生物工程学报  2017, Vol. 33 Issue (11): 1877-1882
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.160460
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
0

文章信息

吴涛, 赵津津, 毛贤军
Wu Tao, Zhao Jinjin, Mao Xianjun
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响
Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in Escherichia coli
生物工程学报, 2017, 33(11): 1877-1882
Chinese Journal of Biotechnology, 2017, 33(11): 1877-1882
10.13345/j.cjb.160460

文章历史

Received: November 28, 2016
Accepted: July 21, 2017
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响
吴涛, 赵津津, 毛贤军     
梅花生物科技集团股份有限公司 廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北 廊坊 065001
收稿日期:2016-11-28; 接收日期:2017-07-21; 网络出版时间:2017-11-07
摘要:L-色氨酸是芳香族氨基酸的一种,被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS系统)在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用,是糖代谢基因表达调控的核心。利用Red同源重组系统,构建包含两类典型PTS系统突变(ptsHIcrr- glf-glk+ptsG-)的L-色氨酸生产菌,并对相关菌株进行补料分批发酵研究。结果表明,不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响。与出发菌相比,ptsHIcrr- glf-glk+突变株最高OD600达到125,提高47.0%,产酸38.5 g/L,提高25.9%,糖酸转化率16.7%,提高26.5%,乙酸生成略有增加;ptsG-突变株最高OD600达到100,提高17.6%,产酸33.4 g/L,提高9.4%,糖酸转化率15.5%,提高17.4%,乙酸生成略有减少。对葡萄糖转运系统的进一步研究将为大肠杆菌合成L-色氨酸效率的提升提供帮助。
关键词大肠杆菌     L-色氨酸     PTS系统     补料分批发酵    
Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in Escherichia coli
Tao Wu, Jinjin Zhao, Xianjun Mao     
Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Meihua Holdings Group, Langfang 065001, Hebei, China
Abstract: L-tryptophan, one of the aromatic amino acids, is widely used in the fields of medicine, food and feed additives. The phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system (PTS) plays an important role in glucose transport and phosphorylation in Escherichia coli. PTS-mediated regulation dominates the carbohydrates' uptake and metabolism in E. coli. We constructed L-tryptophan-producing bacteria containing two typical PTS mutations (ptsHIcrr- glf-glk+ and ptsG-) by Red homologous recombination system, and studied in 50 L jar fermenter using fed-batch fermentation. Both PTS system mutants had a great impact on the biomass (increasing 47.0% and 17.6%, respectively), L-tryptophan production (increasing 25.9% and 9.4%, respectively), glucose conversion rate (increasing 26.5% and 17.4%, respectively) and byproduct acetic acid generation (slightly increased and decreased, respectively).
Key words: Escherichia coli     L-tryptophan     phosphotransferase system     fed-batch fermentation    

L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一种,被广泛应用于饲料、医药和食品等领域。目前L-色氨酸的合成效率偏低,高昂的价格严重限制了其应用规模。提高L-色氨酸的生物合成效率、降低生产成本具有重要的应用价值。L-色氨酸生物合成途径复杂,前体来源于糖酵解途径、磷酸戊糖途径及三羧酸循环等多个基础代谢途径。每合成1 mol L-色氨酸需要1 mol磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1 mol 4-磷酸赤藓糖(E4P)作为起始前体,另外还需分别消耗PEP、谷氨酰胺、5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和丝氨酸各1 mol[1]。因此,研究色氨酸合成代谢对研究微生物代谢平衡具有重要的科学意义。

1979年,Tribe等[2]利用DNA重组技术首次将trpE基因引入大肠杆菌,L-色氨酸产量达到1 g/L。此后,随着代谢工程改造的深入和发酵工艺的优化,利用重组大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌发酵生产L-色氨酸的效率得到了数十倍的提升[3-7]。1996年,Berry[3]在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制(Feed-back resistance,fbr)的aroGfbrtrpEfbrDCBA基因,发酵52 h产L-色氨酸近45 g/L,过程最高糖酸转化率约为22%。1999年,Ikeda等[4]在产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中高表达tktA基因,增加L-色氨酸合成前体E4P的水平,从而提高L-色氨酸的合成效率,发酵80 h的L-色氨酸产量达到58 g/L。2012年,Cheng等[7]通过对产L-色氨酸大肠杆菌TRJH的发酵补料策略优化,发酵40 h左右,产量达到38.8 g/L,糖酸转化率高达19.9%。

大肠杆菌可通过多种途径转运并磷酸化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖,然后将其导入糖酵解途径。野生型大肠杆菌利用磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统)转运并磷酸化葡萄糖。PTS系统由EⅠ、HPr和EⅡs构成,EⅠ、HPr分别由ptsIptsH基因编码,为胞质可溶性蛋白;EⅡs包括EⅡMan、EⅡFru、EⅡBgl、EⅡAGlc、EⅡCBGlc等,多为蛋白复合体,对碳水化合物具有特异性,其中EⅡAGlc、EⅡCBGlc分别由crrptsG基因编码[8-9]。PTS系统转运1 mol葡萄糖需消耗1 mol PEP[9-10]。当大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的限制性培养基中生长时,PTS系统消耗了约50%的PEP用于葡萄糖的转运和磷酸化[11],直接影响以PEP为前体的化合物(如莽草酸、芳香族氨基酸、天冬氨酸族氨基酸等)的合成。在PTS系统缺陷大肠杆菌中,葡萄糖可以通过半乳糖/氢离子协同转运蛋白(D-Galactose/H+ symporter,GalP)和葡萄糖激酶(Glucokinase,Glk)协同作用进入胞内[9-11],以ATP为磷酸基团供体,但以GalP、Glk协同作用磷酸化转运葡萄糖的效率较低[11]。另外,大肠杆菌也可通过引入外源高效的葡萄糖转运磷酸化系统,如运动假单胞菌来源的glfglk基因,分别编码葡萄糖转运蛋白(Glucose facilitator,Glf)和葡萄糖激酶(Glk),以ATP为磷酸基团供体,转运并磷酸化葡萄糖[11-12]

PTS系统改造的大肠杆菌被广泛应用于多种化合物的发酵生产,如莽草酸、苯丙氨酸、乙醇等[11-12]。对于PTS系统的修饰改造可分为3类:ptsG-、PTS- Glc+(ptsHIcrr-突变菌经进化获得可在葡萄糖为碳源的限制性培养基上生长的Glc+表型)和PTS- glf-glk+(ptsHIcrr-突变菌通过表达外源glfglk基因获得Glc+表型)[11]。本研究采用Red同源重组系统,构建了两类典型的PTS系统突变体ptsHIcrr- glf-glk+ptsG-,将其应用于产L-色氨酸生产菌的构建,PTS系统突变后,葡萄糖转运将不再消耗PEP,胞内色氨酸重要前体物PEP的水平提高1倍,色氨酸生产能力有望显著提高。本研究还对不同PTS系统改造菌株的生产性能进行了补料分批发酵初步研究,首次综合评价了不同类型PTS系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响。

1 材料与方法 1.1 菌株与质粒

本研究使用的菌株和质粒见表 1。产L-色氨酸大肠杆菌MA01为出发菌,公开保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏编号为CGMCC No. 6863,根据专利WO8701130A1[13]及Mascarenhas等[14]描述的方法构建,其宿主菌SA01为E. coli K-12 CICC 10303衍生的E. coli K-12 CICC 10303 ∆tnaAserA,所含质粒pMG43为pBR322来源,包含有serAaroGfbrtrpEfbrDCBA基因。

表 1 本研究使用的菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study
Strains & plasmidsRelevant genotypeSource or reference
Strains
SA01E. coli K-12 CICC 10303 ΔtnaA ΔserACGMCC
MA01SA01 pMG43CGMCC
SA09SA01 ptsHIcrr-This study
SA29SA01 ptsG-This study
MA10SA09 pMG43This study
MA103SA09 pMG56This study
MA209SA29 pMG43This study
Plasmids
pMG43pBR322 ori, serA, aroGfbr, trpEfbrDCBA, TcRCGMCC
pMG56pMG43 Ptac-glf-glk, TcRThis study
pKD4oriR6Kgamma, rgnB(Ter), kan, ApRCGSC[15]
pKD46oriR101, repA101(ts), araBp-gam-bet-exo, ApRCGSC[15]
pCP20ts-rep, [cI857](lambda)(ts), cat, FLP, ApRCGSC[15]
pSC6.090BpSU18 Ptac-glf-glk, tktA, serAATCC[16]
1.2 培养基

种子培养基:20 g/L葡萄糖,15 g/L酵母浸粉,10 g/L (NH4)2SO4,0.5 g/L柠檬酸钠,5 g/L MgSO4·7H2O,1.5 g/L KH2PO4,15 mg/L FeSO4·7H2O,1.2 mg/L VB1,pH 7.0。

发酵培养基:10 g/L葡萄糖,1 g/L酵母浸粉,4 g/L (NH4)2SO4,2 g/L柠檬酸钠,5 g/L MgSO4·7H2O,2 g/L KH2PO4,0.1 g/L FeSO4·7H2O,6.3 mg/L MnSO4·H2O,7.4 mg/L ZnSO4·H2O,5.6 mg/L CoCl2·6H2O,0.8 mg/L CuSO4·5H2O,pH 7.0。

1.3 主要试剂

Phusion® High-Fidelity DNA聚合酶购于NEB公司,限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于Fermentas公司,质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购于Tiangen公司,L-色氨酸、有机酸标准品购于Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.4 质粒载体构建

采用常规分子克隆技术[17],如PCR扩增、酶切、连接和转化等构建重组质粒pMG56,具体方法如下,所用引物序列见表 2

表 2 本研究使用的引物 Table 2 Summary of primers used in this study
NamePrimer sequence (5′-3′)Function
glfglk1GCTCTAGACGACATCATAACGGTTCTGTo amplify Ptac-glf-glk
glfglk2ACGCGCATGGGTTCCACCGATGTCAATCG
glfglk3CGGTGGAACCCATGCGCGTTTCTCTATTG
glfglk4ACATGCATGCGACTAGTCAGCCTCTTAAATTCAGTTC
pts1CTAGACTTTAGTTCCACAACACTAAACCTATAAGTTGGGGAAATACAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCTo delete ptsHIcrr
pts2AAATGGCGCCGATGGGCGCCATTTTTCACTGCGGCAAGAATTACTTCTTGCATATGAATATCCTCCTTAG
pts3GCTAAAGTCGAACCGCCAGGTo screen the positive mutation of ptsHIcrr-
pts4CCAGCAGCATGAGAGCGATG
pts6TTGCCGCGATCTCGACAGTG
ptsG1AAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATGTTTAAGAATGCATTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCTo delete ptsG
ptsG2AGTCTCCCCAACGTCTTACGGATTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCCATATGAATATCCTCCTTAG
ptsG3CCTTGCCACGCGTGAGAACGTo screen the positive mutation of ptsG-
ptsG4AAAGGCAGCCATCTGGCTGC
The coding region are underlined, the restriction sites are indicated by bold letters.
1.4.1 质粒载体pET28-glfglk的构建

以质粒pSC6.090B为模板,用引物glfglk1和glfglk2扩增约2.3 kb的FK1片段,用引物glfglk3和glfglk4扩增约1.0 kb的FK2片段。以FK1和FK2为模板,用引物glfglk1和glfglk4扩增约3.3 kb的glf-glk DNA片段,产物用Xba Ⅰ、Sph Ⅰ双酶切,与经同样酶切的质粒pET28a连接,产物转化Top10感受态细胞,转化子用glfglk1和glfglk4为引物PCR鉴定,阳性约3.3 kb。提取重组质粒,用Xba Ⅰ、Sph Ⅰ双酶切鉴定,所得重组质粒pET28-glfglk约8.3 kb。

1.4.2 重组质粒pMG56的构建

质粒pET28-glfglk用Xba Ⅰ、Sph Ⅰ双酶切,回收约3.3 kb的glf-glk DNA片段,与经同样酶切的质粒pMG43连接,产物转化Top10感受态细胞,转化子用glfglk1和glfglk4为引物PCR鉴定,阳性约3.3 kb。提取重组质粒,用Spe Ⅰ、Sph Ⅰ双酶切鉴定,所得重组质粒pMG56约15.8 kb。

1.5 突变菌的构建

采用Datsenko KA等[15]所述的Red同源重组方法构建突变菌株,具体方法如下。

1.5.1 ptsHIcrr基因敲除菌的构建

以质粒pKD4为模板,pts1和pts2为引物,PCR扩增约1.5 kb的ptsHIcrr突变基因,电击转化100 μL含有质粒pKD46的SA01感受态细胞,30 ℃孵育1-2 h,涂布含卡那霉素(25 μg/mL)的LB平板,30 ℃静置培养24 h,挑单克隆以pts3和pts4为引物菌落PCR鉴定,阳性约1.5 kb,所得菌株即为ptsHIcrr基因的突变菌株SA01 ∆ptsHIcrr::kan

将质粒pCP20电击转化菌株SA01 ∆ptsHIcrr::kan,菌液涂布含氯霉素(25 μg/mL)的LB平板,30 ℃静置培养24 h。得到的单菌落转接无抗LB平板,42 ℃静置培养12 h,以pts3和pts6为引物进行菌落PCR鉴定,阳性约0.5 kb,所得菌株即为ptsHIcrr基因敲除的重组菌株SA01 ptsHIcrr-

1.5.2 ptsG基因敲除菌的构建

ptsHIcrr基因敲除菌的构建方法相同。

1.6 培养条件

摇瓶培养:从冻存管取菌种在LB平板上划线,37 ℃培养24 h;将菌体接种至装有20 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中,37 ℃、240 r/min振荡培养48 h。

发酵培养:将过夜培养的菌液接种至50 mL种子培养基中,37 ℃、240 r/min振荡培养5-10 h,OD600控制在6-8;将菌液转接至装有10 L种子培养基的20 L发酵罐,36 ℃培养9-18 h,OD600控制在13-18,溶氧控制在30%以上,pH控制在6.8-7.0;取2.2 L菌液转接至装有20 L发酵培养基的50 L发酵罐,35 ℃培养40-45 h,溶氧控制在10%-20%,转速200-800 r/min,罐压0.05-0.10 MPa,pH 6.5-6.6,待初糖耗尽后,流加60% (m/V)葡萄糖,流加糖速率为3-17 g/(L·h)。

1.7 葡萄糖、L-色氨酸及其他有机酸含量的测定

取1 mL发酵液,12 000 r/min离心3 min,测定上清液中葡萄糖、L-色氨酸及有机酸的含量。葡萄糖采用SBA-40C生物传感分析仪(山东省科学院)进行测定。L-色氨酸及有机酸分别采用HPLC法进行测定[18-19]

2 结果与分析 2.1 L-色氨酸生产菌的构建

按1.4所述方法,构建重组质粒pMG56。按1.5所述方法,分别构建了ptsHIcrr缺失突变株SA09和ptsG缺失突变株SA29。以SA09为宿主转化质粒pMG43或pMG56,分别构建了L-色氨酸生产菌MA10和MA103;以SA29为宿主转化质粒pMG43,构建了L-色氨酸生产菌MA209。

2.2 PTS系统改造对L-色氨酸生产菌生长的影响

MA01、MA10 (ptsHIcrr-)、MA103(ptsHIcrr- glf-glk+)、MA209 (ptsG-)按1.6所述的方法进行摇瓶培养,每2 h取样,测定生长曲线(图 1),重复实验3次。与出发菌MA01相比,ptsHIcrr缺失突变株MA10葡萄糖摄入能力差,生长缓慢;在MA10内引入glfglk基因,获得的菌株MA103生长旺盛,最高OD600值达到16.9,较MA01提高了35.6%;ptsG缺失突变株MA209,延滞期较出发菌MA01延长近4 h,但最终OD600值仍达到14.8,较MA01提高19.4%。

图 1 PTS系统改造L-色氨酸生产菌生长曲线 Figure 1 Comparison of growth curves of different PTS modified L-tryptophan producing strains.
2.3 PTS系统改造对L-色氨酸生产菌发酵性能的影响

MA01、MA103和MA209按1.6所述的方法进行发酵培养,测定各菌株的生长曲线,发酵液中葡萄糖、L-色氨酸及其他有机酸含量的变化,最终产酸及糖酸转化率(图 2)。发酵过程采用葡萄糖限制补料分批发酵工艺,控制发酵液中葡萄糖浓度接近0 g/L,见图 2AptsHIcrr缺陷株MA103最高OD600值达到125,较出发菌MA01提高47.0%;ptsG缺陷株MA209虽然前期生长稍慢,最高OD600值也能达到100,较出发菌MA01提高17.6%,但32 h后OD600值有明显下降的趋势。

图 2 PTS系统改造L-色氨酸生产菌的发酵性能 Figure 2 Results of L-tryptophan fermentation using different PTS modified L-tryptophan producing E. coli strains. (A) Glucose concentration (open symbols) and growth curves (filled symbols). (B) Concentration of L-tryptophan. (C) Concentration of acetic acid. (D) L-tryptophan accumulation and product yields in g L-tryptophan per g glucose.

L-色氨酸合成过程及最终产酸、糖酸转化率如图 2B2D所示,与出发菌MA01相比,ptsHIcrr缺陷株MA103能够达到的最高产酸为38.5 g/L,提高25.9%,糖酸转化率为16.7%,提高26.5%;ptsG缺陷株MA209最高产酸为33.4 g/L,提高9.4%,糖酸转化率为15.5%,提高17.4%。

发酵液中的有机酸副产物,如乙酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、莽草酸的含量也进行了测定。结果表明,乙酸含量差别最大,变化趋势也最明显,如图 2C所示。ptsHIcrr缺陷株MA103最高乙酸含量是MA01的2.1倍,达到4.1 g/L,而ptsG缺陷株MA209的乙酸含量较MA01低,最高值仅为1.5 g/L。其他有机酸含量偏低,且无显著变化。

3 讨论

当大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的限制性培养基中生长时,PTS系统消耗了约50%的PEP用于葡萄糖的转运和磷酸化,而用于合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的PEP仅占3%[12, 20],因此将PTS系统替换成利用ATP进行磷酸化的葡萄糖转运系统,对以PEP为前体的芳香族化合物的生物合成具有重要的应用价值。

然而大肠杆菌PTS系统与碳代谢总体调控蛋白CRP-cAMP紧密关联。腺苷酸环化酶环化ATP生成cAMP,其活性受磷酸化的EⅡAGlc(由crr基因编码)激活,因此不同类型的PTS系统改造会直接影响胞内cAMP的含量。一般认为ptsHIcrr-突变体因缺失crr基因,cAMP含量较低,而ptsG-突变体因含有磷酸化的EⅡAGlc,cAMP含量较高[9, 12]。在RegulonDB和EcoCyc数据库(http://regulondb.ccg.unam.mx/index.jsphttp://biocyc.org/ecocyc/index.shtml)中,除糖(阿拉伯糖、木糖、乳糖等)代谢相关基因外,还有131个“简单”或“复杂”的转录单元被CRP-cAMP激活、抑制或双重调控。这些调控单元与TCA循环、呼吸、渗透压调节、压力响应、生物膜形成、毒力、氮代谢、铁的吸收、感受态能力、多种药物抗性、非编码RNA等相关[12]。因此,不同类型PTS系统突变对于不同化合物生物合成的影响可能存在显著的差异。

本研究首次综合评价了不同类型PTS系统改造对于大肠杆菌产L-色氨酸的影响。结果表明,不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响,且表型存在较大差异。MA103 (ptsHIcrr- glf-glk+)在发酵罐中的最高OD600值能达到120以上,对高密度发酵产L-色氨酸非常有利,最高产酸达38.5 g/L。但发酵液中乙酸含量也相对偏高,达到4.1 g/L,这可能与引入的外源基因glfglk的表达强度有关,调整合适的glfglk基因表达水平,将有望降低乙酸的水平,得到L-色氨酸产量更高的重组菌株。或者通过优化发酵补料策略,降低乙酸水平[7, 21-22]

MA209 (ptsG-)因PTS系统被阻断,PEP不再作为葡萄糖磷酸化的磷酸供体[8-9],葡萄糖通过半乳糖/氢离子协同转运蛋白(GalP)和葡萄糖激酶(Glk)协同作用进入胞内[9-11],以ATP为磷酸基团供体,但以GalP、Glk协同作用磷酸化转运葡萄糖的效率较低[11],故MA209菌的葡萄糖摄入系统较弱,延滞期较出发菌MA01偏长,进入对数中后期,蛋白表达系统已经建立,比生长速率和糖耗速率与MA01菌接近。但MA209菌的葡萄糖摄入水平较弱,不易积累乙酸,有利于发酵控制。通过增大接种量或优化培养基配方等手段可进一步缩短延滞期时长,获得更高的L-色氨酸产酸和糖酸转化率。另外,与MA103菌相比,MA209菌需激活自身另一套转运葡萄糖系统,涉及复杂的代谢调控,代谢调控过程中浪费较多的碳骨架和能量,故而生长速率、转化效率都会受到影响。

参考文献
[1] Ikeda M. Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69(6): 615–626. DOI: 10.1007/s00253-005-0252-y
[2] Tribe DE, Pittard J. Hyperproduction of tryptophan by Escherichia coli: genetic manipulation of the pathways leading to tryptophan formation. Appl Environ Microbiol, 1979, 38(2): 181–190.
[3] Berry A. Improving production of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolic engineering. Trends Biotechnol, 1996, 14(7): 250–256. DOI: 10.1016/0167-7799(96)10033-0
[4] Ikeda M, Katsumata R. Hyperproduction of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(6): 2497–2502.
[5] Bongaerts J, Krämer M, Müller U, et al. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab Eng, 2001, 3(4): 289–300. DOI: 10.1006/mben.2001.0196
[6] Gosset G. Production of aromatic compounds in bacteria. Curr Opin Biotechnol, 2009, 20(6): 651–658. DOI: 10.1016/j.copbio.2009.09.012
[7] Cheng LK, Wang J, Xu QY, et al. Effect of feeding strategy on L-tryptophan production by recombinant Escherichia coli. Ann Microbiol, 2012, 62(4): 1625–1634. DOI: 10.1007/s13213-012-0419-6
[8] Deutscher J, Francke C, Postma PW. How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev, 2006, 70(4): 939–1031. DOI: 10.1128/MMBR.00024-06
[9] Neidhardt FC, Curtiss Ⅲ R, Ingraham JL, et al. Escherichia coli and Salmonella. 2nd ed. Washington DC: ASM Press, 1996: 1824-1866.
[10] Hernández-Montalvo V, Martínez A, Hernández-Chavez G, et al. Expression of galP and glK in a Escherichia coli PTS mutant restores glucose transport and increases glycolytic flux to fermentation products. Biotechnol Bioeng, 2003, 83(6): 687–694. DOI: 10.1002/bit.10702
[11] Gosset G. Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system. Microb Cell Fact, 2005, 4(1): 14. DOI: 10.1186/1475-2859-4-14
[12] Escalante A, Cervantes AS, Gosset G, et al. Current knowledge of the Escherichia coli phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system: peculiarities of regulation and impact on growth and product formation. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94(6): 1483–1494. DOI: 10.1007/s00253-012-4101-5
[13] Mascarenhas D. Tryptophan producing microorganism: WO, 8701130A1. 1985-08-15.
[14] Mascarenhas D, Ashworth DJ, Chen CS. Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in a genetically engineered strain of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(10): 2995–2999.
[15] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(12): 6640–6645. DOI: 10.1073/pnas.120163297
[16] Frost JW, Frost KM, Knop DR. Biocatalytic synthesis of shikimic acid: US, 6472169B1. 2002-10-29.
[17] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 2-110.
[18] Cheng LK, Xu QY, Xie XX, et al. Quick determination of L-tryptophan in fermented broth by HPLC. J Tianjin Univ Sci Technol, 2010, 25(1): 9–12. (in Chinese).
程立坤, 徐庆阳, 谢希贤, 等. HPLC快速测定发酵液中L-色氨酸. 天津科技大学学报, 2010, 25(1): 9-12.
[19] Suárez DC, Kilikian BV. Acetic acid accumulation in aerobic growth of recombinant Escherichia coli. Process Biochem, 2000, 35(9): 1051–1055. DOI: 10.1016/S0032-9592(00)00140-0
[20] Flores S, Gosset G, Flores N, et al. Analysis of carbon metabolism in Escherichia coli strains with an inactive phosphotransferase system by 13C labeling and NMR spectroscopy. Metab Eng, 2002, 4(2): 124–137. DOI: 10.1006/mben.2001.0209
[21] Eiteman MA, Altman E. Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. Trends Biotechnol, 2006, 24(11): 530–536. DOI: 10.1016/j.tibtech.2006.09.001
[22] de Mey M, de Maeseneire S, Soetaert W, et al. Minimizing acetate formation in E. coli fermentations. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(11): 689–700. DOI: 10.1007/s10295-007-0244-2