脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶(3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS) [EC: 2.5.1.55]是2-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(CMP-KDO)合成途径中的一种关键酶^[1]，其基因表达及酶活性高低直接影响到革兰氏阴性菌Gˉ细胞壁的合成，对于植物细胞壁合成同样重要，可对植物花粉管、芽的生长、伸长等有重要调控作用^[2]。

KDO8PS属于醛缩酶超家族蛋白，分布于革兰氏阴性菌Gˉ及植物细胞，主要负责催化磷酸烯醇式丙酮酸与α-阿拉伯糖-5-磷酸产生2-酮-3-脱氧辛糖8磷酸(KDO8P)，并释放无机磷酸(Pi)。其中产物2-酮-3-脱氧辛糖-8-磷酸是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)的前体^[3-5]。研究表明在已知众多致病革兰氏阴性菌中，Lipid A是内毒素的物质基础，其O-抗原的多样性决定了Gˉ表面抗原决定簇的多样性，这也是致病菌产生抗药性的物质基础之一^[6]。而KDO是脂多糖(LPS)组分中必需的八碳糖，它连接类脂A (Lipid A)与O-特异侧链共同嵌入细胞壁的外膜上^[7]。通常Lipid A与两个KDO残基组成的脂多糖(LPS)构成革兰氏阴性菌外膜的外壳，这种外壳对革兰氏阴性菌细菌细胞膜的完整性及侵染至关重要。基于这种Gˉ细胞壁的构成特点，如阻断KDO的生物合成，能破坏Gˉ的细胞壁合成，并避免致病菌产生耐药性。因此，基于Gˉ细菌KDOPS开展相关抑制剂筛选，进而开发新的抗生素药物是目前KDO8PS的研究热点^[8]。同样，在植物细胞中，KDO8PS所催化的终产物KDO主要是高等植物细胞壁以及一些绿色藻类植物细胞壁果胶多糖鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ (RG-Ⅱ)的重要组分^[9-10]。因此，了解植物KDO8PS的结构与功能，不仅有助于完善植物细胞壁生物合成的代谢途径，而且对于未来新型抗Gˉ菌农药的开发也具有重要应用价值。但植物KDO8PS相关研究尚处于起步阶段，阻碍了该酶的进一步应用。

截止到目前尚未有植物KDO8PS结构的报道，查询PDB数据库发现，植物中KDO8PS晶体结构还尚未解析^[11]，但已有多个微生物来源的KDO8PS晶体结构被解析，从其晶体学结构可以看到该酶是一个同源四聚体，其中每个单体都含有(β/α)8桶状折叠。依据结构的活性位点特性分析，单体中PEP与A5P被预测结合于KDO8PS的磷酸位点13 Å 部分^{[3, 5-6, 12-13]}。微生物来源的KDO8PS酶依据催化是否需金属离子参与，分为金属依赖性和非金属依赖性2类，但其催化机制基本相同。KDO8PS发生催化反应需2个底物，该酶与底物结合的顺序首先是PEP的靠近以及定向结合在酶的结合位点，释放产生1分子无机磷酸，并引起酶构象的改变形成一个过渡态结构，然后此过渡态结构再同A5P结合，完成催化最终产生KDO8P^[14-17]。

植物来源的KDO8PS研究在拟南芥中首先获得突破，已成功分离鉴定出2个编码KDO8PS的旁系同源基因AtKDSA1和AtKDSA2，经荧光定量分析，发现在成熟的花中，负责合成KDO8PS的AtKDSA2基因的表达量明显增高，推测其对花粉管的生长和伸长具有一定的作用^[2]。尽管酶催化活性位点氨基酸保守，植物KDO8PS催化作用机制与微生物的类似，但不同来源的KDO8PS酶，一级结构序列间差异显著，会导致酶空间结构的变化，则相应的酶催化活性、热稳定性、催化反应pH等存在何种功能差异仍需深入研究。

本研究在毛竹KDO8PS基因克隆的基础上，着重进行KDO8PS的原核表达、蛋白纯化，溶液中酶的状态及酶学性质研究，研究结果不仅为后续植物来源KDO8PS基因功能及晶体学结构解析奠定了基础，而且对于今后植物八碳糖的生物合成及新型植物农药研发具有重要应用价值。

大肠杆菌Escherichia coli菌株DH5α和BL21(DE3)、原核表达载体pET-HTT均由本实验室保存；RNA提取试剂/Trigol购自北京鼎国生物公司；AMV酶反转录试剂盒、BamHⅠ、EcoR Ⅰ、T4 DNA连接酶和pMD18-T simple vector购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工公司。A5P与PEP购自Sigma (美国)；其他试剂均为国产分析纯。

高压蒸汽灭菌器(SANYO MLS-3750)、PCR仪(Gene Amp^® PCR System 9700)、离心机(Himac CF 16RX versatile Compact Centrifuge)、PYX-DH350恒温培养箱、GL-25M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、AKTA纯化仪器、酶标仪、Beckman/Coulter XL-A分析超速离心(AUC)仪。

采用Trigol试剂盒提取毛竹新鲜实生苗的总RNA，所得RNA用AMV酶反转录试剂盒合成cDNA置于–80 ℃冰箱储存备用。

通过NCBI数据库获得双子叶植物拟南芥Arabidopsis thaliana、单子叶植物水稻(Oryza sativa) KDSA基因序列(GenBank Accession No. NM_001035978.2, XM_015763128.1)，根据该基因的保守序列设计PCR引物。上游引物A: 5′-CG GGATCCATGGATGCTTCGTCC-3′ BamHⅠ酶切位点，下游引物B: 5′-GGAATTCTCATTCCTGGA ATGGAGTGAGGT-3′ EcoRⅠ酶切位点，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以毛竹实生苗cDNA为模板，采用PCR上游和下游引物配对进行扩增。PCR反应体系为：10×缓冲液2 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1 μL，dNTPs (各2.5 mmol/L) 1 μL，cDNA (0.05 μg/L) 1 μL，rTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL，加水至总体积为20 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共32个循环；72 ℃延伸8 min。PCR产物电泳分析后经DNA胶回收试剂盒回收，将回收的DNA片段连接到pMD18-T simple vector载体上，转化大肠杆菌DH5α菌株，经菌液PCR检测，阳性克隆测序验证。

序列分析及引物设计使用VectorNTI软件完成。

将含有目的基因的pMD18-T载体质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ限制性双酶切，回收876 bp的目的DNA片段。插入经同样酶切后的pET-HTT表达载体，得到一个C-末端含有6个His亲和标签的重组子。将重组质粒经热击转化到大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)和BL21(DE3)感受态细胞，经菌液PCR鉴定阳性克隆，并测序验证。挑取单克隆，接入LB液体培养基37 ℃培养，当菌体OD₆₀₀达到0.5时，加入0.4 mmol/L IPTG诱导，37 ℃摇床上诱导14 h，收集菌体。超生裂解不同温度收集的菌体，SDS-PAGE检测蛋白可溶表达情况。

将菌体重悬在25 mL PBS裂解缓冲液(含30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl)，加入50%甘油至终浓度5%，超生破碎(on/off 8 s/8 s、总时间15 min、功率40%)，4 ℃、17 000 r/min离心30 min，将上清转移至预先平衡过的镍，4 ℃结合30 min后，用Buffer A (30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑)洗杂蛋白，1倍体积Buffer B (30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白溶液在10 kDa浓缩柱中浓缩后进行分子筛层析。分子筛使用Superose 12 10/300 GL柱，用Buffer C (30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl)洗脱，根据出峰的大小顺序，在目标蛋白峰处每500 μL收集一管，SDS-PAGE检测每管的纯度，将蛋白浓缩到5 mg/mL，–80 ℃保存备用。

戊二醛与相邻的蛋白分子上的氨基反应，而产生交联形成稳定的共价键。为了检测PeKDO8PS蛋白的体外同源互作，本实验以PBS缓冲液(pH 8.0)作为交换溶液去除KDO8PS中的Tris-HCl，将KDO8PS稀释到500 μg/mL，同时将戊二醛稀释到2.4 mmol/L。KDO8PS与戊二醛以1:6的摩尔比混合置于室温中，此混合液依据交联时间的不同分为交联0、10、30、90 min组，此反应由1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)终止，其中Tris-HCl的最终浓度为500 mmol/L，终止时间为10 min。分别取20 μL样品加入5 μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸10 min后点样10% SDS-PAGE，分析蛋白交联情况。

用30 mmol/L Tris (pH 8.0)，200 mmol/L NaCl混合液稀释目的蛋白光吸收(OD₂₆₀)至0.4，选择An60Ti转子，置于Beckman/Coulter XL-A，20 ℃、50 000 r/min离心8 h，分析酶多聚类型。对沉降速度数据参照C(S)即沉降系数函数模型利用Sedfit拟合推算待测样品分子质量。

取50 μL含3 mmol/L PEP，3 mmol/L A5P以及100 mmol/L Tris/acetate缓冲液，加入终浓度100 nmol/L的酶液。分别测定酶催化的最适反应温度及pH。最适反应温度测定：将反应温度控制在20-80 ℃范围内，每间隔10 ℃下进行酶促反应(pH 8.0)，然后测定酶活，酶活测定方法参照比色测定法^[18](具体方法略)。最高酶活性设为100%，用来计算相对酶活性的变化。最适pH测定：在37 ℃条件下，pH 4.0-9.0范围内每隔0.5测定酶活，每个样品设3个平行组，结果取平均值。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。金属离子及酶抑制剂对酶活性的影响：分别取浓度为100 mmol/L的Cu²⁺、Zn²⁺、Se²⁺、Li⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe³⁺、Co²⁺等11种金属离子及金属蛋白酶抑制剂EDTA分别与酶液混合，使离子终浓度为5 mmol/L，以未经处理的酶液的酶活力为100%作对照，在最适反应条件下测定酶活。以上3组类型实验每个样品均为3次重复处理，利用EXECL绘制相关曲线及柱形图。

以毛竹总RNA反转录合成的cDNA为模板，经PCR扩增后，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶(含EB)中电泳后，用凝胶成像分析系统分析在900 bp左右有1条亮带，与预测的基因片段大小相符。将此片段回收与pMD18-T simple连接后，经菌液PCR验证后的阳性菌落测序，结果表明插入片段为876 bp，含有一个完整ORF，编码291个氨基酸，氨基酸序列Blast分析发现毛竹KDO8PS属于脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶超家族，其中与水稻、拟南芥、大肠杆菌KODO8PS序列的一致性分别达到95%、84%和43%，第260-270位为脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶保守区，等电点为7.7，分子量为32 kDa。

重组载体转化表达菌株Rosetta^TM(DE3)和BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达后超声破碎，分别取上清、沉淀，加入上样缓冲液，95 ℃变性后，SDS-PAGE变性胶电泳分析，在电泳图谱32 kDa处发现一条明显的表达条带，并且对比分析发现表达菌株Rosetta^TM(DE3)较BL21(DE3)在37 ℃培养温度下表达量相对高些，故在后续试验中确定表达菌株Rosetta^TM(DE3)在37 ℃为重组蛋白诱导表达的最佳宿主菌株(图 1)。SEC洗脱峰在66 kDa位置出现明显的二聚体峰，132 kDa处出现较弱四聚体峰。说明KDO8PS在洗脱溶液(30 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl)中主要以二聚体形式存在(图 2A)。经分子筛(SEC)层析纯化后纯度90%以上(图 2B)，可用于后续酶特性实验分析。

图 1 PeKDO8PS分别在表达菌株RosettaTM(DE3)和BL21(DE3)中的表达 Figure 1 Prokaryotic expression of PeKDO8PS in RosettaTM(DE3) and BL21(DE3) host cells. M: molecular mass standards (kDa); Lane 1, 2: CK, cell supernatant not induced by IPTG in RosettaTM(DE3) and BL21(DE3) cells respectively; Lane 3, 4: cell pellet/supernatant induced by IPTG at 37 ℃ in RosettaTM(DE3); Lane 5, 6: cell pellet/supernatant induced by IPTG at 37 ℃ in BL21(DE3) cells.

图选项

图 2 PeKDO8PS分子筛层析(A)及SDS-PAGE检测(B) Figure 2 The purification of PeKDO8PS by size exclusion chromatography (A) and identification by SDS-PAGE (B).

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戊二醛有2个醛基，可以同蛋白分子上的氨基反应，产生交联形成稳定的共价键，产生不同多聚体状态。PeKDO8PS经戊二醛交联，SDS-PAGE检测后发现，在33、65、100和130 kDa左右均发现条带，依据单体分子量(理论值32 kDa)推断，交联后可形成二聚体、三聚体及四聚体蛋白(图 3)。另外，随着交联反应时间酶单体的量逐渐减少，二聚体、三聚体、四聚体的量明显增加。说明戊二醛作用下，PeKDO8PS存在的不同蛋白聚合体形式均有机会发生。

图 3 PeKDO8PS戊二醛交联检测 Figure 3 The cross-linking of KDO8PS with glutaraldehyde. M: protein standard marker; Line1: monomer; Line 2–4: glutaraldehyde cross-linking of KDO8PS with 10 min, 30 min and 90 min.

图选项

AUC分析超速离心技术主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估算样品的纯度和检测生物大分子构象的变化等。根据AUC分析获得PeKDO8PS蛋白的沉降系数，通过Sedfit软件拟合后可知，在超高速离心力作用下，酶分子沉降过程中存在多种聚体形式，且不同蛋白聚合形式得以有效分离。从图 4可知，6S左右的沉降系数所对应的分子量大小在120 kDa左右，推断为KDO8PS的四聚体(Tetramer, T)，其余为少量二聚体(Dimer, D)和单体(Monomer, M)。另外，6S所占的比例最大，说明PeKDO8PS在溶液中主要以四聚体存在。

图 4 PeKDO8PS分析超速离心的沉降分布曲线 Figure 4 The sedimentation distribution profile from the AUC experiment for PeKDO8PS. The sedimentation coefficient positions corresponding to the monomer (M), dimers (D) and tetramer (T) are indicated.

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酶活性测定结果表明该酶最适温度为60 ℃，在25–65 ℃范围内酶活力较高，65–80 ℃酶活力急剧下降，而在25 ℃时仍保持在60%以上(图 5)；温度为55 ℃时，测定该酶最适pH为8.0，属于弱碱性酶。在pH 6.0-8.0范围酶活快速升高，pH 7.0-8.5之间酶的活性稳定在80%以上(图 6)，超出这一范围，则酶活迅速下降。

图 5 温度对KDO8PS酶活性的影响 Figure 5 Effect of temperature on activities of Phyllostachys edulis KDO8PS. Error bars represent x for three determinations.

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图 6 pH对KDO8PS酶活性的影响 Figure 6 Effect of pH on activities of Phyllostachys edulis KDO8PS. The maximum activity was taken as 100%. Error bars represent x for three determinations.

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各种金属阳离子及金属蛋白酶抑制剂EDTA对KDO8PS酶活影响结果显示(图 7)，各种金属离子对酶活性存在不同程度的抑制作用。其中以Fe³⁺对酶活的抑制作用最强；Cu²⁺、Se²⁺抑制作用较弱。而EDTA对酶活性有一定激活作用，分析认为EDTA是通过其螯合作用减弱了金属离子对酶活性的影响，从而对酶活性起到激活作用。

图 7 金属阳离子及金属蛋白酶抑制剂EDTA对KDO8PS酶活影响 Figure 7 Effcet of different metal ions and EDTA on KDO8PS activity. Activity of KDO8PS as isolated was measured at 37 ℃ in the presence of various metal or EDTA (100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 3 mmol/L PEP, 3 mmol/L A5P, 5 mmol/L metal or EDTA). Error bars represent x for three determinations.

图选项

KDO8PS在KDO合成途径中是唯一的合成酶，可催化两种底物A5P和磷酸烯醇式酸PEP发生共价键结合形成八碳糖骨架，这为最终八碳糖的KDO产生奠定了关键的物质基础。其酶活性的高低将直接影响植物细胞壁果胶类RG-Ⅱ多糖的合成，最终影响细胞的生长发育相关的一系列代谢活动。KDO8PS催化反应途径与3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAH7P synthase)相似。3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAH7P synthase)可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与赤藓糖-4-磷酸产生3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，还发现这两种酶的底物结合位点也是相似的^{[14, 19]}，说明KDO8PS与DAH7PS的起源采用相同的合成催化机理，但两者结构上的具体差异，还需进一步结构生物学方面的比较研究。

在PeKDO8PS酶的分离纯化过程中，本研究通过两步法快速获得了该蛋白的纯酶液，纯度达90%以上。SEC结果显示，毛竹KDO8PS在30 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)、200 mmol/L NaCl溶液条件下，主要以二聚体形式存在^[20]，而微生物KDO8PS晶体学结构显示为四聚体形式存在^[23]，初步认为这可能与它们之间的序列差异性有关。进一步分析超速离心(AUC)实验验证表明溶液中该酶主要为四聚体构象。相比较SEC结果而言，AUC分析蛋白质复合物寡聚物的结果更为精准。而两者出现分歧的原因可能是蛋白溶液中的浓度差异造成的，推测KDO8PS在高浓度的情况下易发生二聚体向四聚体的转变，这一推论在AUC峰图上也得到验证，即除了四聚体外，存在少量单体和二聚体。在添加戊二醛交联剂的情况下，出现了单体和不同类型的寡聚物，说明KDO8PS在溶液中出现不同的构象形式是完全可能的，也体现出KDO8PS分子同其他蛋白类似，水溶液中具有柔性。至于还有何种外界环境因素和内在结构影响酶构象的变化，还需进一步深入研究。

PeKDO8PS经酶学性质测定，该蛋白的最适反应温度为55 ℃，最适pH 8.0，与已报道的拟南芥酶特性类似，但酶催化的温度及pH作用范围较大肠杆菌KDO8PS更宽泛^[21-22]，推测这与酶序列差异及结构复杂程度有关。通过多序列比对发现，KOO8PS序列除在催化活性位点、GNRxQ模体和KANRS模体非常保守外，毛竹、拟南芥KOO8PS同微生物来源的KOO8PS序列相似度只有40%左右^[23-24]，在Loop区差异较大。这些区域的序列实际差异，除了可能影响酶聚合物状态外，还会影响酶催化特性、稳定性等功能^[25]，并最终影响毛竹细胞壁的生物合成。当溶液中存在各种金属阳离子时均对酶活性有不同程度的抑制作用，其中Cu²⁺、Zn²⁺对酶活性的抑制作用较弱，而Fe³⁺对酶活性的抑制作用最强。这说明KDO8PS具有较差的三价金属离子耐受性。尽管目前尚未得到植物来源KDO8PS的晶体学结构，但本文开展的酶分离纯化、酶特性相关研究结果可为今后该蛋白的空间结构与功能研究奠定基础，同时也为八碳糖保健食品和植物新型农药的研发提供十分重要的参考。