2018, Vol. 34中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 吴锡华, 李哲敏, 刘会, 王鹏, 王丽, 方雪, 孙小雯, 倪文枫, 杨强, 郑之明, 赵根海
- Wu Xihua, Li Zhemin, Liu Hui, Wang Peng, Wang Li, Fang Xue, Sun Xiaowen, Ni Wenfeng, Yang Qiang, Zheng Zhiming, Zhao Genhai
- 毕赤酵母Gpn12异戊烯基转移酶NovQ催化合成MK-3
- Synthesis of vitamin K2 by isopentenyl transferase NovA in Pichia pastoris Gpn12
- 生物工程学报, 2018, 34(1): 140-148
- Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(1): 140-148
- 10.13345/j.cjb.170158
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文章历史
- Received: April 13, 2017
- Accepted: May 31, 2017
引用本文
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2 中国科学技术大学 研究生院，安徽 合肥 230027
2 Graduate School, University of Science & Technology China, Hefei 230027, Anhui, China
维生素K(Vitamin K，VK)是一族含有共同化学结构2-甲基-1, 4-萘醌环的物质统称。根据萘醌环3’位置连接侧链化学结构的不同又分为不同的类别。天然存在的维生素K包括K1 (Phylloquinone，PK)和K2 (Menaquinone，MK)，后又人工合成了K3等。在动物体内，维生素K1和维生素K3只有转化为维生素K2才具有生物活性[1-2]。图 1显示了维生素K1、K2及K3的化学结构。维生素K2依据侧链异戊烯单元个数n的不同[3-5]，可分为14种，通常以MK-n表示，例如，n为3时称之为MK-3。
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| 图 1 维生素K1、K2和K3 (从左到右)的化学结构式 Figure 1 Chemical structures of vitamin K1, K2 and K3 (from left to right). |
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维生素K2传统生理功能主要体现在促进凝血酶原的产生和增加骨钙素的合成[6-7]。新近发现维生素K2在降低肝硬化转化为肝癌的风险等方面，也有明显作用[8]。维生素K2可以采用化学合成法和微生物发酵法制备，化学法存在高能耗、高污染、副产物多和生物活性低等问题。而微生物法制备维生素K2条件温和、污染少、能耗低，产品本身来源于生物，具有高生物活性和高生物相容性。
目前报道生产维生素K2的菌株主要有黄杆菌(Flavobacterium sp.，产MK-4)[9-12]和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto，产MK-7)[13-17]。维生素K2在生物合成时，关键的萘醌母环异戊烯基化是由异戊烯基转移酶催化完成的。novQ基因来源于球状链霉菌Streptomyces sp.和雪白链霉菌Streptomyces niveus，其产物NovQ是一种异戊烯基转移酶，主要参与合成新生霉素的环A结构。NovQ底物专一性不强，能催化多种萘醌、氢醌、酚类等化合物的异戊烯基化反应[18-19]。
巴斯德毕赤酵母作为一种成熟高效的基因工程蛋白表达系统，具有操作简单、培养方便、生长速度快、蛋白表达量高、成本低廉的优点[20-21]。作者实验室开展了采用毕赤酵母合成MK-3的研究工作[22]。以来源于雪白链霉菌的novQ基因利用pPIC9载体在GS115毕赤酵母中实现了异源表达和优化，并证实了其能使毕赤酵母合成维生素K2，主要是MK-3；虽然使用的是分泌型载体，然而在实验中发现重组毕赤酵母Gpn12在胞内产MK-3具有较大潜力，本研究在此基础上确定重组毕赤酵母全细胞催化合成MK-3的关键因素，优化催化条件，为该菌的进一步扩大生产提供一定的借鉴。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种重组巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris Gpn12由本实验室保存[22]。
1.1.2 主要试剂维生素K2(MK-4)标品购自Sigma公司；甲萘醌、异戊烯醇等为国产分析纯试剂；色谱级甲醇和二氯甲烷购自上海生工。蛋白提取缓冲液：NaCl 0.5 mol/L，氨基丁三醇0.2 mol/L，pH 7.4。无硫酸铵酵母无氨基酸氮源(YNB)10×母液：用蒸馏水配成3.4%溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌后现用。生物素500×母液：蒸馏水配成0.02%溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌备用。显影剂：0.1 mol/L Tis-HCl缓冲液(pH 8.5)，0.2 mmol/L对羟基苯丙烯酸，1.25 mmol/L 3-氨基苯二甲酰肼，需要时现加0.024%过氧化氢。
1.1.3 培养基MGY培养基：甘油1%，硫酸铵1%，YNB 0.34%，生物素0.000 04%；BMMY培养基：酵母粉1%，YNB 0.34%，生物素4×10-5%，蛋白胨1%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，甲醇0.5%-3%，硫酸铵1%；MD固体培养基：YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%，葡萄糖2%，琼脂2%；BMY培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%；高密度发酵培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，甘油4%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%。
1.1.4 主要仪器设备G154TW高压蒸汽灭菌锅，致微仪器有限公司；BSA124S万分天平，赛多利斯公司；数显PHS-25型pH计，上海雷磁仪器厂；J2-HS冷冻离心机，贝克曼库尔特公司；HZ200L恒温摇床，瑞华仪器设备有限公司；Essential LC-6高效液相色谱仪，岛津公司。
1.2 方法 1.2.1 重组毕赤酵母Gpn12摇瓶培养活化：28 ℃下在MD固体培养基上划线，静置培养至生长出明显菌落。挑取单菌落接种到含MGY培养基的三角瓶(25 mL/250 mL)中，28 ℃、200 r/min培养36 h。
诱导：按10%接种量，接种到含MGY培养基的三角瓶中，28 ℃、200 r/min培养36 h后，1 800 r/min离心5 min后，弃上清，用同体积BMMY重悬，同样条件培养至发酵结束。
1.2.2 甲醇诱导对重组毕赤酵母Gpn12 NovQ表达优化前期探究了初始pH、诱导温度和诱导时间对表达优化的影响[25]。其对照组条件为pH 6.0、28 ℃、72 h、3%甲醇，本文在此条件下，继续考察甲醇添加量(0.5%-3.0%)对NovQ表达的影响。并将最优甲醇添加量结果用于前期研究获得的优化后条件(pH 8.0、25 ℃、96 h、3%甲醇)。NovQ蛋白半定量以NovQ表达最高的条件为100%，并设定为对照组。
1.2.3 30 L细胞催化剂制备见前期研究文献[22]。
1.2.4 NovQ异戊烯基转移酶半定量毕赤酵母采用冷冻研磨法破碎[23]：取酵母培养物5 mL离心去除上清，用生理盐水洗涤3次，加入3 mL蛋白提取缓冲液于-20 ℃预冻1 h后，转至预冻过的研钵中，加入3 g石英砂研磨10 min。
蛋白提取：转移酵母匀浆至25 mL离心管中，用2 mL蛋白缓冲液洗涤研钵，也并入离心管中。60 ℃水浴30 min，然后13 000 r/min离心5 min，上清转移到新离心管，加入50 μL去氧胆酸溶液(2%)，混匀后，4 ℃放置30 min；加入500 μL饱和三氯乙酸溶液，混匀后，4 ℃静置6 h，13 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清；沉淀加4 ℃丙酮5 mL重悬洗涤，13 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清，重复3次；通风橱中吹干后，加入1 mL去离子水溶解，即得含NovQ异戊烯基转移酶的胞内蛋白。
蛋白检测半定量：使用蛋白印迹技术对NovQ进行检测，Anti-6×his Tag鼠单抗为一抗，Goat Anti-Mouse IgG H & L为二抗。根据显色强度，对目标蛋白进行半定量。
1.2.5 重组毕赤酵母Gpn12全细胞催化合成MK-3条件单因素优化及响应面优化全细胞催化对照组：发酵培养物10%装液量于250 mL三角瓶中，加入甲萘醌200 mg/L、异戊烯醇2 mL/L、甲醇2%、表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 0.5%，在pH 7.5、28 ℃、200 r/min条件下催化24 h，离心收集菌体，冷冻干燥后甲醇萃取，检测MK-3产量。考察单因素为：1)初始pH 4.5-8.5，梯度为1；2)催化温度20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃；3)催化时间0、12、24、36、48 h；4)甲醇添加量0、1%、2%、3%、4%；5)甲萘醌添加量0、50、100、200、300、400 mg/L；6)异戊烯醇添加量0、0.5、1、2、3、4 mL/L；7) CTAB添加量0、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%；其他条件同对照组。在单因素试验基础上，根据高点附近单因素方差分析选出具有显著影响的因素(P＜0.05)进行Box-Behnken实验优化。
1.2.6 毕赤酵母30 L发酵罐催化合成MK-3在30 L发酵罐中先后考察催化时间和细胞催化剂浓度对MK-3产量的影响。1)催化时间：0、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84 h；2)细胞催化剂浓度：100、140、180、220、260 g/L。毕赤酵母培养方法同1.2.3。
1.2.7 MK-3检测方法见前期研究文献[22]。
2 结果与分析 2.1 甲醇诱导条件对Gpn12表达NovQ的影响诱导剂对诱导型转录表达有直接影响，甲醇是重组毕赤酵母Gpn12的诱导剂和诱导阶段的碳源。在前期实验对照组条件下，甲醇浓度对NovQ异戊烯基转移酶的表达影响如图 2所示，NovQ表达量随着甲醇添加量的增加而增多，当甲醇添加量超过2%时，NovQ表达量反而降低，高浓度甲醇可能影响了毕赤酵母的生长代谢进而抑制NovQ的表达。图中3%甲醇添加量的条件与前期实验对照组条件完全相同。
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| 图 2 甲醇诱导剂添加量对NovQ异戊烯基转移酶表达的影响 Figure 2 Effect of methanol on the expression of NovQ prenyltransferase in shake flask fermentation. |
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基于前期实验优化条件，NovQ表达的差异如图 3所示，甲醇浓度为2%时，NovQ表达量提高了36%左右。
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| 图 3 不同甲醇诱导条件下NovQ表达结果比较(A：前期优化的NovQ表达；B：A基础上甲醇优化后的NovQ表达) Figure 3 Comparison of NovQ expression results under different methanol-induced conditions. A: novQ expression of early optimization; B: novQ expression after methanol optimization based on A. |
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在活细胞催化实验中，pH同时影响着酶活性和细胞状态。初始pH对MK-3产量影响如图 4所示，在pH 5.5-8.5范围，随着pH上升，MK-3产量增加；到pH 7.5时，MK-3达到高点，之后MK-3产量随pH上升反而降低。
2.2.2 催化温度对MK-3产量影响温度是影响酶催化反应的重要因素之一。如图 4所示，催化温度28 ℃以下时，MK-3产量随温度升高而降低，28 ℃时MK-3产量仅为75 mg/L左右。随着催化温度升高至32 ℃，MK-3产量达到88 mg/L左右，与20 ℃催化时MK-3产量大致相当。在BRENDA酶数据库中查到，NovQ异戊烯基转移酶(EC 2.5.1.111)最适温度是30 ℃。结合实验结果，选定了与NovQ最适温度较为接近且MK-3产量较高的32 ℃作为下一步探索条件。
2.2.3 催化时间对MK-3产量影响活细胞催化时间对MK-3产量的影响如图 4所示，MK-3产量在催化进行12 h达到高点，之后无明显上升。时间过长时，细胞活力降低，合成速率低于分解速率，导致MK-3产量下降。36、48 h数据波动可能与液体蒸发有一定关系。
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| 图 4 初始pH、催化温度和时间对MK-3产量的影响 Figure 4 Effect of initial pH, catalytic temperature and time on MK-3 production. |
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如图 5所示，甲醇添加量在2%以下时，MK-3产量呈微小上升趋势，而后随着甲醇添加量上升，MK-3产量略微下降。维生素K2类化合物生物合成中异戊烯基焦磷酸合成需要能量，甲醇是催化过程中毕赤酵母的碳源和诱导剂，但其添加量对于MK-3产量的影响不明显。
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| 图 5 甲醇、甲萘醌、异戊烯醇和CTAB对MK-3产量的影响 Figure 5 Effect of methanol, menadione, isopentenol and CTAB on MK-3 production. |
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重组毕赤酵母Gpn12通过芳香族异戊烯基转移酶NovQ催化萘醌环异戊烯基化。维生素K2类化合物前体甲萘醌对MK-3产量的影响如图 5所示，MK-3产量随着甲萘醌添加量上升基本呈现上升趋势，当甲萘醌添加量达300 mg/L时达到高点，随后呈下降趋势。
2.2.6 异戊烯醇对MK-3产量的影响Gpn12能自身通过复杂不明确的过程转化异戊烯醇合成寡聚异戊二烯[24]，作为MK-n (n＜4)的R基侧链。异戊烯醇对MK-3的影响如图 5所示，在其添加量达到3 mL/L时，MK-3产量达到高点。
2.2.7 CTAB对MK-3产量的影响表面活性剂CTAB对MK-3产量影响如图 5所示，随着CTAB添加量增加，MK-3产量上升，在CTAB达到0.8%后不再增加。可能原因是在CTAB达到临界胶束浓度之前，在水中呈单分子状态，不形成胶团，浓度上升可加大对细胞膜磷脂分子层的破坏，提高细胞膜的通透性，使前体进入细胞中，促进MK-3的合成；而随着浓度达到临界胶束浓度，继续增加浓度只会形成胶团，憎水基团隐藏在胶团内核，不具备继续增加细胞膜通透性的作用。
2.2.8 响应面优化在单因素结果高点附近进行单因素方差分析，发现温度、甲萘醌添加量、催化时间具有显著影响(P＜0.05)，对这3个显著因素继续进行响应面分析。表 1所示为响应面设计实验因素水平和编码。
| Factor | Level | ||
| -1 | 0 | 1 | |
| A (℃) | 30 | 32 | 34 |
| B (h) | 6 | 12 | 18 |
| C (mg/L) | 250 | 300 | 350 |
根据Design-Expert进行Box-Behnken设计，以MK-3产量为响应值，温度(A)、甲萘醌添加量(B)、催化时间(C)为自变量，进行三因素三水平实验。实验设计及结果如表 2所示。
| Trail | A | B | C | Yield (mg/L) |
| 1 | -1 | -1 | 0 | 86.04 |
| 2 | 0 | -1 | -1 | 83.15 |
| 3 | 0 | -1 | 1 | 93.55 |
| 4 | 1 | -1 | 0 | 80.18 |
| 5 | -1 | 0 | 1 | 89.92 |
| 6 | -1 | 0 | -1 | 81.29 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 93.82 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 94.85 |
| 9 | 0 | 0 | 0 | 94.87 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 95.84 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 92.08 |
| 12 | 1 | 0 | 1 | 82.81 |
| 13 | 1 | 0 | -1 | 72.51 |
| 14 | -1 | 1 | 0 | 87.21 |
| 15 | 0 | 1 | 1 | 91.52 |
| 16 | 0 | 1 | -1 | 79.57 |
| 17 | 1 | 1 | 0 | 74.96 |
得到回归方程为：
Y=94.29-4.25A-1.21B+5.16C-1.60AB+0.42AC+ 0.39BC-8.75A2-3.44B2-3.90C2，R2=0.9878。
由表 3方差分析结果可知，模型拟合程度极显著(P＜0.001)，R2=0.987 8，表明模型与实际拟合良好；Adj-R2=97.22%，表明模型对MK-3产量变化可以很好解释；失拟不显著(P=0.767 8)，表明模型不需要添加项，与实验拟合较好。
| Source | MS | F-value | P value | |
| Model | 95.17 | 63.21 | ＜0.0001 | Significant |
| A | 144.50 | 95.97 | ＜0.0001 | |
| B | 11.66 | 7.75 | 0.0272 | |
| C | 213.00 | 141.47 | ＜0.0001 | |
| AB | 10.21 | 6.78 | 0.0352 | |
| AC | 0.70 | 0.46 | 0.5181 | |
| BC | 0.60 | 0.40 | 0.5477 | |
| A2 | 322.72 | 214.33 | ＜0.0001 | |
| B2 | 49.82 | 33.09 | 0.0007 | |
| C2 | 64.20 | 42.64 | 0.0003 | |
| Lack of Fit | 0.79 | 0.39 | 0.7678 | Not significant |
用Design-Expert预测MK-3在三因素-1到1水平内最大值为96.475 mg/L。对应温度为31.6 ℃，甲萘醌添加量为295.59 mg/L，催化时间为15.87 h。三个平行实验验证MK-3产量为98.29、99.39、97.73 mg/L，平均产量为98.47 mg/L，与MK-3最大预估值相对误差为2.07%。
2.3 毕赤酵母30 L发酵罐催化结果分析 2.3.1 催化时间对MK-3产量的影响毕赤酵母于发酵罐中培养诱导之后，在搅拌速率500 r/min、pH 7.5、温度31.6 ℃、甲醇2%、CTAB 0.8%、异戊烯醇3 mL/L、甲萘醌295.6 mg/L催化条件下，催化时间对MK-3的影响如图 6所示。催化开始，MK-3含量迅速增加，在24 h达到高点，之后呈下降趋势。在相同时间内，发酵罐中产物积累快于摇瓶中积累，高点产量提高，时间延后。可能原因是在发酵罐中，pH、溶氧等条件维持稳定，细胞活力保持较长时间，利于MK-3合成。
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| 图 6 催化时间和细胞催化剂浓度对发酵罐中MK-3产量的影响 Figure 6 Effect of catalytic time and cell catalyst concentration on MK-3 production in fermenter. |
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催化时间24 h、其他同2.3.1催化条件下，毕赤酵母细胞催化剂浓度对MK-3的影响如图 6所示。随着细胞催化剂浓度升高，MK-3产量呈上升趋势，在细胞催化剂浓度220 g/L时达到高点189.67 mg/L，随后不再继续升高。可能原因是细胞催化剂在一定范围内浓度升高有利于MK-3的合成，但是浓度过高会使细胞生存环境恶化，不利于细胞活力的维持。
3 结论重组毕赤酵母Gpn12能异源表达异戊烯基转移酶基因novQ，并催化MK-3的合成。在NovQ表达上，本研究对甲醇添加量进行探究，发现在2%甲醇添加量时，NovQ表达比之前的研究提高了36%左右。在MK-3合成条件优化方面，在摇瓶中探究了催化时间、催化温度和甲醇添加量等7个因素对MK-3产量的影响，并对单因素方差分析筛选出的初始pH、催化温度和甲萘醌添加量3个因素进行了响应面优化，最终优化后条件为初始pH 7.5、催化温度31.6 ℃、甲醇添加量2%、甲萘醌295.59 mg/L、异戊烯醇3 mL/L、催化时间15.87 h和CTAB 0.8%，此时MK-3产量达到98.47 mg/L，比优化前提高了35%；30 L发酵罐中催化合成MK-3，发现在细胞催化剂初始浓度220 g/L和催化时间24 h时，MK-3产量达到189.67 mg/L，比前期研究结果提高了1倍以上，表明高浓度细胞催化明显提高产量，有利于提高设备利用，提升生产强度。鉴于目前毕赤酵母表达和发酵的成熟工艺，本研究可显著推进异戊烯基转移酶NovQ产业化生产及应用进程。
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