生物工程学报  2017, Vol. 33 Issue (6): 1037-1045
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.160462
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
0

文章信息

刘长斌, 佟少明, 张文蕾, 侯和胜
Liu Changbin, Tong Shaoming, Zhang Wenlei, Hou Hesheng
拟南芥Leafy Cotyledon 2的表达提高了小球藻Chlorella sorokiniana的油脂含量
Expression of Leafy Cotyledon 2 from Arabidopsis increased the content of lipid in Chlorella sorokiniana
生物工程学报, 2017, 33(6): 1037-1045
Chinese Journal of Biotechnology, 2017, 33(6): 1037-1045
10.13345/j.cjb.160462

文章历史

Received: November 30, 2016
Accepted: April 1, 2017
拟南芥Leafy Cotyledon 2的表达提高了小球藻Chlorella sorokiniana的油脂含量
刘长斌, 佟少明, 张文蕾, 侯和胜    
辽宁师范大学 辽宁省植物生物工程重点实验室,辽宁 大连 116000
收稿日期:2016-11-30;接收日期:2017-04-01; 网络出版时间:2017-05-03
摘要: 油脂含量是影响微藻产业化生产生物柴油的因素之一。基因工程的方法是培育高产藻株的一个重要手段。Leafy Cotyledon 2 (LEC2) 在拟南芥中是调节种子成熟及油脂积累的重要转录因子,在藻类植物中尚无相关的报道。本研究从拟南芥中获取LEC2基因,构建表达载体pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2,通过基因枪介导法转入小球藻C. sorokiniana。经过PCR、RT-PCR、Western blotting分析,筛选出一株转ATLEC2基因藻株。对总脂肪酸含量的分析发现,转ATLEC2基因藻株的脂肪酸含量比原始藻株提高了1倍且没有明显影响生长。以上结果表明,ATLEC2能促进小球藻油脂的积累。
关键词小球藻     转录因子     Leafy Cotyledon 2     油脂    
Expression of Leafy Cotyledon 2 from Arabidopsis increased the content of lipid in Chlorella sorokiniana
Changbin Liu, Shaoming Tong, Wenlei Zhang, Hesheng Hou     
Liaoning Key Laboratory of Plant Biotechnology, Liaoning Normal University, Dalian 116000, Liaoning, China
Abstract: The low lipid content is one of the major bottlenecks to realize the industrialization of the algae biodiesel. Improvement of lipid content through global regulation to get high-yield generating algae is a good strategy. Leafy Cotyledon 2 (LEC2) is an important transcription factor for seed maturation and oil accumulation in Arabidopsis. However, there are few reports regarding adoption of LEC2 for lipid accumulation until now. In this study, LEC2 from Arabidopsis was cloned into the plant expression vector pCIMBIA1300 and transformed into C. sorokiniana through particle bombardment. One recombinant was screened by PCR, RT-PCR and Western blot analyses. Compared with the wild type one, the total lipid content in the recombinant increased one fold, which did not show effect on cell growth, indicating that LEC2 can efficiently enhance the lipid accumulation in C. sorokiniana.
Key words: Chlorella     transcription factor     Leafy Cotyledon 2     lipid    

随着全球经济的发展,世界范围内的能源需求日益增加,传统化石能源的开发和利用面临着严峻的形势,能源危机是全球面临的关键问题[1]。能源危机以及环境恶化使可再生生物柴油引起了越来越多的关注。为了生物柴油的可持续生产,迫切需要开发一种可持续的替代原料[2]。富油微藻是生产生物柴油非常有利的原料,因为微藻的生长不需要大规模的农业用地,并且能通过固定二氧化碳改善空气质量。然而,微藻生物柴油的高生产成本阻碍了其商业化生产[2-3]。通过增加藻细胞中的油脂含量降低成本是解决途径,基因工程的方法培育高产油藻株是最重要的手段之一[4-5]

Leafy Cotyledon 2 (LEC2) 属于B3家族转录因子,是种子成熟及油脂积累的主要调节器[6],在拟南芥[7-9]、烟草[10]、蓖麻[11]等植物中过量表达LEC2都能促进油脂的积累。目前关于LEC2调节机理的研究多集中在陆生植物中,而在产油微藻中尚未见报道。本研究将来自拟南芥的LEC2基因(AtLEC2)通过基因枪法转到小球藻中并获得稳定表达。通过总脂肪酸含量的分析发现,转AtLEC2基因藻株的总脂肪酸含量与原始藻株相比提高了一倍多,表明AtLEC2能促进小球藻油脂的积累。

1 材料与方法 1.1 材料

本实验采用的藻种Chlorella sorokiniana为我实验室自主筛选藻种。培养所用培养基为BG11培养基。植物双表达载体pCIMBIA1300-35s-GFP购自转导生物实验室(武汉)。

1.2 方法 1.2.1 拟南芥LEC2植物表达载体pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2的构建

以拟南芥LEC2mRNA序列(GenBank No. NM_102595.2) 为模板设计引物(Forward 5′-GGGGTACCATGGATAACTTCTTACCCTT-3′;Reverse 5′-GCTCTAGACCACCACTCAAAGTC GTTAA-3′),引物的两端分别添加KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点(下划线部分),送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用Trizol提取试剂盒(生工)和第一链cDNA合成试剂盒(生工)按说明提取拟南芥总RNA并反转录为cDNA,并以此为模板扩增得1 089 bp产物,并将其连接至PMD18-T载体上。扩增程序为:98 ℃预变性5 min;98 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。以KpnⅠ和XbaⅠ双酶切PMD18-ATLEC2质粒,回收ATLEC2片段与经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后的植物双表达载体pCIMBIA1300-35s-GFP进行体外连接,构建表达载体pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2并转入大肠杆菌DH5α。

1.2.2 小球藻的培养及潮霉素抗性检测

小球藻接种到含100 mL BG11培养基的三角瓶中,25 ℃、40 μmol/(m2·s)光强下培养,光暗周期为12 h/12 h。参考王逸云等[12-14]的研究,取培养至对数期的小球藻均匀涂布在含潮霉素的固体BG11平板上,潮霉素的浓度分别为:0、5、10、15、20 μg/mL,按上述培养条件培养14 d,观察藻落生长情况。

1.2.3 基因枪转化C. sorokiniana

基因枪转化参考Talebi[15]、Liu[16]等操作,具体操作如下:

C. sorokiniana样品的准备。将对数生长期的C. sorokiniana离心收集后平铺在灭菌的0.2 μm硝酸纤维素膜上,并置于琼脂糖平板上吸收水分。

微弹载体制备。取直径0.6 μm金粉50 mg,无水乙醇洗涤后加入1 mL ddH2O,制成50 mg/mL的金粉混合液。取50 μL金粉混合液,依次加入5 μL pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2质粒(1 μg/μL),50 μL CaCl2(2.5 mol/L)、20 μL 0.1 mol/L的亚精胺,振荡混匀,室温孵育10 min,10 000 r/min离心10 s,去上清。70%乙醇洗涤1次,无水乙醇洗涤2次,再用50 μL无水乙醇重悬。取10 μL混悬均匀的金粉置于载体膜上,晾干。

基因枪转化。组装载体膜、可裂膜、钢丝网,含C. sorokiniana的琼脂糖平板置于下层托盘上,调整托盘与载体膜距离为6 cm,1 100 psi压力轰击。轰击后的藻细胞转移到新鲜的BG11培养基中,25 ℃暗培养24 h。

1.2.4 阳性藻株的筛选

将暗培养后的藻液涂布到含潮霉素的BG11平板上,按1.2.2培养条件培养2周,挑选单藻落接种到三角瓶中进行传代培养。利用PlantZol试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取基因组DNA,并以此为模板,以1.2.1中合成的引物进行目的基因的PCR鉴定,以质粒pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2为阳性对照,原始C. sorokiniana为阴性对照,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 转ATLEC2基因小球藻的RT-PCR鉴定

取对数生长期的阳性藻株,用Trizol提取试剂盒和第一链cDNA合成试剂盒按说明提取总RNA并合成第一链cDNA,并以此为模板进行RT-PCR分析,扩增程序如1.2.1,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.6 转ATLEC2小球藻Western blotting鉴定

对RT-PCR鉴定为阳性的转基因藻株提取蛋白,进行SDS-PAGE,转膜,并用5%脱脂奶粉封闭;加入1:1 000稀释的一抗(β-Tubulin和anti-GFP),4 ℃过夜孵育;TBST洗涤干净后加入1:1 000稀释的二抗(Goat Anti-Mouse IgG抗体)室温孵育1 h,TBST洗涤;碧云天BeyoECL Star kit显色,常规显影定影,检测GFP融合蛋白的表达情况。

1.2.7 转ATLEC2基因小球藻脂肪酸组成及含量分析

将小球藻培养至指数生长末期,氮胁迫培养7 d后采收,80 ℃烘干至恒重得藻粉。将藻粉送科标技术(青岛)研发中心检测脂肪酸组成。

样品处理:取100 mg样品加入到15 mL离心管中,陆续加入2 mL 5%盐酸甲醇溶液,3 mL氯仿甲醇溶液(体积比1:1),100 μL十九烷酸甲酯内标。85 ℃水浴锅中水浴1 h,水浴完成后,等温度降到室温,在离心管中加入1 mL正己烷,振荡萃取2 min之后,静置1 h,等待分层。取上清液100 μL,用正己烷定容到1 mL。0.45 μm滤膜过膜后上机测试。

色谱条件:公司所用色谱柱为TG-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序为80 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升温至200 ℃,继续以5 ℃/min的速率升温至250 ℃,最后以2 ℃/min的速率升到270 ℃,保持3 min;进样口温度290 ℃;载气流速1.2 mL/min,不分流进样,开阀时间1 min。

质谱条件:离子源温度280 ℃,传输线温度280 ℃,溶剂延迟时间5.00 min,扫描范围30-400 Da,离子源为EI源70 eV。

1.2.8 转基因藻株光合及生长状况分析

将转基因藻株与原始对照藻株接种到新鲜的培养基中,连续培养8 d,每天取样计数绘制生长曲线;隔天取样,稀释藻浓度在200 μg/L,对样品进行暗适应20 min[17],利用Multi-Color-PAM测量叶绿素荧光参数。参考文献[18-19]方法以440 nm LED测量光测量小球藻光系统Ⅱ (PS Ⅱ)的最大量子产量(Fv/Fm)。用440 nm的光及每30 s一个光强梯度测定Y(Ⅱ)光响应曲线。

2 结果与分析 2.1 小球藻C. sorokiniana对潮霉素的敏感性

本实验所用的C. sorokiniana对潮霉素具有较强的敏感性,在培养至第7天时,除潮霉素含量为15 μg/mL和20 μg/mL的平板上均有藻落长出,继续培养1周后,15 μg/mL和20 μg/mL的平板上仍没有藻落生长,与王逸云[13]、周琨[14]及陈颖等[12]的报道有较大差异,可能是小球藻不同种间对潮霉素的差异较大,同时培养基成分也影响了小球藻的抗性。本实验选择15 μg/mL用于后期转ATLEC2基因小球藻C. sorokiniana的筛选。

2.2 转ATLEC2基因藻株的筛选及PCR鉴定

转化后的C. sorokiniana在含15 μg/mL潮霉素的BG11平板上培养7 d后有藻落长出,而原始藻株没有生长,挑取单藻落转接到BG11液体培养基进行传代培养。培养3代后提取基因组DNA进行PCR鉴定,经琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图 1A,载体质粒与转化藻株均扩增出1 089 bp片段的目的基因,而原始藻株没有条带。结果表明目的基因已成功导入宿主细胞,并获得稳定遗传。

图 1 转基因C. sorokiniana PCR (A)及RT-PCR检测检测(B) Figure 1 PCR (A) and RT-PCR (B) analysis of transgenic C. sorokiniana. M: marker DL2000; L: pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2 plasmid L2: transgenic C. sorokiniana; D: wild type.
2.3 转基因藻株的RT-PCR鉴定

提取转基因藻株总RNA进行RT-PCR分析,检测ATLEC2基因在宿主中的转录情况。结果如图 1B所示,RT-PCR扩增出1 089 bp片段,与目的基因大小一致。表明外源基因ATLEC2在小球藻C. sorokiniana中已转录表达。

2.4 转ATLEC2基因藻株的Western blotting分析

在构建pCIMBIA1300-35s-GFP-ATLEC2载体时ATLEC2基因与gfp序列融合,提取转ATLEC2基因藻株蛋白,利用anti-GFP作为一抗进行Western blotting分析,结果显示转基因藻株有明显条带,大小略高于tubulin,目测在60 kDa左右,说明ATLEC2C. sorokiniana中翻译表达(图 2)。

图 2 转基因C. sorokiniana GFP蛋白的Western blotting分析 Figure 2 Western blotting analysis of GFP protein in transgenic C. sorokiniana. L2: ATLEC2 transgenic C. sorokiniana; D: wild type.
2.5 转ATLEC2基因小球藻脂肪酸组成及含量分析

将藻粉送科标技术(青岛)研发中心检测转ATLEC2基因小球藻及对照藻脂肪酸组成,如表 1所示,表中数据为3次测试的平均值,根据单因素方差分析,转基因藻株与对照藻株的总油脂含量差异极显著,L2/D列表示两者的差异倍数。从检测结果可以看出,小球藻C. sorokiniana中脂肪酸的主要成分为十八碳脂肪酸和十六碳脂肪酸,两者占总脂肪酸的97%左右;转基因藻株和对照藻株的总脂肪含量分别为5.43%和2.56%,转基因藻株为对照株的2倍多,说明拟南芥LEC2在小球藻C. sorokiniana中的表达促进了其脂类的积累。

表 1ATLEC2基因C. sorokiniana脂肪酸分析 Table 1 Fatty acid analysis of ATLEC2 transgenic C. sorokiniana
Fatty acid component (mg/kg) D L2 L2/D
 C14:0 (Myristic) 86.3 220.3 2.6
 C15:0 (Pentadecanoic) 42.8 96.1 2.2
 C16:0 (Palmitic) 8 592.0 18 217.2 2.1
 C17:0 (Margaric) 142.1 394.3 2.8
 C17:1(Margaroleic) 205.2 414.1 2.0
 C18:0 (Stearic) 1 296.4 2 343.3 1.8
 C18:1n9 (Oleic) 706.1 1 245.3 1.8
 C18:2n6 (Linoleic) 8 794.0 23 097.3 2.6
 C18:3n3 (Linolenic) 5 527.4 7 483.7 1.4
 C20:0 (Arachidic) 112.2 417.1 3.7
 C20:1 (Eicosenic cis 11) 4.1 10.9 2.7
 C20:2 (Eicosadienoic) 20.5 43.0 2.1
 C20:3n6(g-Eicosatrienoic) 13.4 19.1 1.4
 C21:0 (Heneicosanoic) 9.8 20.2 2.1
 C22:0 (Behenic) 28.4 107.4 3.8
 C23:0 (Tricosanoic) 14.8 37.2 2.5
 C24:0 (Lignoceric) 42.5 132.3 3.1
 Total 25 638 54 298.8 2.1
2.6 转基因藻株光合及生长状况分析

转基因藻株的生长曲线如图 3,转基因藻株与对照藻株的生长曲线非常接近,转基因藻株的细胞密度略高于对照藻株。

图 3 L2转基因小球藻与野生株的生长曲线 Figure 3 Growth curve of transgenic C. sorokiniana and wild type. L2: ATLEC2 transgenic C. sorokiniana; D: wild type.

Fv/Fm为PS Ⅱ的最大量子效率,反映植物潜在最大光合能力,植物受到胁迫(Stress)时,Fv/Fm会显著下降[18],通过对转基因藻株和对照株培养第2(D2)、4(D4)、6(D6)、8(D8) 天Fv/Fm的检测发现,两者之间没有显著差异(图 4)。Y(Ⅱ)为PSⅡ有效量子产量,表示PSII的实际光合效率,是光合性能最主要的指示器之一[18],对转基因藻株和对照株培养第2、4、6、8天的Y(Ⅱ)光响应曲线分析(图 5)可看出,第4天两者的光曲线几乎完全重合,第2、6、8天转基因藻株Y(Ⅱ)的光曲线略高,但是两者没有明显差异。

图 4 转基因小球藻及野生藻株最大量子产量检测 Figure 4 Measurement of PSII maximum quantum yield in transgenic C. sorokiniana and wild type. L2: ATLEC2 transgenic C. sorokiniana; D: wild type.
图 5 转基因小球藻及野生藻株的Y(Ⅱ)典型光响应曲线检测 Figure 5 Measurements of Typical Light Curves of PS Ⅱ quantum yields Y(Ⅱ) in transgenic C. sorokiniana and Wild type. L2: ATLEC2 transgenic C. sorokiniana; D: wild type.

通过对转基因藻株生长曲线及光合参数的比较表明,在本实验培养条件下转基因藻株的生长及光合性能没有出现显著变化。

3 讨论

通过基因工程改造的方法获得高产藻株是微藻生物柴油产业化的重要途径。目前主要是通过对油脂代谢路径上相关酶的基因的操作提高微藻中的油脂含量,例如,Xue等[4]通过超表达苹果酸脱氢酶增加了蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa的油脂积累;Trentacostea等[19]通过敲除一个多功能的脂肪酶/磷脂酶/酰基转移酶增加了假微型海链藻Thalassiosira pseudonana中油脂的积累;Niu等[20]在三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中超表达酯酰辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶促进了其油脂的合成;Fan等[21]C. pyrenoidosa中超表达来自拟南芥的NAD (H)激酶,使细胞内的油脂含量增加了110.4%。相较于对某个酶单一基因的改造,转录因子的调节更有优势,Zhang等[22]将大豆转录因子GmDof4转入小球藻Chlorella ellipsoidea中,使其油脂含量由46.4%提高到52.9%;Shang等[23]从巴夫杜氏藻Dunaliella parva中鉴定出了转录因子Wri1,Wri1是调节植物脂肪酸及甘油三酯(TAG)合成的重要转录因子,并且发现Wri1的表达受氮胁迫诱导。微藻的油脂积累涉及糖酵解、脂肪酸合成、TAG的合成等多条代谢路径[24],LEC2能上调编码参与脂肪酸及TAG合成相关酶的基因的表达,同时还提高了其他转录因子的表达[25],具有级联放大效应。

本研究从拟南芥中获取LEC2基因,并通过基因枪介导转化小球藻C. sorokiniana,经PCR、RT-PCR及Western blotting分析,ATLEC2基因成功转入C. sorokiniana中并获得稳定表达。通过对原始对照藻株及转ATLEC2基因藻株的总脂肪酸含量分析,原始藻株和转ATLEC2基因藻株脂肪酸含量分别为2.56%和5.43%;与原始藻株相比,转ATLEC2基因藻株的脂肪酸含量提高了1倍;通过对转基因藻株及野生藻株生长曲线及光合参数的比较表明在本实验培养条件下转ATLEC2基因对小球藻C. sorokiniana的生长及光合没有显著影响以上结果说明在小球藻C. sorokiniana中,拟南芥转录因子LEC2促进了藻体内油脂的生物合成,关于调控机理本实验室正在研究中。

参考文献
[1] Chisti Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv, 2007, 25(3): 294–306. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2007.02.001
[2] Wu XD, Ruan RS, Du ZY, et al. Current status and prospects of biodiesel production from microalgae. Energies, 2012, 5(12): 2667–2682. DOI: 10.3390/en5082667
[3] Jambo SA, Abdulla R, Azhar SHM, et al. A review on third generation bioethanol feedstock. Renew Sust Energy Rev, 2016, 65: 756–769. DOI: 10.1016/j.rser.2016.07.064
[4] Xue J, Wang L, Zhang L, et al. The pivotal role of malic enzyme in enhancing oil accumulation in green microalga Chlorella pyrenoidosa. Microb Cell Fact, 2016, 15: 120. DOI: 10.1186/s12934-016-0519-2
[5] Guarnieri MT, Nag A, Yang SH, et al. Proteomic analysis of Chlorella vulgaris: potential targets for enhanced lipid accumulation. J Proteomics, 2013, 93: 245–253. DOI: 10.1016/j.jprot.2013.05.025
[6] Mendoza MS, Dubreucq B, Miquel M, et al. LEAFY COTYLEDON 2 activation is sufficient to trigger the accumulation of oil and seed specific mRNAs in Arabidopsis leaves. FEBS Lett, 2005, 579(21): 4666–4670. DOI: 10.1016/j.febslet.2005.07.037
[7] Angeles-Nú ez JG, Tiessen A. Mutation of the transcription factor LEAFY COTYLEDON 2 alters the chemical composition of Arabidopsis seeds, decreasing oil and protein content, while maintaining high levels of starch and sucrose in mature seeds. J Plant Physiol, 2011, 168(16): 1891–1900. DOI: 10.1016/j.jplph.2011.05.003
[8] Kim HU, Lee KR, Jung SJ, et al. Senescence-inducible LEC2 enhances triacylglycerol accumulation in leaves without negatively affecting plant growth. Plant Biotechnol J, 2015, 13(9): 1346–1359. DOI: 10.1111/pbi.12354
[9] Andrianov V, Borisjuk N, Pogrebnyak N, et al. Tobacco as a production platform for biofuel: overexpression of Arabidopsis DGAT and LEC2 genes increases accumulation and shifts the composition of lipids in green biomass. Plant Biotechnol J, 2010, 8(3): 277–287. DOI: 10.1111/pbi.2010.8.issue-3
[10] Nookaraju A, Pandey SK, Fujino T, et al. Enhanced accumulation of fatty acids and triacylglycerols in transgenic tobacco stems for enhanced bioenergy production. Plant Cell Rep, 2014, 33(7): 1041–1052. DOI: 10.1007/s00299-014-1582-y
[11] Kim HU, Jung SJ, Lee KR, et al. Ectopic overexpression of castor bean LEAFY COTYLEDON2 (LEC2) in Arabidopsis triggers the expression of genes that encode regulators of seed maturation and oil body proteins in vegetative tissues. FEBS Open Bio, 2013, 4: 25–32.
[12] Chen Y, Li WB, Zhang LM, et al. Study on sensitivities of Chlorella ellipsoidea to 5 antibiotics in genetic engineering. Oceanol et Limnol Sin, 1999, 30(5): 500–505. (in Chinese).
陈颖, 李文彬, 张利明, 等. 小球藻对5种常用基因工程抗生素的敏感性研究. 海洋与湖沼, 1999, 30(5): 500-505.
[13] Wang YY, Wang CH. Study of selectable markers in genetic engineering of Chlorella sp. J Dalian Univ Technol, 2007, 47(4): 509–514. (in Chinese).
王逸云, 王长海. 小球藻基因工程选择标记研究. 大连理工大学学报, 2007, 47(4): 509-514.
[14] Zhou K, Lu QN, Yue M. Establishment of sterile culture system of Chlorella pyrenoidosa. J Anhui Agric Sci, 2015, 43(19): 14–17. (in Chinese).
周琨, 卢其能, 岳明. 蛋白核小球藻无菌培养体系的建立. 安徽农业科学, 2015, 43(19): 14-17. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2015.19.007
[15] Talebi AF, Tohidfar M, Tabatabaei M, et al. Genetic manipulation, a feasible tool to enhance unique characteristic of Chlorella vulgaris as a feedstock for biodiesel production. Mol Biol Rep, 2013, 40(7): 4421–4428. DOI: 10.1007/s11033-013-2532-4
[16] Liu J, Sun Z, Gerken H, et al. Genetic engineering of the green alga Chlorella zofingiensis: a modified norflurazon-resistant phytoene desaturase gene as a dominant selectable marker. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(11): 5069–5079. DOI: 10.1007/s00253-014-5593-y
[17] Shin WS, Lee B, Jeong BR, et al. Truncated light-harvesting chlorophyll antenna size in Chlorella vulgaris improves biomass productivity. J Appl Phycol, 2016, 28(6): 3193–3202. DOI: 10.1007/s10811-016-0874-8
[18] Lin L, Feng C, Li QY, et al. Effects of electrolysis by low-amperage electric current on the chlorophyll fluorescence characteristics of Microcystis aeruginosa. Environ Sci Pollut Res Int, 2015, 22(19): 14932–14939. DOI: 10.1007/s11356-015-4708-z
[19] Trentacostea EM, Shresthaa RP, Smitha SR, et al. Metabolic engineering of lipid catabolism increases microalgal lipid accumulation without compromising growth. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(49): 19748–19753. DOI: 10.1073/pnas.1309299110
[20] Niu YF, Zhang MH, Li DW, et al. Improvement of neutral lipid and polyunsaturated fatty acid biosynthesis by overexpressing a type 2 diacylglycerol acyltransferase in marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Mar Drugs, 2013, 11(11): 4558–4569. DOI: 10.3390/md11114558
[21] Fan JH, Ning K, Zeng XW, et al. Genomic foundation of starch-to-lipid switch in oleaginous Chlorella spp.. Plant Physiol, 2015, 169(4): 2444.
[22] Zhang JH, Hao Q, Bai LL, et al. Overexpression of the soybean transcription factor GmDof4 significantly enhances the lipid content of Chlorella ellipsoidea. Biotechnol Biofuels, 2014, 7(1): 128.
[23] Shang CH, Bi GC, Yuan ZH, et al. Discovery of genes for production of biofuels through transcriptome sequencing of Dunaliella parva. Algal Res, 2016, 13: 318–326. DOI: 10.1016/j.algal.2015.12.012
[24] Li L, Zhang GQ, Wang QH. De novo transcriptomic analysis of Chlorella sorokiniana reveals differential genes expression in photosynthetic carbon fixation and lipid production. BMC Microbiol, 2016, 16: 223. DOI: 10.1186/s12866-016-0839-8
[25] Baud S, Mendoza MS, To A, et al. WRINKLED1 specifies the regulatory action of LEAFY COTYLEDON2 towards fatty acid metabolism during seed maturation in Arabidopsis. Plant J, 2007, 50(5): 825–838. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2007.03092.x