β-淀粉酶(β-amylase，EC 3.2.1.2)，又称淀粉β-1, 4-麦芽糖苷酶，是一种外切型淀粉酶，能够从淀粉的非还原末端依次水解相隔的α-1, 4-葡萄糖苷键生成麦芽糖。在大麦、甘薯、玉米、小麦和大豆等高等植物中都有着较丰富的β-淀粉酶，其在酿造行业及食品工业中有很大的应用价值。例如，啤酒酿造行业利用麦芽中的β-淀粉酶直接糖化，白酒工业中用作糖化剂；在食品工业中主要用于生产高麦芽糖浆、麦芽糖醇和饴糖等。自1974年Higashihara等^[1]首次发现了巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium 胞外含有β-淀粉酶以来，又陆续发现其他几种能产生该酶的微生物，包括蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus ^[2-3]、环状芽孢杆菌 Bacillus circulans ^[4]、多粘芽孢杆菌 Bacillus polymyxa ^[5]、热厌氧杆菌属 Thermoanaerobacterium 和高温放线菌 Thermeoactinomyces sp.^[6]等。

由于植物来源的β-淀粉酶提取、纯化过程较为复杂，成本较贵，相比而言微生物来源的β-淀粉酶具有生产操作简单、适合大规模工业化生产的优点。但是现已报道的微生物来源的β-淀粉酶大多耐热性差，且比酶活不高，不利于其工业化应用。因此筛选出高热稳定性的微生物β-淀粉酶对其在淀粉糖工业中的应用有着十分重要的意义。

易错PCR属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制来为酶基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造，并定向筛选研究进化酶的酶学性质。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。

目前国内外多数专家学者使用体外分子进化技术研究了多种酶制剂^[7]，诸如脂肪酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，其酶学性质都得到了一定的改善。对于微生物来源β-淀粉酶的研究，目前主要是围绕不同宿主的克隆表达、酶学定性^[8]，而针对其酶学性质的分子改造显得较少，在定向进化提高其热稳定性方面，尚未见相关文献报道。β-淀粉酶作为一种重要的工业用酶，广泛应用于淀粉糖、食品及医药等生产领域。例如，与麦芽糖淀粉酶、普鲁兰酶等复配制备超高纯度麦芽糖浆，生产高附加值的海藻糖、麦芽酮糖等。然而其热稳定性差，不利于酶的复配转化，具有容易染菌、反应液粘度高等缺点。本研究通过易错PCR技术对比酶活较高的弯曲芽孢杆菌来源的β-淀粉酶进行体外分子定向进化，通过LB琼脂淀粉板初筛、96孔板DNS法测酶活等方法，高通量筛选热稳定性提高的突变体，以期为其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

Escherichia coli JM109、E. coli BL21(DE3)由本实验室保存；载体pET-24a(+)和pMD18-T购于大连宝生物公司。野生型β-淀粉酶基因来源Bacillus flexus CCTCC 2015368 (bfa)，现已保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

1.1.2 培养基

LB液体培养基：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB固体培养基：在LB液体培养基的基础配方上，添加1.0%–2.0% (W/V)的琼脂。

TB培养基：酵母粉24.0 g/L，甘油5.0 g/L，胰蛋白胨12.0 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43 g/L，KH₂PO₄ 2.31 g/L。

SOB培养基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，MgCl₂ 0.952 g/L，NaCl 0.5 g/L，KCl 0.186 g/L。

LB琼脂淀粉板：在LB液体培养基的基础上添加可溶性淀粉1 g/L，用于突变体的初步筛选。

1.1.3 试剂

rTaq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Primer Star^TM HS DNA聚合酶、DL-2000和DL-10000 DNA Marker均购于TaKaRa有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR纯化试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；中分子量标准蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司(上海)；卡那霉素(Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均购自上海生工生物工程有限公司；分子级的胰蛋白胨和酵母粉购自英国Oxoid公司；所有质粒测序均由上海睿迪生物技术有限公司提供支持；无特殊说明，其他试剂均属于国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 突变体文库的构建和易错PCR技术

来源于Bacillus flexus CCTCC 2015368 (bfa)的β-淀粉酶基因用作构建突变体文库的模板，并设计上游引物(5′-AA =CCATGGCGGTAAATGGACA GTCGTT-3′)和下游引物(5′-AACTCGAGTTACCA ATTATT、CGTATACGTTG-3′)，并分别引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点(下划线部分)。最适反应缓冲体系(50 µL)为：2 mmol/L MgCl₂，0.1 mmol/L MnCl₂，0.2 mmol/L dNTPs，DNA模板为50 ng，5 µL 10×缓冲液Mg²⁺(-)和rTaq DNA聚合酶为5 U，再加入ddH₂O补足至50 µL。PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，并于4 ℃下保温。

将PCR产物用1% (W/V)的琼脂糖凝胶电泳验证，用PCR纯化试剂盒进行胶回收。纯化后的bfa基因和载体pMD-18T连接转化大肠杆菌JM109感受态细胞。用NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶消化质粒bfa-pMD-18T，获得易错bfa基因，然后连接到载体pET24a(+)，得到的质粒命名为pET-bfa。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达宿主中，涂布于LB抗性平板(Kan，30 µg/mL)，构建突变体文库。

1.2.2 突变体文库的筛选

使用高通量筛选平台(Molecular Devices，Qpix 2)从LB抗性平板(Kan)上挑选易错突变体BFA，将单克隆一一对应地接种到含有600 µL新鲜LB培养基(Kan，30 µg/mL)的96深孔板中。重组菌在37 ℃、900 r/min下恒温振荡摇床中培养8–10 h，相同条件下转接50 µL种子培养基到含有600 µL新鲜TB培养基的96孔板中培养2 h，然后加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG诱导表达重组酶^[9]。重组菌在25 ℃下诱导表达48 h后，将发酵液在4 000 r/min、4 ℃下离心20 min，取上清200 µL于96浅孔板中，这些96浅孔板中的酶液将用于初筛的酶活分析。本研究设计了一个LB琼脂淀粉板用于突变体BFA的初筛分析，通过使用高通量筛选系统的gridding程序，将突变体BFA的发酵上清一一转接到琼脂淀粉板并于37 ℃下过夜培养。随后用碘液0.03% (W/V)涂布琼脂淀粉板，发现有β-淀粉酶活力的地方会产生透明圈，初筛的标准是根据透明圈的大小来判断的。选择突变体BFA酶活高于或等于野生型的，然后接种于96深孔板进一步筛选。最后通过96-孔板DNS法定量测定突变体BFA的酶活，选择出酶活大于或者等于野生型的突变体用于复筛分析。

1.2.3 野生型和突变体β-淀粉酶的诱导表达和分离纯化

将带有重组质粒pET-bfa的大肠杆菌在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养LB种子(Kan，30 µg/mL) 8–10 h，然后吸取种子培养基2.5 mL接种到50 mL的TB发酵培养基中。在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养2 h后加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG，最后转移摇瓶至25 ℃、200 r/min继续培养48 h^[10]。发酵液于8 000 r/min、4 ℃下离心20 min收集上清液。向上清液中加入研磨之后的硫酸铵至终浓度为45% (W/V)，混合物于4 ℃下过夜培养并用磁力搅拌器不断搅拌，确保沉淀完全。然后将混合物在4 ℃、8 000 r/min离心20 min收集沉淀，并用20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.5)悬浮，过夜透析。样品加载到用20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡的Superdex^TM 200 10/300 GL凝胶柱上，在0.5 mL/min的流速下使用上述缓冲液进行洗脱、收集纯化样品。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，12%聚丙烯酰胺)检测目的蛋白的纯度和分子量^[11]。

1.2.4 酶活力的测定

β-淀粉酶活力分析是通过测定水解淀粉所释放的还原糖的量。反应体系的混合物包括：0.5 mL 2% (W/V)的可溶性淀粉，0.4 mL 50 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)，并将酶液稀释成适宜的浓度添加至最后体积为1 mL。在55 ℃下反应10 min之后，向1 mL的混合体系加入1 mL 3, 5-二硝基水杨酸(DNS)终止反应。混合物在沸水中煮沸5 min发生显色后立即于冰浴上冷却，然后补加去离子水至最后体积为12 mL，最后在540 nm下检测上述溶液的吸光值；并以相同条件下缓冲液的测定作为空白对照。

上述条件下，每分钟生成1 µmol/L麦芽糖所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。

1.2.5 野生型和突变体β-淀粉酶的动力学参数

在55 ℃、pH 7.0的条件下以不同浓度的可溶性淀粉作为底物(1–30 mg/mL)，通过上述DNS法测定纯化后的野生型和突变体酶的动力学参数。使用GraphPad Prism 6.0软件将获得的数据拟合到Michaelis-Menten方程，得出K_m和k_cat值。计算野生型和突变体的k_cat/K_m，并比较结果。

1.2.6 野生型和突变体β-淀粉酶最适温度及热稳定性的分析

纯化后的酶液分别在不同的温度范围内(30–70 ℃)测定β-淀粉酶活力，以最高的酶活力为100%，从而确定出野生型和突变体β-淀粉酶的最适温度。

在55 ℃下将纯化后的β-淀粉酶保温在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)中，于不同的时间范围内(10–70 min)分别取出样品并冰浴10 min，同时在不同温度下保温10 min，测定酶活力丧失50%时的温度，即酶的半失活温度T₅₀。按照上述的DNS法测定残留酶活，并以未处理的酶活为100%，用作测定野生型和突变体β-淀粉酶的半衰期。

1.2.7 野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH分析

在pH 4.0–9.0的柠檬酸缓冲液中分别将两种酶稀释一定倍数，以上述分析的最适温度为条件测定β-淀粉酶酶活力，以最高的酶活力为100%，从而确定出野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH。

1.2.8 野生型和突变体的三维结构分析

使用SWISS-MODEL数据(http://www.expasy.org/swissmod/)生成野生型和突变体BFA的三维结构模型，并且以同源性最高的蜡状芽孢杆菌β-淀粉酶(1j10.1.A，PDB)为模板^[12-13]。借助PyMol (http://www.pymol.org)软件分析所有的蛋白质结构模型和图形特征。

2 结果与分析 2.1 突变体文库的筛选

重组菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-bfa在大肠杆菌中表达、发酵，对野生型β-淀粉酶进行初始酶学性质研究。然后，以重组质粒为模板，通过设计引物进行易错PCR方法的高通量筛选，表达宿主为操作简单、方便的大肠杆菌。大约有6 000个转化子的突变体文库被用来筛选热稳定性提高的突变体β-淀粉酶，阳性突变率估算为60%。β-淀粉酶水解活力的大小可以用透明圈定性分析，采用琼脂淀粉板显色初筛得到一部分透明圈比对照大的突变体^[14]。

进一步将这些突变体于55 ℃保温40 min，并在96-孔板和具塞试管中分别测定残留酶活。通过大量的实验结果和数据分析得出，初筛有时候获得透明圈比较大的突变体，经过复筛测酶活发现并不是很高甚至和对照差不多；但是，复筛得出热稳定性显著提高的突变体，后续摇瓶验证也会相应提高。经过一系列的初步研究验证，与野生型β-淀粉酶相比，有一株突变体的热稳定性显著提高。接下来把该突变体的质粒抽提出来送测序，测序结果分析出突变体BFA只发生了一个氨基酸的替换，将476位天冬氨酸突变成了天冬酰胺(Asp476Asn)^[15]。

2.2 野生型和突变体β-淀粉酶的诱导表达和分离纯化

重组β-淀粉酶用0.05 mmol/L IPTG诱导表达于宿主E. coli BL21(DE3)中，摇瓶发酵48 h之后收集酶液。为了进一步研究野生型和热稳定性提高突变体β-淀粉酶的酶学性质，首先对重组酶进行(NH₄)₂SO₄沉淀，透析脱盐初步纯化酶蛋白，然后通过柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(20 mmol/L，pH 6.5)平衡的Superdex^TM 200 10/300 GL凝胶柱浓缩、纯化(表 1和图 1)，并使用Bradford法以牛血清蛋白为标准测定蛋白浓度^[16]。从表 2可知，突变体D476N的比活力为2 512 U/mg，比野生酶降低了18.76%。

2.3 野生型和突变体D476N的酶学性质分析 2.3.1 野生型和突变体β-淀粉酶的动力学参数

在55 ℃下，使用不同浓度的可溶性淀粉为底物(1–30 mg/mL)，分别测定野生型和突变体D476N的动力学参数(表 2)。突变体D476N的K_m值为97.98 µmol/L，是野生型的1.14倍。突变体D476N的k_cat值为2 273.12 s^–1，比野生型下降了18.97%；突变体k_cat/K_m值减少为野生型的71.01%。

2.3.2 最适温度及温度稳定性

突变体D476N和野生型β-淀粉酶的最适温度和热稳定性见图 2和图 3。

从图 2可以得知，野生型和突变体D476N β-淀粉酶的最适温度均为55 ℃；在30–55 ℃的温度范围内，β-淀粉酶的相对活力没有明显变化；值得注意的是，当温度升高到60 ℃和65 ℃时，突变体D476N能够保留最初酶活的75%和44%，而野生型仅保留其酶活的37%和23%。

不同温度下保温10 min，测定酶活力丧失50%时的温度，即酶的半失活温度T₅₀。实验结果表明，突变体D476N的半失活温度T₅₀值为62 ℃，与野生型T₅₀值58 ℃相比提高了4 ℃。在最适温度55 ℃的条件下，通过测定不同时间点残留酶活来确定突变体D476N的热稳定性^[17-18]，并与野生型相比较(图 3)。从图 3可知，突变体D476N在55 ℃下的半衰期为35 min，而野生型的半衰期只有18 min。

2.3.3 最适pH

突变体D476N和野生型β-淀粉酶的最适pH见图 4。

由图 4可见，野生型的最适pH为7.0，突变体D476N的最适pH为6.5；在pH 5.5–8.0的范围内，β-淀粉酶的相对酶活力均能保持在70%以上。目前β-淀粉酶的工业化应用主要是和其他酸性淀粉酶进行复配使用，突变体D476N的最适pH比野生型降低了0.5个单位，提高了重组酶酸性耐受性，更加有利于酶的催化反应^[19]。

3 讨论

本研究基于易错PCR技术的定向进化策略筛选热稳定性提高的突变体BFA，经过一系列的初筛、复筛最终获得了一株热稳定性提高的突变体D476N。突变体E. coli BL21(DE3)/pET-D476N表达在宿主E. coli BL21(DE3)中，经过硫酸铵沉淀、浓缩、纯化^[20]突变体重组β-淀粉酶；酶学性质和动力学参数测定发现，突变体D476N与野生型相比对底物的亲和性无明显变化，而对可溶性淀粉的催化活性有少许降低。突变体D476N在高温条件下能够保留较高的酶活，表明突变体D476N的耐热性比野生型有明显提高^[21-22]。

为了阐明突变体D476N热稳定性提高的机理，对野生型和突变体D476N使用SWISSMODEL程序同源建模。以同源性最高的蜡状芽孢杆菌晶体结构为模板(1j10.1A，PDB)模拟得到野生型和突变体D476N的三维结构。最近有研究发现，蛋白质表面的loop区域对蛋白质的稳定性有重要作用，如淀粉液化芽胞杆菌来源的突变体葡聚糖酶^[23]，通过定向进化-易错PCR筛选得到热稳定性显著提高的突变株，其共发生了7个氨基酸的取代，有5个位于蛋白质的loop区域。使用PyMol软件显示出生成的突变体D476N的结构模型和突变点的位置，发现突变后的氨基酸残基Asn476也位于蛋白质的表面loop上(图 5)。

MOE是一款基于分子动力学模拟和蛋白设计的软件，并能够计算蛋白质和小分子配体的能量，与小分子药物设计和蛋白质工程等领域紧密相关。本研究中，首先利用MOE软件将同源建模模拟得到的野生型和突变体D476N的三维PDB结构能量最小化，然后分别计算出野生型和突变体D476N的分子自由能^[24] (ΔG)，软件预测结果表明野生型β-淀粉酶和突变体D476N的分子自由能分别为118.20 kcal/mol和106.01 kcal/mol。根据蛋白质分子自由能(ΔG)和热稳定性呈负相关的关系，可以得知，野生型β-淀粉酶将476位的天冬氨酸替代为天冬酰胺后，导致β-淀粉酶的分子自由能由118.20降低为106.01 kcal/mol，下降了10.3%。这一结果为蛋白质热稳定性提高提供了有力的依据，同时也表明了蛋白质表面loop区域的氨基酸突变对稳定性的影响起到了显著的作用。