碱性氨基酸(精氨酸/赖氨酸) (R/K)插入，而识别并裂解这种结构的精氨酸蛋白酶分布在呼吸道和消化道上皮细胞内，因此感染时病毒仅在呼吸道和消化道内增殖，表现为轻微的感染症状。而高致病性AIV的HA裂解位点区有多个碱性氨基酸插入(KKKKR↓GLT和KRRRRR↓GLT[18])，容易被体内大多细胞内的蛋白酶识别并裂解，在机体内大面积增殖，具有广泛的嗜性，导致机体发病甚至死亡[19]。本研究中的10株H9N2亚型AIV的HA基因裂解位点均为PSRSSR↓GLT，符合低致病性禽流感的特征。然而，由于丝氨酸与精氨酸的核苷酸组成仅相差一个碱基：AGU (AGC)和AGA (AGG)，存在裂解位点附近突变成连续的碱性氨基酸模式的可能性，即存在由低致病AIV变异为高致病AIV的风险。

禽流感病毒的HA蛋白的糖基化位点一般有5–11个不等，而糖基化位点的位置和数量是决定禽流感病毒抗原性、受体亲和毒力的重要因素[20]。如果在HA裂解位点附近增加糖基化位点，则会阻止蛋白酶裂解和病毒的感染[21]。本研究的分离株HA基因均存在糖基化位点增加或丢失的现象。NA蛋白的作用是切断HA与宿主细胞之间的链接，促使子代病毒从宿主细胞中释放，防止自身凝集。NA颈部缺失将会导致病毒复制力增强和改变宿主感染力[22]。本研究的分离株NA均存在63–65位颈部缺失，缺失导致分离株潜在糖基化位点新增与缺失。

近年来，在已免疫的鸡群中常会检测出H9N2抗体，研究表明H9N2亚型AIV进入大型的封闭性鸡群后，为逃避疫苗和宿主的选择压力，内部基因不断地变异，产生新的变异株，以便于病毒循环传播[23-24]。本研究的10株H9N2亚型AIV毒株采集自活禽市场，分离株与经典毒株的同源性较低、亲缘较远，而与2012–2016年流行的分离毒株同源性较高、亲缘较近。这表明HA和NA基因在不断进化，随时间的推移突变不断积累。在目前流行的H9N2亚型AIV中，有报道称某些分离株已具备H2N2、H3N2的病毒特性，即其HA受体结合位点的第226位(H9序列位为234位)为亮氨酸(L)，这种结构易与哺乳动物SA α-2, 6 Gal受体结合[8]，使人类及其他哺乳动物感染。本研究的10株分离毒株HA基因受体结合位点234位均有由谷氨酰胺(Q)变异为亮氨酸(L)，增强了对哺乳动物的潜在感染能力。综上本文中新分离的10株H9N2病毒均存在HA蛋白234位氨基酸变异为亮氨酸(L)、NA蛋白颈部存在缺失的现象和存在HA裂解位点附近突变成连续的碱性氨基酸模式的可能性。然而这些位点的变化能否导致病毒毒力增加和致病性的改变，即强弱毒株之间(HPAI和LPAI)的差别是由以上单因素决定的还是多种因素分层次共同决定的，将是我们后续研究的重点。

根据报道，H9N2亚型AIV不同地域的毒株间极易发生基因重组现象[25]，加之在我国对禽流感免疫强度的高压下，AIV基因组的突变重组率和抗原性变异率也逐年升高，这有可能导致AIV流行毒株不断增加，AIV转变为免疫耐受毒株，从低致病性转变高致病性的毒株[26-27]。鉴于禽流感病毒毒力不断转强的趋势，我们对禽流感的防疫刻不容缓。目前我国很多农村地区仍采用鸡群散养的方式，且养殖户对于禽流感防治理念薄弱，加之交易方式仍以活禽市场为主，导致禽流感发病率相对较高，通过转变饲养管理模式和关闭活禽交易市场来防范禽流感的传播将是一个漫长的过程。因此在转型期间，应通过强化对饲养环境的消毒、严格免疫程序、加强病毒的监测和流行病学调查等方式来降低流感病毒发病率。

综上所述，H9N2亚型AIV的毒力和致病力等生物学特性有趋于转强的可能性，我们必须重视并加强预警，为养禽业发展以及人类的公共卫生安全做好基础保障。

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