β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β-型氨基酸，也是一种非蛋白氨基酸，存在于某些细菌、真菌和植物中^[1]。β-丙氨酸及其衍生物在医药、食品、化工等领域都有着广泛的应用。在医药方面，β-丙氨酸用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠和巴柳氮等^[2]；在化工方面应用于电镀、铅中毒解毒剂及合成甜味剂^[3]。国内外β-丙氨酸的生产主要以化学合成法为主^[4]，即以丙烯酸或丙烯腈为底物进行合成，此法生产过程中消耗大量能量，同时对环境和生物体都有一定的毒害作用。另一种生产方法是生物合成法，利用L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate α-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)、以L-天冬氨酸为底物催化生成β-丙氨酸^[5]，此法专一性高且环保，缺点是L-天冬氨酸价格偏高。

L-天冬氨酸α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱去α位的羧基生成β-丙氨酸，是生物体内泛酸合成途径中重要的酶。诸多报道对不同来源的PanD进行了详细的研究^[6-8]，其中来源于谷氨酸棒杆菌的PanD酶是一类依赖于丙酮酰基的四聚体脱羧酶，其特点为酶活高且能够在菌体内进行自裂解。酶法制备β-丙氨酸的研究中，浙江工业大学张潇潇^[9]通过将钝齿棒杆菌来源panD基因重组到大肠杆菌中进行表达并优化条件，最终β-丙氨酸的产量达到76.47 mg/L；华东理工大学范海洋^[10]优化大肠杆菌来源PanD重组菌，将产量提高至130 mg/L；浙江工业大学楼坚等^[11]最终将发酵液中β-丙氨酸的产量提高至649 mg/L。

工业生产天冬氨酸，主要是由天冬氨酸酶(L-Aspartase，EC4.3.1.1，AspA)催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸。大肠杆菌来源AspA由4个相同的亚基组成，单体分子量为50 kDa左右。AspA催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸的反应为可逆反应，所以富马酸不能完全转化为L-天冬氨酸^[12-13]。

因为富马酸价格较天冬氨酸低廉，本研究以富马酸和氨水为底物，构建AspA和PanD双酶偶联制备β-丙氨酸体系。通过条件优化，确定了最适酶比例和最适底物浓度，使整个反应体系中无中间产物L-天冬氨酸积累，将价格低廉的富马酸转化为目的产物。本研究为制备β-丙氨酸提供了新的思路与方法。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与培养基

重组菌株E. coli BL21 pET-28a-aspA和E. coli BL21 pET-24a-panD，均为实验室前期构建。

E. coli的种子培养基为Luria-Bertani (LB)培养基，诱导培养基为Terrific-Broth (TB)培养基。

1.1.2 生化试剂

富马酸、L-天冬氨酸钠、β-丙氨酸均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法 1.2.1 PanD酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD接种于4 mL卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1%的接种量接种于含卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6–0.8，加入IPTG至终浓度0.8 mmol/L，37 ℃诱导培养16–20 h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法^[14]分析鉴定重组蛋白表达水平。

1.2.2 AspA酶的表达

将重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA接种于4 mL卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1%的接种量接种于含卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.6–0.8，加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，24 ℃诱导培养16–20 h，收集菌体超声破碎，通过SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白表达水平。

1.2.3 重组蛋白的纯化和鉴定

将重组菌体溶于结合缓冲溶液(50 mmol/L Na₂HPO₄、50 mmol/L NaH₂PO₄、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超声破碎，离心，上清用0.22 μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡5 mL的His Trap HF柱，取20 mL的破碎上清上样，用10倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500 mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品后用透析袋密封，置于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0) 中4 ℃透析6–8 h，去除残余咪唑，并用SDS-PAGE分析鉴定。

1.2.4 蛋白浓度的测定

蛋白质定量采用常规的Bradford法^[15]。

1.2.5 L-天冬氨酸及β-丙氨酸的测定

反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500 μL反应液于1.5 mL离心管，加入250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液和250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5 h，加入700 μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1 min，静置30–60 min，吸取下层溶液，经0.22 μm有机滤膜过滤，进样量为10 μL^[16]。

β-丙氨酸衍生产物用HPLC测定^[17]。色谱柱为La Chrom C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A溶液为80% (V/V)已腈水溶液，B溶液为97:3 (V/V，pH 6.5) 的0.1 mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0–20 min，B溶液由95%下降到65%；20–30 min，B液由65%上升到95%；30–35 min，B溶液梯度不变。检测波长为254 nm，柱温为40 ℃。所测得衍生产物的含量等同于衍生前物质的含量。

1.2.6 富马酸的测定

反应液经0.22 μm有机滤膜过滤后用HPLC检测，色谱柱为Prevail Organic Acid (OA)有机酸分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流动相为20%甲醇溶液(磷酸调pH至2.2)，流速为0.6 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为40 ℃，检测时间为15 min，进样量为10 μL。

1.2.7 AspA催化富马酸生成L-天冬氨酸

取20 μL AspA酶液(0.5 mg/mL)加到终浓度为50 mmol/L的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7.0) 缓冲液中，然后在该体系中加入100 μL浓度为500 mmol/L的富马酸(NH₄调pH至7.0)、10 μL浓度为100 mmol/L的MgCl₂、无菌水补足1 mL反应体系，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测产物生成量。

1.2.8 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸反应进程的测定

取200 μL PanD酶液(2 mg/mL)加到终浓度为50 mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.0) 中，然后在该体系中加入100 μL浓度为500 mmol/L的L-天冬氨酸溶液，最后用无菌水补足至1 mL反应体系，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测产物生成量。

1.2.9 双酶串联反应

在含有一定浓度的底物富马酸和足量氨(调pH至7.0) 的10 mL反应液中，加入一定比例的两种酶，反应体系中含有1 mmol/L的MgCl₂，50 mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 7.0)，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算β-丙氨酸的产率。

2 结果与分析 2.1 酶的表达和纯化

携带aspA和panD目的基因的重组大肠杆菌经IPTG诱导后表达，细胞超声破碎后的细胞破碎液经亲和柱纯化后，得到电泳纯的重组蛋白。结果如图 1A所示，纯化后的AspA蛋白为50 kDa左右，与AspA的理论分子量一致。

Tris-tricine电泳(图 1B)结果显示大部分PanD单体已自身裂解为α亚基(12.4 kDa)和β亚基(2.8 kDa)。β亚基在Tris-tricine凝胶上发生一定的迁移，是由于分子量小的蛋白形成球形，其较高的多肽内部的电荷不能被结合的SDS电荷所覆盖，所以偏离了相对迁移率和分子量对数的相互关系。电泳结果表明，在大肠杆菌中成功表达了大肠杆菌来源的aspA和谷氨酸棒杆菌来源的panD。

2.2 双酶偶联催化富马酸生成β-丙氨酸 2.2.1 AspA催化富马酸加氨生成L-天冬氨酸

10 μg/mL的AspA纯酶催化50 mmol/L的富马酸，结果如图 2所示。催化反应在2 h后即达稳定状态，由于该反应是可逆反应，即使延长反应时间，L-天冬氨酸的摩尔产率仍为75%。

2.2.2 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸

400 μg/mL PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的反应情况如图 3所示，50 mmol/L底物可在8 h内完全转化为L-天冬氨酸，转化率约为98%。

2.3 优化两种酶比例

上述结果可知，PanD的酶活较AspA低，催化反应进行较慢，是双酶体系中的限速酶。PanD的最适反应温度为55 ℃，最适pH为7.0左右^[18]，而AspA的最适条件分别为55 ℃和pH 8.0左右^[19]。由于偶联反应时间较长，考虑到蛋白酶在55 ℃条件下的反应12 h酶活损失严重，设定双酶偶联体系反应条件为37 ℃、pH 7.0。

在双酶偶联催化体系中，固定富马酸浓度为50 mmol/L，AspA的添加浓度为10 μg/mL，调整PanD的添加量，使AspA与PanD的加酶质量比分别为1:40、1:60、1:80，进行双酶偶联反应。

结果如图 4所示，在1:40和1:60 (W/W)的反应体系中，反应8 h，β-丙氨酸的产率只有82%和93%，且尚有部分中间产物未完全转化，留在反应体系中，反应至12 h，1:40的反应体系中仍有中间产物。

而在1:80的反应体系中，反应8 h，富马酸可完全转化为β-丙氨酸，β-丙氨酸的产率 > 95%，中间产物L-天冬氨酸无残余。

随着PanD浓度的提高，β-丙氨酸的合成速度大大增加，且中间产物L-天冬氨酸的残余量减少。综合考虑选择1:80 (W/W)作为最适浓度比。

2.4 优化底物富马酸浓度

前期研究以50 mmol/L的富马酸为底物进行酶促反应研究，此浓度无法满足高浓度制备β-丙氨酸的要求，故将AspA和PanD按照1:80 (W/W)的比例催化浓度为50、100、200 mmol/L的富马酸，HPLC检测β-丙氨酸含量(表 1)。同时监测了200 mmol/L富马酸反应进程中富马酸、天冬氨酸与β-丙氨酸的变化情况(图 5)。

表 1结果显示，底物浓度为50 mmol/L时，酶促反应能在8 h内转化率达100%；底物浓度为100 mmol/L时，8 h内摩尔生成率为90%，合成β-丙氨酸的浓度为90 mmol/L，24 h后β-丙氨酸的产率在95%左右；当底物浓度增加至200 mmol/L时，反应速度明显减缓，8 h内β-丙氨酸的摩尔生成率为62%，体系中β-丙氨酸的浓度为126 mmol/L，延长反应时间至24 h后，β-丙氨酸的摩生成尔率为70%。图 5结果显示底物浓度为200 mmol/L时，反应12 h后残余约40 mmol/L的中间产物L-天冬氨酸，我们推测是由于高浓度的β-丙氨酸对PanD酶有抑制作用，使得β-丙氨酸得率在高浓度底物条件下反而降低至62%。

双酶偶联酶促反应的转化率随着时间的延长而增加，但由于反应逐渐趋于平衡，且振荡反应过程中部分酶会失活，24 h后反应体系中可明显观察到白色悬浮物，推断为蛋白酶变性沉淀。

3 结论

本文利用AspA和PanD构建双酶偶联反应体系，催化底物富马酸合成β-丙氨酸。通过优化反应条件，确定最佳反应条件：100 mmol/L富马酸，AspA与PanD比例为1:80，其中AspA的浓度为10 μg/mL，温度37 ℃，pH 7.0。此条件下，8 h时β-丙氨酸的浓度为90 mmol/L，约合7 g/L。提高富马酸浓度为200 mmol/L，8 h底物的摩尔生成率为63%，β-丙氨酸的浓度约为126 mmol/L，约合10 g/L，相较之前的研究有显著的提高。然而就工业生产而言，β-丙氨酸的产量仍有很大提升空间。有文献报道真核来源的PanD酶具有更高的催化活性，下一步将考虑用真核来源PanD酶替代谷氨酸棒杆菌来源的PanD酶，进一步提高β-丙氨酸的产量。同时，细胞催化具有可重复利用、操作简便等优点，建立并优化全细胞催化工艺是下一步研究方向。