生物工程学报  2018, Vol. 34 Issue (1): 34-43
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170152
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
0

文章信息

鲁丹, 曾凡一
Lu Dan, Zeng Fanyi
长效重组人凝血因子Ⅷ研究现状及进展
Status and advances of long-acting factor Ⅷ
生物工程学报, 2018, 34(1): 34-43
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(1): 34-43
10.13345/j.cjb.170152

文章历史

Received: April 11, 2017
Accepted: June 7, 2017
长效重组人凝血因子Ⅷ研究现状及进展
鲁丹1,2, 曾凡一1,2,3     
1 上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院医学遗传研究所,上海 200040;
2 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室,上海 200040;
3 上海交通大学医学院 医学科学院发育生物学研究室,上海 200025
收稿日期:2017-04-11; 接收日期:2017-06-07
基金项目:国家科技重大专项(No. 2013ZX09102037),上海市卫生和计划生育委员会科研课题计划(No. 20164Y0070)资助
摘要:重组凝血因子Ⅷ (rFⅧ)替代疗法是目前临床上治疗A型血友病最为有效的方法。过去十几年的临床试验已经验证了rFⅧ替代疗法的安全性和有效性,但由于FⅧ的半衰期较短,患者需要隔天或者每周3次进行静脉注射治疗。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦,还容易产生FⅧ抗体,严重影响治疗效果。以下就目前长效型重组凝血因子Ⅷ的研究进展及存在的主要问题进行了综述。
关键词长效重组人凝血因子Ⅷ     血友病A     重组蛋白     血管性血友病因子     FⅧ与vWF相互作用    
Status and advances of long-acting factor Ⅷ
Dan Lu1,2, Fanyi Zeng1,2,3     
1 Shanghai Institute of Medical Genetics, Shanghai Children's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200040, China;
2 Key Laboratory of Embryo Molecular Biology, Ministry of Health & Shanghai Key Laboratory of Embryo and Reproduction Engineering, Shanghai 200040, China;
3 Institute of Medical Science, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China
Abstract: Current treatment for hemophilia A is based on replacement therapy that is the most effective method by using recombinant clotting factor FⅧ (rFⅧ). Although the safety and effectiveness of replacement therapy has been proved by clinical practice for the last decades, FⅧ products are temporally limited because of a short half-life and requiring prophylactic injections frequently for most patients, usually three times per week or every other day. Frequent intravenous injection not only brings physical pain to the patient, but also produces FⅧ antibodies that seriously affect the treatment effect. In this paper, we review the present status, research progress and main problems of the long-acting recombinant factor Ⅷ.
Key words: long-acting clotting factor Ⅷ     hemophilia A     recombinant protein     von Willebrand factor     interaction between FⅧ and vWF    

凝血因子Ⅷ (Factor Ⅷ,FⅧ)是由肝脏中的肝窦内皮细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,它在止血过程中发挥着至关重要的作用[1]。由于FⅧ缺乏引起的血友病称之为血友病A(Haemophilia A,HA),是临床上最普遍的血友病类型,约占血友病患者总数的80%以上,其中男性发病率约为1/5 000[2]。HA患者病情严重程度与FⅧ缺乏程度密切相关,其中重度HA患者体内FⅧ的含量小于正常人含量的1%,临床上表现为关节、肌肉、内脏及深部组织等自发性出血或外部损伤后出血不易凝固,出血量偏高,严重时甚至会危及患者生命[3]

目前,对于HA患者的主要治疗方法为FⅧ替代疗法,即定期给HA患者输入FⅧ,维持患者体内FⅧ的含量最小为1%。但是FⅧ的半衰期较短,约为12 h左右,在儿童体内更短,患者需要隔天或者每周3次进行静脉注射治疗[4]。传统的FⅧ制备方法是从人血液中进行提取和纯化FⅧ纯品,但该方法血液来源有限,成本很高,此外血液容易受到病毒污染,导致FⅧ制品的安全性问题。为了解决上述问题,人们利用基因工程技术生产长效重组FⅧ (rFⅧ),通过结构改造不断改善重组蛋白的活性、稳定性和延长其半衰期。下面就FⅧ的结构和作用机理、目前延长FⅧ半衰期的方法、FⅧ与血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)相互作用对延长FⅧ半衰期的影响以及未来长效rFⅧ研发的策略等几个方面对长效重组人凝血因子Ⅷ研究现状及进展进行综述。

1 FⅧ结构和作用机理

FⅧ基因位于X染色体长臂上(Xq28),全长约为186 kb,包含26个外显子和25个内含子。FⅧ的mRNA长约9 kb,其编码的蛋白前体含有2 351个氨基酸残基(其中信号肽由19个氨基酸残基组成),而成熟的FⅧ蛋白由2 332个氨基酸残基组成[5]。成熟的FⅧ蛋白空间上含有A、B和C三种结构域,在一级结构上的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2[6]。三个A结构域均由约330个氨基酸残基组成,结构域间以及与血铜蓝蛋白间的同源性约为40%。C结构域偏小,由约160个氨基酸残基组成,与多种盘状蛋白质折叠家族成员具有相对较远的同源关系。B结构域含有较多的糖基化修饰,具有较低的同源性[7]。在B结构域上存在着蛋白酶furin的识别位点R1313和R1648[6]。在FⅧ分泌前,蛋白酶furin会在R1648对单链FⅧ进行剪切,产生一条由A3-C1-C2组成的轻链(80 kDa)和一条由A1-A2-B组成的重链(90–210 kDa)[8]。由于蛋白在加工过程中furin也可能对R1313或其前后进行酶切,导致分泌后FⅧ的重链长短不一。FⅧ的轻链和重链以二价金属离子结合形成异质二聚体糖蛋白。图 1显示了凝血因子Ⅷ蛋白结构的示意图。

图 1 凝血因子Ⅷ蛋白结构示意图[7] Figure 1 Domain structure of FⅧ[7]. The position of domain boundaries and main proteolytic processing sites when FⅧ secretion and activation are denoted by residue numbers and blue arrows. The black arrows indicate the position that different proteases interact with the activated heterotrimer.

分泌后的FⅧ会与vWF结合形成FⅧ/vWF复合物,共同进行血液循环。一旦血管发生损伤,FⅧ将进一步发生酶解产生活化的FⅧ复合物(Activate FⅧ,FⅧa),并与vWF解离结合到活化的血小板上[9]。凝血级联反应主要包括两种途径——内源性凝血途径和外源性凝血途径。FⅧ作为启动因子和调节因子参与到内源性凝血途径中。血管发生出血性损伤后,在活化的FⅩ (Activated FⅩ,FⅩa)或者凝血酶的激活下被蛋白酶剪切,去掉B结构域并断开A1和A2结构域,同时去除位于A3结构域N端的a3酸性肽,使得FⅧ与vWF分离,从而形成由A1/A2/A3-C1-C2组成的FⅧa[9-10]。FⅧa随后与活化的FⅨ (Activated FⅨ,FⅨa)组成复合物,通过C2结构域C端结合位点与活化的血小板结合,并激活FⅩ。活化后的FⅩ进一步激活凝血酶从而完成凝血的作用[7]

2 延长FⅧ半衰期的方法

凝血因子Ⅷ在人体内的半衰期仅为12 h左右,因此HA患者在预防和治疗过程中需要长期反复注射rFⅧ制剂。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦,还容易产生FⅧ抗体,严重影响治疗效果。因此,有效地延长rFⅧ制品的半衰期对于临床治疗和缓解患者痛苦具有十分重要的意义。目前已报道的成功延长rFⅧ半衰期的HA替代治疗药物开发采用的方法主要有:rFⅧ-Fc融合蛋白、聚乙二醇(PEG)聚合物修饰和单链结构rFⅧ[2, 11-12]

2.1 rFⅧ-Fc融合蛋白

IgG与新生儿Fc受体(FcRn)结合的区域主要是Fc结构域,与该结构域融合的蛋白药物能够进行FcRn介导的细胞内吞和再循环过程,从而免受细胞内降解,延长半衰期[13-14]。2002年,百健研发团队Dumont等将人IgG1的Fc结构域与B结构域缺失的FⅧ的C末端直接连接融合表达制备rFⅧ-Fc (图 2A),经蛋白酶解后,rFⅧ-Fc能够产生90 kDa的重链和130 kDa的Fc融合轻链,轻链和重链通过金属非共价键连接。经过活化部分凝血活酶时间(APTT)和显色分析,Fc结构域与FⅧ融合并没有影响到rFⅧFc的活性。随后,该课题组进行了动物体内实验,发现rFⅧFc在HA小鼠和HA狗体内的半衰期分别延长了1倍和0.5–1.0倍[15]。rFⅧFc在HA患者体内的安全性研究表明rFⅧFc的摄入不会使患者产生抗体或抑制剂,且rFⅧFc体内的半衰期与rFⅧ相比延长了0.5–1.0倍,使得患者的给药频率减少到每周1–2次[16-17]。此外,最新长期临床Ⅲ期研究(A-LONG研究)结果表明,rFⅧFc对成年HA患者和儿童,以及重度HA患者进行长期的预防和治疗过程中,均表现出良好的安全性、有效性和耐受性,进一步保证了rFⅧFc长期用药的安全性[18-19]。2014年6月,百健公司宣布rFⅧFc通过了FDA上市审批,将其命名为ELOCTATE®,成为首个长效重组A型血友病药物。

图 2 rFⅧ-Fc融合蛋白和单链rhFⅧ的结构示意图 Figure 2 Structure of rFⅧ-Fc and Single chain rhFⅧ. (A) The recombinant fusion protein linking factor Ⅷ with Fc (rFⅧ-Fc). (B) The single chain factor Ⅷ.
2.2 PEG修饰

聚乙二醇(PEG)是一种不带电荷的亲水线性大分子,通过选择性地将它与蛋白的非必需基团共价结合,可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解,减少免疫原性,延长蛋白药物的半衰期。目前PEG修饰的rFⅧ制品主要包括N8-GP、BAX 855 (Adynovate,Baxalta US Inc.,Westlake Village,CA)和BAY 94-9027 (表 1)。2015年11月,Baxalta公司的长效rFⅧ药物Adynovate获得了FAD的上市批准,这是首个PEG化长效rFⅧ类产品。Adynovate是由Turecek等在百特公司的商品化重组全长FⅧ (ADVATE®)基础上进行特殊的定点PEG化修饰,药代动力学研究表明在HA小鼠、大鼠和猕猴体内,Adynovate的半衰期为FⅧ的2倍左右[20]。临床实验结果表明,在HA患者体内,Adynovate的半衰期与ADVATE®(半衰期约12 h)相比延长了1.4–1.5倍,而且在HA成人和儿童预防与治疗或者重度HA患者手术过程中,均表现出良好的止血效果和安全性[21-22]

表 1 现阶段临床试验长效重组FⅧ药物比较 Table 1 Half-life extended factor Ⅷ products in clinical trials
Modification Product Characteristics Manufacturer Fold increase vs. comparator Phase Reference
Fc fusion ELOCTATE® factor Ⅷ Fc fusion protein Biogen Idec 1.5–1.7 Marketed [17]
PEGylation BAX 855 PEGylated rFⅧ Baxter 1.4–1.5 Marketed [20]
NN7088 (N8-GP) O-glycoPEGylation Novo Nordisk 1.6 Phase Ⅲ [27, 33]
BAY 94-9027 K1804C directed PEGylation Bayer 1.6 Phase Ⅲ [23, 25]
PSA modification PSA factor Ⅷ PSA added to rFⅧ Baxter 1.4–2.0 Preclinical [29]
rⅧ-single chain AFSTYLA Single chain rFⅧ CSL Behring 1.4 Marketed [30]

拜耳公司研发团队生产了位点特异PEG修饰的B区缺失FⅧ突变体(BAY 94-9027),体外实验表明该突变体具有完整的凝血功能并能够正常与vWF结合[23]。动物实验表明,PEG化FⅧ突变体在HA小鼠和兔子体内均明显延长了rFⅧ的半衰期。临床试验中,rFⅧ在HA患者体内的半衰期延长到19 h[24-25]

诺和诺德公司Agersoe等制备PEG修饰rFⅧ是将PEG连接在N8唯一的O-糖链处,该PEG化FⅧ具有与天然FⅧ相似活性,在HA狗模型中的评估结果显示,其半衰期较标准rFⅧ的半衰期增加了约1倍时间[26],在HA患者体内N8-GP的平均半衰期为19 h,延长到原来的1.6倍[27]。目前,N8-GP正处在临床Ⅲ期试验阶段,已完成对重度HA患者安全性和有效性评估,结果显示N8-GP具有良好预防和治疗效果,同时不存在安全性问题[28]

此外,百特公司还开发了与PEG化延长蛋白药物半衰期方法相似的聚唾液酸(PSA)化rFⅧ,其半衰期是内源FⅧ的1.4倍左右,目前该rFⅧ正处于临床前研究阶段[29]

2.3 单链结构rFⅧ

杰特贝林致力于单链结构rhFⅧ的研发,他们将FⅧ的重链和轻链以共价键进行连接从而形成单链结构rhFⅧ (Afstyla,CSL627) (图 2B),单链结构的rhFⅧ加强了重链和轻链间的相互作用,同时表现出与vWF更强的亲和力。临床前研究表明,与全长rhFⅧ相比,CSL627表现出了更好的药代动力学性质,清除率降低了2倍而半衰期延长了1倍。CSL627与全长结构rhFⅧ在动物体内具有相当的生物活性,静脉注射也没有观察到动物的不良反应[11, 30]。临床Ⅰ期实验比较了单剂量(50 IU/kg) CSL627和rFⅧ的药代动力学性质,结果表明,与rFⅧ相比,CSL627在所有患者体内均表现出较低的清除速度,93%的病人体内表现出更长的半衰期[31]。CSL627在临床Ⅲ期实验中也表现出了良好的治疗和预防作用[32]。2016年5月,FDA批准了Afstyla用于A型血友病患者的治疗,成为首个获批的重组单链凝血因子Ⅷ产品。表 1是对现阶段处于已上市或临床试验阶段的长效重组FⅧ药物的比较。表 2是对多种长效重组FⅧ药物部分临床试验结果的比较。

表 2 长效重组FⅧ药物部分临床试验结果 Table 2 Results from clinical trial programs of half-life extended factor Ⅷ products
Product Clinical trial program Number of patients Prophylaxis arm ABR
ELOCTATE® A-LONG 118 65 IU/kg per week (fixed regimen) 1.6
BAX 855 PROLONG-ATE 137 (45±5) IU/kg 2× per week 1.9
NN7088 Pathfinder™ 175 50 IU/kg every 4th day 1.33
BAY 94-9027 PROTECT FⅧ 141 25 IU/kg 2× per week for 10 weeks 1.9–4.1
AFSTYLA AFFINITY 173 Determined by treating physician Ongoing
ABR, annualized bleeding rate.
3 FⅧ与vWF相互作用对延长FⅧ半衰期的影响

vWF是由内皮细胞和巨核细胞合成和分泌的一种糖蛋白,在止血过程中发挥着重要的作用[34]。vWF是FⅧ体内的天然结合载体,FⅧ分泌到血液后,会与vWF结合,以FⅧ/vWF复合物的形式进行血液循环[35],调节血小板凝聚以及血液凝块的形成。FⅧ与vWF的结合对于FⅧ在血液循环过程中的稳定是至关重要的。

FⅧ与vWF间具有很高的亲和力,vWF与FⅧ的结合位点位于轻链上,与FⅧ的a3、C1和C2结构域相互作用[35-37]。vWF与hFⅧ蛋白轻链的相互作用既能增强hFⅧ蛋白轻链和重链的结合[38],也增强了FⅧ的稳定性和延长hFⅧ半衰期约2–12 h:一方面vWF结合的hFⅧ不能与磷脂和血小板结合而延长了hFⅧ在血浆中的时间;另一方面由于FⅧ/vWF复合物的形成隐藏了位于hFⅧ轻链上的蛋白酶结合位点,从而使FⅧ免受凝血酶以外的蛋白酶降解[35]

临床研究表明,血管性血友病Ⅰ型或Ⅲ型患者的FⅧ水平会随着血液中vWF的减少而降低,而血管性血友病2N型患者由于vWF基因的突变而干扰了FⅧ与vWF的结合,虽然患者体内的vWF水平正常,但是FⅧ的水平却显著降低。通过将HA患者的血浆输入到一些血管性血友病患者体内,发现这些血管性血友病患者的FⅧ水平有所恢复,这是由于输入的血液中vWF补充了患者体内缺失的vWF,增加了患者FⅧ在血液中的稳定性,表明外源的vWF能够稳定内源的FⅧ。同样的,利用外源重组FⅧ治疗HA患者,患者体内的vWF也能够与外源重组FⅧ相互作用,增加重组FⅧ在血液中的稳定性,从而也能够达到稳定血液中FⅧ水平的作用[39]

vWF除了在体内能够起到稳定FⅧ半衰期的作用外,在体外也起到了延长FⅧ半衰期的作用。笔者所在单位上海交通大学医学遗传研究所利用动物乳腺生物反应器在转基因小鼠乳腺中实现了FⅧ与vWF的共表达,实验结果表明,在相同条件下,共表达vWF的FⅧ转基因小鼠乳汁中FⅧ比单独表达FⅧ的转基因小鼠乳汁中FⅧ的体外半衰期延长了约1倍[40]

3.1 FⅧ/vWF复合物的清除

人和动物实验表明vWF的缺失会导致FⅧ的半衰期降低6倍,而FⅧ的存在并没有影响vWF的半衰期。这一结果与大部分FⅧ和vWF结合并被清除的观点相一致,进一步表明了vWF能够保护FⅧ免受最初的降解。FⅧ的清除速率直接影响着FⅧ的稳定性和半衰期。因为FⅧ/vWF以复合物形式进行血液循环,评价FⅧ在血液中的清除过程就变得比较复杂。直至今日,人们仍然没有探明FⅧ和vWF这两个蛋白在血液中的清除机理。但有一点是毋庸置疑的,即影响vWF清除率的因素会直接或者间接影响FⅧ的清除率。vWF和FⅧ具有一些共同的清除受体,这些受体既可以与FⅧ结合,也可以与vWF结合,如LRP1[41]、ASGPR[42]、Siglec-5[43]和STAB 2[1]等。研究还发现在体外vWF的存在常常会影响FⅧ与其适合受体(LRP1,ASGPR,Siglec-5)的结合。但这并不代表FⅧ不能够与这些受体单独发生作用。vWF与FⅧ的相互作用是高度动态变化的,二者具有很高的结合和解离速率。这个动态平衡表明FⅧ会频繁地与vWF解离,使得FⅧ可以从一个vWF分子移动到另一个vWF分子。

3.2 半衰期延长的rFⅧ与vWF的作用

临床前和临床试验研究均发现PEG修饰的rFⅧ、rFⅧFc和单链结构的rFⅧ仍需要与内源性的vWF相互作用,并受到该相互作用的调控,rFⅧ大部分以FⅧ/vWF复合物的形式被清除,因此vWF对长效型rFⅧ的稳定性具有重要作用。

3.2.1 PEG修饰rFⅧ

与FⅧ相比,PEG化的长效rFⅧ半衰期延长到1.5倍左右。临床前研究表明FⅧ和vWF的相互作用对PEG修饰FⅧ半衰期的延长作出了贡献。Tang等突变了FⅧ (PEG化的B结构域缺失的FⅧ,PEG-FⅧ-BDD)与vWF结合的结构域获得PEG-F8V,发现在HA小鼠和大鼠体内PEG-F8V的半衰期与PEG-FⅧ-BDD相比均降低了1倍[39]

3.2.2 rFⅧFc

在vWF敲除小鼠中发现,rFⅧFc的半衰期与rFⅧ相比延长了5倍,而当vWF存在时,rFⅧFc的半衰期与rFⅧ相比仅延长了1.8倍,vWF的清除导致了与其结合的rFⅧFc的清除[44]。此外,临床研究发现vWF的水平与rFⅧFc的清除存在很强的关联性[16, 45],当内源性vWF水平增加时,rFⅧFc表现出清除率降低,半衰期延长。

3.2.3 单链结构rFⅧ

单链结构rFⅧ能够有效避免FⅧ两条链的自发解离,从而改善FⅧ的稳定性。Sabine等制备的单链结构FⅧ (rⅧ-single chain, CSL627)使其在体内的半衰期与FⅧ相比延长了1倍,原因在于相比于rFⅧ,rⅧ-single chain与vWF的亲和力增加了3倍,只有一小部分未与vWF结合的游离rFⅧ被迅速清除[11]。该药物动力学现象在最近的临床实验中被进一步重复和证实[46]

4 未来长效rFⅧ研发的策略

目前,研发的长效rFⅧ制品在后期临床研究中与FⅧ相比仅在一定程度上延长了FⅧ的半衰期。越来越多的研究表明,vWF的半衰期(约15 h)是FⅧ半衰期延长效果的关键限制因素,血浆中FⅧ的清除主要是通过vWF依赖的清除途径进行的。为了克服vWF依赖的限制,研究者通过以下两种途径进行新策略的尝试:一种是延长vWF的半衰期,另一种是限制FⅧ的vWF依赖的清除途径。

Yee发现包含vWF的hFⅧ结合区域的截短型vWF变体D’D3区域(764–1 247 aa)是稳定hFⅧ的必需区域。Yee等又设计生产了与Fc融合的D’D3 (D’D3-Fc),使其能在体内循环利用。研究发现,在vWF缺陷的小鼠体内,注射D’D3-Fc能使内源性凝血因子Ⅷ持续稳定,较不注射D’D3-Fc的vWF缺陷小鼠其血浆内的hFⅧ蛋白水平增长10倍,并能在注射后至少持续7 d。然而,在HA小鼠体内共注射D’D3-Fc和rFⅧ却没能有效延长rFⅧ的半衰期。通过动力学研究发现,与D’D3或D’D3-Fc相比,内源性的vWF与FⅧ具有更高的亲和力[47]。Bendetowicz和Yee等的研究表明,vWF的N端前导肽结构以及C端的D3到CK之间的片段对维持FⅧ稳定均发挥了作用[47-48]。基于Yee等的研究,笔者已采用全长vWF和Fc融合表达重组蛋白vWF-Fc来延长vWF的半衰期,以期望实现vWF-Fc在HA小鼠体内提高FⅧ稳定性和延长其半衰期的作用,同时有效克服内源性vWF的竞争作用。此外,人血清白蛋白融合的vWF (vWF-albumin)已经在哺乳动物细胞中得以表达,并在体内显示出了显著的半衰期延长效果[49]

另一种新的策略试图绕过FⅧ依赖vWF的降解途径,即通过制备一种新型rFⅧ分子,它由两部分多肽组成:含有XTEN (一种亲水性、非结构化的多肽,可延长融合蛋白半衰期)的B结构域缺失的单链结构FⅧ (BDD-FⅧ),和vWF的D’D3结构域。这些多肽与IgG1的Fc结构域融合,以使D’D3结构域能够与FⅧ部分正确连接。该策略在动物模型中表现出了良好的药代动力学,与BDD-FⅧ相比,它的半衰期延长了4倍[50]

5 总结和展望

HA的主要治疗和预防方法为rFⅧ替代疗法,也是目前临床上使用最为广泛和安全的方法,而延长FⅧ的半衰期和提高FⅧ的稳定性仍是替代疗法最需要解决的问题之一。长效rFⅧ的开发一方面可以解决FⅧ半衰期短的问题,另一方面也可以减少患者用药量,改善目前FⅧ药物紧缺的现状。因此,长效rFⅧ的开发蕴藏着巨大的经济和社会效益。令人欣喜的是在过去的几年里已有3种长效rFⅧ药物上市,多种长效rFⅧ制品正处于不同的临床试验阶段,它们已经成功地将FⅧ的半衰期延长到内源FⅧ半衰期的1.4–2.0倍,在一定程度上改善了HA替代疗法,缓解了HA患者的痛苦和经济压力,大幅提高了HA患者的生活质量。目前,我国长效型rFⅧ制品的研究还基本处于起步阶段,因此,我国科研工作者应该加强新型长效型凝血因子药物的研发,争取在未来凝血因子药物市场获得一席之地。

随着对长效rFⅧ制品机理的深入研究发现,FⅧ半衰期的延长仍有很大的提升空间。已有的临床前和临床试验结果表明,目前制约长效型rFⅧ半衰期的主要限制因素在于内源vWF与rFⅧ的相互作用。因此,未来长效型rFⅧ研发的重点是更加深入了解FⅧ和vWF相互作用及其复合物的分解代谢途径。随着将来对FⅧ和vWF之间关系的进一步认识,结合生物技术的不断创新,延长rFⅧ半衰期将会有更好的解决方法,从而改善HA的治疗并造福HA患者。

参考文献
[1] Pipe SW, Montgomery RR, Pratt KP, et al. Life in the shadow of a dominant partner: the FⅧ-vWF association and its clinical implications for hemophilia A. Blood, 2016, 128(16): 2007–2016. DOI: 10.1182/blood-2016-04-713289
[2] Carr ME, Tortella BJ. Emerging and future therapies for hemophilia. J Blood Med, 2015, 6: 245–255.
[3] Peyvandi F, Garagiola I, Young G. The past and future of haemophilia: diagnosis, treatments, and its complications. Lancet, 2016, 388(10040): 187–197. DOI: 10.1016/S0140-6736(15)01123-X
[4] Savage N. Clotting factors: stretching time. Nature, 2014, 515(7528): S162–S164. DOI: 10.1038/515S162a
[5] Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM, et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature, 1984, 312(5992): 342–347. DOI: 10.1038/312342a0
[6] Thompson AR. Structure and function of the factor Ⅷ gene and protein. Semin Thromb Hemost, 2003, 29(1): 11–22. DOI: 10.1055/s-2003-37935
[7] Shen BW, Spiegel PC, Chang CH, et al. The tertiary structure and domain organization of coagulation factor Ⅷ. Blood, 2008, 111(3): 1240–1247.
[8] Fang H, Wang LM, Wang HB. The protein structure and effect of factor Ⅷ. Thromb Res, 2007, 119(1): 1–13. DOI: 10.1016/j.thromres.2005.12.015
[9] Eaton D, Rodriguez H, Vehar GA. Proteolytic processing of human factor Ⅷ. Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Ⅹa, and activated protein C with activation and inactivation of factor Ⅷ coagulant activity. Biochemistry, 1986, 25(2): 505–512. DOI: 10.1021/bi00350a035
[10] Lollar P, Hill-Eubanks DC, Parker CG. Association of the factor Ⅷ light chain with von Willebrand factor. J Biol Chem, 1988, 263(21): 10451–10455.
[11] Zollner S, Raquet E, Claar P, et al. Non-clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of rⅧ-single chain, a novel recombinant single-chain factor Ⅷ. Thromb Res, 2014, 134(1): 125–131. DOI: 10.1016/j.thromres.2014.03.028
[12] Buyue Y, Liu TY, Kulman JD, et al. A single chain variant of factor Ⅷ Fc fusion protein retains normal in vivo efficacy but exhibits altered in vitro activity. PLoS ONE, 2014, 9(11): e113600. DOI: 10.1371/journal.pone.0113600
[13] Roopenian DC, Akilesh S. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age. Nat Rev Immunol, 2007, 7(9): 715–725. DOI: 10.1038/nri2155
[14] Levin D, Golding B, Strome SE, et al. Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity. Trends Biotechnol, 2015, 33(1): 27–34. DOI: 10.1016/j.tibtech.2014.11.001
[15] Dumont JA, Liu TY, Low SC, et al. Prolonged activity of a recombinant factor Ⅷ-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood, 2012, 119(13): 3024–3030. DOI: 10.1182/blood-2011-08-367813
[16] Mahlangu J, Powell JS, Ragni MV, et al. Phase 3 study of recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein in severe hemophilia A. Blood, 2014, 123(3): 317–325. DOI: 10.1182/blood-2013-10-529974
[17] Powell JS, Josephson NC, Quon D, et al. Safety and prolonged activity of recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein in hemophilia A patients. Blood, 2012, 119(13): 3031–3037. DOI: 10.1182/blood-2011-09-382846
[18] Nolan B, Mahlangu J, Perry D, et al. Long-term safety and efficacy of recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein (rFⅧFc) in subjects with haemophilia A. Haemophilia, 2016, 22(1): 72–80. DOI: 10.1111/hae.2016.22.issue-1
[19] Shapiro AD, Mahlangu JN, Perry D, et al. Treatment of bleeding episodes with recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein in A-LONG study subjects with severe haemophilia A. Haemophilia, 2017, 23(3): 392–399. DOI: 10.1111/hae.2017.23.issue-3
[20] Turecek PL, Bossard MJ, Graninger M, et al. BAX 855, a PEGylated rFⅧ product with prolonged half-life. Development, functional and structural characterisation. Hamostaseologie, 2012, 32(Suppl 1): S29–S38.
[21] Brand B, Gruppo R, Wynn TT, et al. Efficacy and safety of pegylated full-length recombinant factor Ⅷ with extended half-life for perioperative haemostasis in haemophilia A patients. Haemophilia, 2016, 22(4): e251–e258. DOI: 10.1111/hae.2016.22.issue-4
[22] Konkle BA, Stasyshyn O, Chowdary P, et al. Pegylated, full-length, recombinant factor Ⅷ for prophylactic and on-demand treatment of severe hemophilia A. Blood, 2015, 126(9): 1078–1085. DOI: 10.1182/blood-2015-03-630897
[23] Mei BS, Pan C, Jiang HY, et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor Ⅷ for hemophilia A treatment. Blood, 2010, 116(2): 270–279. DOI: 10.1182/blood-2009-11-254755
[24] Gu JM, Ramsey P, Evans V, et al. Evaluation of the activated partial thromboplastin time assay for clinical monitoring of PEGylated recombinant factor Ⅷ (BAY 94-9027) for haemophilia A. Haemophilia, 2014, 20(4): 593–600. DOI: 10.1111/hae.12374
[25] Coyle TE, Reding MT, Lin JC, et al. PhaseⅠstudy of BAY 94-9027, a PEGylated B-domain-deleted recombinant factor Ⅷ with an extended half-life, in subjects with hemophilia A. J Thromb Haemost, 2014, 12(4): 488–496. DOI: 10.1111/jth.12506
[26] Agers H, Stennicke HR, Pelzer H, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of turoctocog alfa and N8-GP in haemophilia A dogs. Haemophilia, 2012, 18(6): 941–947. DOI: 10.1111/hae.2012.18.issue-6
[27] Tiede A, Brand B, Fischer R, et al. Enhancing the pharmacokinetic properties of recombinant factor Ⅷ: first-in-human trial of glycoPEGylated recombinant factor Ⅷ in patients with hemophilia A. J Thromb Haemost, 2013, 11(4): 670–678. DOI: 10.1111/jth.2013.11.issue-4
[28] Giangrande P, Andreeva T, Chowdary P, et al. Clinical evaluation of glycoPEGylated recombinant FⅧ: Efficacy and safety in severe haemophilia A. Thromb Haemost, 2017, 117(2): 252–261.
[29] Tiede A. Half-life extended factor Ⅷ for the treatment of hemophilia A. J Thromb Haemost, 2015, 13(Suppl 1): S176–S179.
[30] Zollner SB, Raquet E, Müller-Cohrs J, et al. Preclinical efficacy and safety of rⅧ-single chain (CSL627), a novel recombinant single-chain factor Ⅷ. Thromb Res, 2013, 132(2): 280–287. DOI: 10.1016/j.thromres.2013.06.017
[31] Zhang Y, Limsakun T, Bensen-Kennedy DM, et al. Population pharmacokinetic modeling and simulation of recombinant single-chain factor Ⅷ (r Ⅷ-single chain) in patients with hemophilia A. Blood, 2014, 124(21): 2814.
[32] Zhang Y, Roberts J, Tortorici M, et al. Population pharmacokinetics of recombinant coagulation factor Ⅷ-single chain in patients with severe hemophilia A. J Thromb Haemost, 2017. DOI: 10.1111/jth.13662
[33] Stennicke HR, Kjalke M, Karpf DM, et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FⅧ (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood, 2013, 121(11): 2108–2116. DOI: 10.1182/blood-2012-01-407494
[34] Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: connecting the far ends. Blood, 2015, 125(13): 2019–2028. DOI: 10.1182/blood-2014-06-528406
[35] Terraube V, O'Donnell JS, Jenkins PV. Factor Ⅷ and von Willebrand factor interaction: biological, clinical and therapeutic importance. Haemophilia, 2010, 16(1): 3–13. DOI: 10.1111/hae.2009.16.issue-1
[36] Chiu PL, Bou-Assaf GM, Chhabra ES, et al. Mapping the interaction between factor Ⅷ and von Willebrand factor by electron microscopy and mass spectrometry. Blood, 2015, 126(8): 935–938. DOI: 10.1182/blood-2015-04-641688
[37] Yee A, Oleskie AN, Dosey AM, et al. Visualization of an N-terminal fragment of von Willebrand factor in complex with factor Ⅷ. Blood, 2015, 126(8): 939–942. DOI: 10.1182/blood-2015-04-641696
[38] Shiltagh N, Kirkpatrick J, Cabrita LD, et al. Solution structure of the major factor Ⅷ binding region on von Willebrand factor. Blood, 2014, 123(26): 4143–4151. DOI: 10.1182/blood-2013-07-517086
[39] Tang L, Leong L, Sim D, et al. von Willebrand factor contributes to longer half-life of PEGylated factor Ⅷ in vivo. Haemophilia, 2013, 19(4): 539–545. DOI: 10.1111/hae.2013.19.issue-4
[40] Ren XY, Gong XL, Cai Q, et al. Efficient stabilization of recombinant human coagulation factor Ⅷ in the milk of transgenic mice using hF and vWF co-expression vector transduction. Biotechnol Lett, 2015, 37(6): 1187–1194. DOI: 10.1007/s10529-015-1793-5
[41] Rastegarlari G, Pegon JN, Casari C, et al. Macrophage LRP1 contributes to the clearance of von Willebrand factor. Blood, 2012, 119(9): 2126–2134. DOI: 10.1182/blood-2011-08-373605
[42] Bovenschen N, Rijken DC, Havekes LM, et al. The B domain of coagulation factor Ⅷ interacts with the asialoglycoprotein receptor. J Thromb Haemost, 2005, 3(6): 1257–1265. DOI: 10.1111/jth.2005.3.issue-6
[43] Pegon JN, Kurdi M, Casari C, et al. Factor Ⅷ and von Willebrand factor are ligands for the carbohydrate-receptor Siglec-5. Haematologica, 2012, 97(12): 1855–1863. DOI: 10.3324/haematol.2012.063297
[44] van der Flier A, Liu Z, Tan SY, et al. FcRn rescues recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein from a VWF independent FⅧ clearance pathway in mouse hepatocytes. PLoS ONE, 2015, 10(4): e0124930. DOI: 10.1371/journal.pone.0124930
[45] Shapiro AD, Ragni MV, Kulkarni R, et al. Recombinant factor Ⅷ Fc fusion protein: extended-interval dosing maintains low bleeding rates and correlates with von Willebrand factor levels. J Thromb Haemost, 2014, 12(11): 1788–1800. DOI: 10.1111/jth.2014.12.issue-11
[46] Mahlangu J, Kuliczkowski K, Karim FA, et al. Efficacy and safety of rⅧ-single chain: results of a phase 1/3 multicenter clinical trial in severe hemophilia A. Blood, 2016, 128(5): 630–637. DOI: 10.1182/blood-2016-01-687434
[47] Yee A, Gildersleeve RD, Gu SF, et al. A von Willebrand factor fragment containing the D'D3 domains is sufficient to stabilize coagulation factor Ⅷ in mice. Blood, 2014, 124(3): 445–452. DOI: 10.1182/blood-2013-11-540534
[48] Bendetowicz AV, Morris JA, Wise RJ, et al. Binding of factor Ⅷ to von willebrand factor is enabled by cleavage of the von Willebrand factor propeptide and enhanced by formation of disulfide-linked multimers. Blood, 1998, 92(2): 529–538.
[49] Schulte S. Innovative coagulation factors: albumin fusion technology and recombinant single-chain factor Ⅷ. Thromb Res, 2013, 131(Suppl 2): S2–S6.
[50] Liu TY, Chhabra ES, Kulman J, et al. Prolonged efficacy in hemophilia A mouse bleeding models of a recombinant FⅧ-XTEN/D'D3 heterodimer with four-fold extended half-life in circulation. Haemophilia, 2014, 20: 76. DOI: 10.1111/hae.2014.20.issue-s4