随着蓝藻的产业化发展，光质调控已成为提高生物量及目的产物表达的重要途径^[1-3]，转录因子介导的光调控机制逐步被揭示^[4]。光质是光源所包含的所有单色光的光强及波长的总称，直接影响藻细胞的光合作用及代谢途径。聚球藻光系统Ⅱ的捕光天线主要受psbA基因的调控^[5]，psbA基因对光质具有较敏感的响应机制^[6]。同时，工程蓝藻常用的载体启动子PpsbA^[7]与蓝藻的psbA基因同源^[8]，蓝光与红光分别诱导的信号通路可同时调节蓝藻本身的psbA基因及其载体启动子PpsbA^[9]。然而，相对于野生蓝藻，转基因蓝藻的最适光合条件已有显著改变^[10]，若要研究光质对于psbA基因及PpsbA的调控，必须先排除光合作用的干扰因素(总光强、温度与pH)，以达到最大光合效率。

新型光生物反应器(SDJ，上海联环生物工程设备有限公司)可对总光强、温度、pH、光质进行精确调控，能够使藻细胞达到最大光合效率，是工程蓝藻研究及产业化探索的重要工具。光生物反应器配备的LED光源可提供稳定的光质(红光615-630 nm，蓝光440-475 nm)，已普遍应用于微藻培养^[11]。研究发现，相同LED光质对于不同藻种的影响显示出差异，例如蓝光促进拟绿球藻Nannochloropsis sp.细胞增殖^[12]，却会抑制小球藻Chlorella sp.的生长并促进其油脂积累^[13]。因此，研究LED光质对工程蓝藻生长的影响是产业化的必要途径。

白斑综合症病毒(WSSV)于1992年首先在中国台湾地区发现，20年来WSSV在亚洲、南北美洲、欧洲和非洲造成的经济损失已超过70亿美元，尚未见在规模生产中应用有效药物来防治^[14]。Witteveldt等^[15]首次用大肠杆菌表达的VP28 (WSSV被膜中的结构蛋白)，经口服和注射接种，可提高对虾抗WSSV的能力。Jia等^[10]使用转vp28基因蓝藻，经口服后攻毒，成功提高了对虾的成活率，证明口服转基因蓝藻能有效抵抗WSSV。工程蓝藻口服剂的研制已进入中试阶段，其中工程蓝藻的规模培养是产业化的基础。聚球藻属Synechococcus sp.由于适合光反应器培养，已被广泛用于规模培养的研究^[16]，因此转vp28基因聚球藻7002^[17]在产业化上非常具有前景。

转vp28基因聚球藻S. PCC7002由中国科学院植物研究所提供，装在含150 mL BG-11培养基^[18]的250 mL摇瓶中进行培养，温度为30 ℃，摇床转速为130 r/min，光照为50 μmol/(m²·s)，连续光照。

聚球藻7002的叶绿素浓度通过公式(1)^[19]测定：

(1)

式中，P表示叶绿素浓度(mg/ml)；A₇₅₀、A₇₂₀、A₆₇₈分别表示750 nm、720 nm、678 nm处的吸光值。将待测藻液的浓度调整至每毫升样品所含叶绿素为10 μg。

净光合速率使用氧电极(Hansatech，UK)测定，温度由恒温水浴箱(Julubo，Germany)通过循环水控制。测定样品在不同条件下的净光合速率(光强，温度，pH)^[20]。净光合速率计算采用公式(2)：

(2)

式中，NPR (μmol O₂/mg Chlah)表示净光合速率(Net photosynthetic rate)；S为记录纸走的斜率(/min)；Q为常数，表示一定温度下水中的溶氧量(mol O₂/mL)；P为样品的叶绿素浓度(mg/mL)；60表示60 min；1 000表示记录纸的满量程为1 000。

封闭式光生物反应器为SDJ-5L型光合发酵系统(上海联环生物工程设备有限公司)，由全自动圆柱形玻璃反应器及外置LED光源构成。该系统可对pH、温度、光照进行恒定控制，培养条件(光照、温度、pH)按照优化后的指标((300±10) μmol/(m²·s)，37 ℃，pH 7.5)进行设置。工作体积为3.5 L，初始接种量使藻液A₇₅₀达到0.1±0.02，平均空气流量为1 L/min，平均CO₂的体积分数为0.5%。培养时长为72 h。LED光源采用白、红、蓝进行调控，平均光强测定采用公式(3)^[21]：

(3)

式中，I_av为平均光强(μmol/(m²·s))；I为入射光强(μmol/(m²·s))；K为光衰减系数；R为反应器半径(m)。聚球藻7002的光衰减系数计算采用如下公式(4)^[22]：

(4)

式中，K为光衰减系数；A₇₅₀为藻液吸光值。

调控白光、红光、蓝光的配比并设置White、Red、Blue、Balance共4个实验组(表 1)，通过公式(3)测定并调控平均光强，使得平均光强符合优化的标准((300±10) μmol/(m²·s))。

Trizol法提取转vp28基因聚球藻7002的总RNA。以总RNA为模板，用试剂盒反转录为cDNA(Tiangen，China)。vp28序列参照文献[17]并设计vp28的qPCR引物(表 2)。管家基因16s rRNA的引物采用已有模板^[23]。20 μL PCR反应体系包括2 μL cDNA，0.6 μL正向引物与反向引物，10 μL SYBRFast qPCR Master Mix (2X) (KAPA，USA)。参照Jia等^[10]的方法，计算vp28表达率并用Western blotting检测蛋白条带。

在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到对应的蛋白序列psbAI (ID: 501262777)、psbAⅡ (ID: 501264014)、psbAⅢ (ID: 501264746)，并利用tblastn反向定位到聚球藻7002基因组全序列(CP000951)的对应片段psbAI (region: 1489906-1490985)、psbAⅡ (region: 161804-162883)、psbAⅢ (region: 2245055-2246134)。分别设计qPCR引物(表 2)。取接种前的样品(藻种)作为参照，每隔24 h对White、Red、Blue三个实验组的样品进行检测，其中qPCR方法及反应体系同1.5。

光合作用中，除了光强直接供给电子激活的能量，温度与pH对酶活力的影响决定了光合作用的效率^[24]。因此，必须首先排除温度与pH的干扰，使得光强的能量最大限度地输入光系统Ⅱ，才能进一步分析出光的成分(光质)对于捕光效果的影响。在温度为35 ℃、pH为7.3的条件下，研究光强(50-800 μmol/(m²·s))对净光合速率的影响(图 1A)。随着光强的增加，净光合速率不断增加。当光强达到400 μmol/(m²·s)时，净光合速率出现下降，从320 μmol O₂/mg Chlah左右下降至281 μmol O₂/mg Chlah。在光强为300 μmol/(m²·s)，pH为7.3的条件下，研究温度(15-50 ℃)对净光合速率的影响(图 1B)。随着温度增加，净光合速率不断增加。当温度达到40 ℃后，净光合速率突然下降，50 ℃时净光合速率从320 μmol O₂/mg Chlah变为0。在光强为300 μmol/(m²·s)，温度为35 ℃的条件下，研究pH 5.5-9.0对净光合速率的影响(图 1C)。随着pH增加，净光合速率不断增加。当pH达到7.5后，净光合速率开始下降，净光合作用从326 μmol O₂/mg Chlah下降至210 μmol O₂/mg Chlah。

图 1 光强、温度、pH对净光合速率的影响 Figure 1 Effect of irradiance, temperature and pH on net photosynthetic rates. (A) Irradiance. (B) Temperature. (C) pH.

图选项

光生物反应器培养的实验中，我们尝试用单色光(蓝光)来培养聚球藻，但细胞生长速度极慢，细胞样品的采集与处理遇到较大困难，并且细胞浓度过低严重影响到基因与蛋白的检测。因此，为了方便实验以及产业化生产的需要，本研究以3 d内干生物量达到1 g/L为最低标准，进行光质配比的设定。随着细胞密度的升高，入射光强并不能实时反映藻细胞的光能利用率^[22]。从开始培养到结束，藻细胞的光能利用率处于一个由高至低的动态的变化过程。本研究采用平均光强代替入射光作为计量参数^[26]，计算出了平均光强的变化范围(表 1)，以求反应实际的光能利用率^[11]。White、Red、Blue、Balance四个实验组72 h的干生物量分别为1.48 g/L、1.68 g/L、1.22 g/L、1.38 g/L。图 3中，培养前36 h内，4组藻细胞进入对数生长期，干生物量积累速度差异不显著。培养36 h后，Red组与Blue、Balance组的干生物量积累速度差异显著，Red组生长速度最快；Red与Blue组差异极显著，Blue组明显生长较慢；White组与Balance组差异不显著，生长速度较接近。光生物反应器的验证培养结果表明，在生物量积累上，已经超过了同类实验^{[22, 25]}，3 d内平均干重超过1.2 g/L。

图 2 不同光质组成下干生物量积累曲线 Figure 2 Variations of dry biomass with various proportions of light quality.

图选项

图 3 不同光质组成下vp28表达率变化曲线 Figure 3 Variations of vp28 transcription with various proportions of light quality.

图选项

宁文艳等^[27]提出光调控启动子PpsbA是鱼腥藻的高效表达载体，未经光调控的PpsbA表达效率是IPTG调控下Ptac的1.17倍。然而尚未有报道指出转基因鱼腥藻的载体启动子PpsbA可接受光质调控，未经光调控的转vp28基因鱼腥藻7120的表达效率只有0.1%-1%^[10]。转基因聚球藻7002所用表达载体为prl-489，启动子为PpsbA^[17]。本文中高比例蓝光促进了vp28基因的表达，并促进了psbAⅡ、psbAⅢ的转录，这与Tsinoremas等^[9]研究转基因聚球藻7942结果一致。图 3与图 5的结果证明，载体启动子PpsbA与光合基因psbA的转录在时空效应上具有一致性，均受到蓝光的诱导作用。然而外源蛋白(VP28)的积累量(图 4)差异不如外源基因表达差异明显(图 3)，这可能是DNA转录与mRNA翻译的时空差异造成的。图 3中，White、Red、Blue、Balance四组vp28基因表达率总体均呈现上升趋势，前36 h内4组vp28表达率都较低。其中，Blue与Balance组表达率较高，White与Red组表达率较低，36 h后前两组与后两组相比差异明显。Blue与Balance组在前36 h及60 h后差异不显著，而在36 h至60 h之间差异明显。White与Red组在72 h内差异都不明显。Blue组中vp28基因表达率最高达到2.41%，出现于第72 h。Red组中vp28基因表达率最低达到0.11%，出现于12 h。图 4中，总蛋白条带在PAGE上无明显差别，而VP28条带在PVDF上差异较为明显。灰度值从少到多分别为Red、White、Balance、Blue，说明Blue组蛋白积累量最高，Red组蛋白积累量最少，并且Blue组与Red组差异明显。

图 5 不同光质组成下psbA的相对表达量 Figure 5 Relative transcription of psbA genes with various proportions of light quality.

图选项

图 4 同光质组成下VP28的相对含量 Figure 4 Relative accumulation of VP28 in engineered Synechococcus sp. PCC7002 with various proportions of light quality. (A) SDS-PAGE analysis of total protein. (B) Western blotting of VP28. M: marker; 1: wild type; 2: red; 3: white; 4: balance; 5: blue.

图选项

图 5显示，接种后光能利用率较高，psbA转录效率比接种前提高了50%-75%。White与Red组psbA的总mRNA表达量高于Blue组。随时间变化，总psbA mRNA含量呈下降趋势。psbAI、psbAⅡ、psbAⅢ在3组中都呈下降趋势，其中psbAⅡ、psbAⅢ在White与Red组中下降速度较快，psbAⅡ分别从第1天的0.72、0.48下降至第3天的0.32、0.28，psbAⅢ分别从0.72、0.42下降至0.21、0.11。而在Blue组中，psbAⅡ与psbAⅢ的下降速度明显较慢，从第1天的0.34、0.78分别下降至第3天的0.20、0.40。Blue组的psbAⅡ与psbAⅢ始终高于White与Red组，而Red组的psbAⅡ与psbAⅢ始终处于较低水平。与纯白光相比，高比例红光并不影响psbA基因总mRNA含量，但最终提高了转基因聚球藻7002的干生物量积累；高比例蓝光抑制了psbA总mRNA的含量，从而抑制了干生物量的积累，但促进了psbAⅡ与psbAⅢ的转录。这可能是由于不同比例的红光、蓝光影响了Rubisco与碳酸酐酶的活性^[28]，从而影响了碳循环途径。本文中高比例红光促进了生物量的积累，这可能是因为红光诱导了一种以钙调蛋白为二级信使的信号通路^[29]，并促进了psbAI的表达。

本文研究了光质调控对工程聚球藻7002生长及vp28表达的影响，确定最优光能利用条件，使得生物量在3 d内突破1.2 g/L。当白光，红光与蓝光的光强比为3:1:2时，重组蛋白VP28表达翻倍。发现蓝光可促进启动子PpsbA表达vp28，红光可提高生物量的积累。通过检测基因转录及目的蛋白表达，证明psbA基因响应了光质调控。研究结果对工程蓝藻的规模培养、重组蛋白的高效表达、转基因生物制药具有重要的参考价值。