2016, Vol. 32服务
文章信息
- 徐雪姣, 查向东, 车媛媛, 马利娟, 吴思群, 杨培龙, 黄火清, 姚斌
- Xuejiao Xu, Xiangdong Zha, Yuanyuan Che, Lijuan Ma, Siqun Wu, Peilong Yang, Huoqing Huang, and Bin Yao
- 美洲拟鲽抗菌肽Pleurocidin 在大肠杆菌中的高效分泌表达及优化
- Expression of Pleurocidin from winter flounder in Escherichia coli and optimization of culture conditions
- 生物工程学报, 2016, 32(3): 365-374
- Chin J Biotech, 2016, 32(3): 365-374
- 10.13345/j.cjb.150286
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文章历史
- Received: June 19, 2015
- Accepted: October 16, 2015
2 中国农业科学院 饲料研究所，北京 100081
2 Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
阳离子抗菌肽是由植物和动物产生的阳离子型的两亲性分子，一般由12-50个氨基酸残基组成，相对分子质量小，水溶性好，等电点在8.9-10.7之间，具有两亲α-螺旋和 (或) 两亲β-折叠结构[1]。
海洋生物抗菌肽存在独特的翻译后修饰，例如半胱氨酸结、卤化作用、组氨酸和丙氨酸桥，这些修饰可以使海洋生物抵抗严酷的生活环境[2]。Pleurocidin是从美洲拟鲽Pseudopleuronectes americanu的皮肤粘液中分离出的含25个氨基酸残基的线性α-螺旋多肽，具有广谱的抗菌活性，能够抑杀多种细菌和真菌，如肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和白色念珠菌[3-4]。Pleurocidin的等电点为10.05，可以形成两亲的α-螺旋，通过在细菌细胞膜上形成离子通道，不可逆地破坏细胞膜，从而杀死细菌[5]。Pleurocidin热稳定性好、耐盐，对多种食品微生物有抑杀作用，可用于食品保鲜[6]。在体外毒性研究中，Pleurocidin表现出较低的溶血性，具有潜在的治疗价值[7]。
Pleurocidin天然来源有限，化学合成价格昂贵，利用基因工程方法合成Pleurocidin是一条高效低成本的生产途径。大肠杆菌表达系统目前应用最为广泛。但是用大肠杆菌表达抗菌肽却有一些困难，主要在于抗菌肽对大肠杆菌有毒性。本实验室曾尝试在大肠杆菌内非融合表达Pleurocidin未获成功。
本文利用来源于大鼠肝脏细胞色素b5的亲水结构域Cherry[8]，它与信号肽pelB共同作用，一方面抑制Pleurocidin对宿主细胞的毒性，另一方面促进融合蛋白分泌至胞外；对分泌的重组融合蛋白用酸水解特异性切割Asp-Pro位点，获得有活性的r-Pleurocidin。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒质粒pET22b (+) 购自Novagen公司 (Darmstadt, Germany)；大肠杆菌DH5α，BL21 (DE3) 和枯草芽孢杆菌BS168均为本实验室保存。
1.2 工具酶和试剂NcoⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶购自MBI Fermentas (北京，中国)；T4 PNK和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小量快速提取试剂盒购自爱思进公司；改良型Lowry法蛋白定量试剂盒、胰蛋白胨、酵母提取物、IPTG、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶等购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。其他试剂为国产分析纯。
1.3 重组质粒pET22b(+)-CP的构建 1.3.1 Pleurocidin基因的扩增根据Pleurocidin基因的氨基酸序列GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL，依据大肠杆菌密码子的偏爱性，设计并合成Pleurocidin基因的编码序列5′-GGTTGGGGT AGCTTTTTCAAGAAAGCAGCACATGTTGGTAAACATGTTGGTAAAGCAGCACTGACCCATTATCTG-3′。以Pleurocidin基因为模板，设计上、下游引物ple1和ple2 (表 1)。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次；72 ℃ 10 min。实验中PCR产物和质粒均经1.4%琼脂糖电泳检测，试剂盒纯化回收。
| Primers | Primer sequence (5′-3′) | Underlined segment |
| ple1 | GATCCGGGTTGGGGTAGCTTT | Asp-Pro encoding sequence |
| ple2 | GGAATTCTTACAGATAATGGGTCAG | EcoRⅠrecognition site |
| C1 | CATGCCATGGATCACCATCATCATCAT | NcoⅠrecognition site |
| C2 | AAGGGTTTCCGAAGGCTTGG | - |
参考挪威大鼠细胞色素b5 DNA序列 (GenBank登录号：BC086945)，设计上、下游引物C1和C2 (表 1)。反应条件同Pleurocidin基因的扩增，但退火温度为60 ℃。引物与基因的合成及质粒测序均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。
1.3.3 Cherry DNA序列和Pleurocidin基因平末端连接将pleurocidin基因和Cherry DNA的PCR扩增产物混合，用T4多核苷酸激酶37 ℃磷酸化30 min，再加入T4 DNA连接酶37 ℃连接1 h。
1.3.4 融合基因Cherry-pleurocidin (CP) 的扩增上述连接产物用无菌水稀释20倍后作为模板，以C1和ple2为上、下游引物，PCR扩增得到融合基因CP。PCR反应条件同pleurocidin基因的扩增。
1.3.5 融合基因与质粒pET22b (+) 连接及转化融合基因CP和质粒pET22b (+) 经NcoⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切，胶回收后用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞，37 ℃过夜培养，菌液PCR鉴定阳性克隆。对重组质粒pET22b(+)-CP (Cherry-Pleurocidin) 进行测序。
1.4 诱导表达挑测序正确的阳性克隆接种至含有50 μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基中，37 ℃、200 r/min过夜振荡培养，按1%量接入新鲜的LB抗性培养基扩大培养，37 ℃振荡培养至OD600≈0.6时，加入终浓度4 g/L的乳糖，37 ℃、30 ℃和25 ℃分别诱导20 h，9 000×g离心1 min，收集上清液和菌体。诱导期间，每隔4 h取样，Lowry 法[9]测定培养上清中的总蛋白浓度。用Bandscan软件扫描分析SDS-PAGE图谱，估算融合蛋白CP在总蛋白中所占的比例。
1.5 不同浓度甘氨酸对融合蛋白CP分泌效率的影响诱导16 h时加入不同浓度的甘氨酸，使终浓度分别为1、2、3、4、5 g/L，诱导20 h时离心收集上清液。对乳糖诱导组和乳糖+甘氨酸诱导组培养上清中融合蛋白CP浓度进行比较分析。诱导期间，每隔4 h取样，Lowry法[9]测定培养上清中的总蛋白浓度。
1.6 融合蛋白CP的酸特异性切割向培养上清中滴加1 mol/L盐酸，至终浓度为100 mmol/L，65 ℃恒温水浴72 h；每隔24 h取1 mL水解液，4 ℃、12 000×g离心10 min。在上清液中，加5倍体积的丙酮，-20 ℃下静置30 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃去上清丙酮，自然风干后加100 μL还原性SDS-PAGE上样缓冲液，Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测水解效果。
1.7 Pleurocidin 纯化及质谱鉴定 1.7.1 离子交换层析利用Sephadex CM-FF 5 mL阳离子交换柱在AKTA Explorer100进行分离纯化。条件为：波长214 nm和280 nm，流速1 mL/min，平衡缓冲液为20 mmol/L PB (pH 7.0)，洗脱缓冲液为20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl、pH 8.0。0.2 mol/L NaCl洗脱，收集洗脱峰样品，用Tricine-SDS- PAGE电泳分析。
1.7.2 电洗脱1) 凝胶切割：将SDS-PAGE胺凝胶用蒸馏水彻底冲洗，切下目的条带，捣碎，放入透析袋内，注入Tris-甘氨酸缓冲液 (pH 8.3)，置4 ℃冰箱；2) 洗脱：将透析袋放入盛有预冷Tris-甘氨酸缓冲液 (pH 8.3) 的核酸电泳槽 (冰浴) 中，100 V电泳1 h左右；待考马斯亮蓝完全从凝胶条带上跑出时，将透析袋放入预冷的 0.01 mol/L的PBS溶液中透析；3) 沉淀：取出透析袋内的液体用丙酮过夜沉淀，透析液与丙酮体积比为1∶5；最后用SDS-PAGE凝胶电泳检测电洗脱纯化效果。纯化后样品经透析脱盐后冻干，再用二维液相色谱多级质谱联用仪 (2DIC-MS) 进行质谱分析。
1.8 Pleurocidin 的抑菌活性检测利用琼脂糖扩散法进行抑菌实验，取10 mg纯化后的Pleurocidin溶于4 mL PB缓冲液 (pH 7.0) 中，过滤灭菌，备用。将过夜活化的大肠杆菌DH5α和枯草芽胞杆菌BS168，均匀涂布于LB固体培养基上，取制备好的Pleurocidin进行抑菌实验，以融合蛋白CP和无菌水作阴性对照，氨苄青霉素钠作阳性对照，37 ℃恒温培养，20 h后观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径。
最小抑菌浓度的测定[10-11]：将处于对数期的大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌BS168稀释到104-105CFU/mL，取1 mL菌液和10 μL不同浓度的r-Pleurocidin加入到EP管中，以PB缓冲液作阴性对照，37 ℃、200 r/min振荡培养3 h，测菌液的OD600，以吸光度值无变化处所对应的r-Pleurocidin浓度为最小抑菌浓度 (MIC)。
2 结果与分析 2.1 重组质粒的构建CP融合基因片段的大小为413 bp，其PCR产物经电泳检测，条带大小与预期一致 (图 1)。构建的重组质粒pET22b (+)-CP转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得了阳性克隆，测序证明碱基序列正确，pelB编码序列、Cherry DNA和Pleureucidin基因依次正确连接。
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| 图1 融合基因Cherry-Pleurocidin 的PCR 扩增结果 Figure1 PCR product of Cherry-Pleurocidin fusion gene. M: DNA marker; 1: PCR products of fusion gene. |
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SDS-PAGE分析表明，30 ℃恒温诱导条件下，诱导组培养上清和菌体中均出现融合蛋白CP，信号肽完全切割，而未诱导组在相同位置未发现相应条带 (图 2)。诱导组诱导20 h时上清中总蛋白浓度达到520 μg/mL；融合蛋白CP占总蛋白67.2%，融合蛋白CP浓度为349 μg/mL；菌体内也存在融合蛋白CP，根据Bandscan中的灰度值乘以总体积，估算出胞外融合蛋白CP占总融合蛋白CP的73.2%。诱导温度为37 ℃时没有表达条带，30 ℃表达效果优于25 ℃。
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| 图2 pET22b (+)-CP 工程菌诱导表达分析 Figure2 SDS-PAGE analysis of the induced expression in the engineering bacteria harboring pET22b (+)-CP. 1: cell pellet of the control group; 2: cell pellet of the lactose induction group; 3: culture supernatant of lactose induction group; 4: culture supernatant of the control group; M: protein marker (from bottom to top: 14.4, 20, 31, 45, 66.2 and 98 kDa). |
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在诱导16 h时加入甘氨酸，当甘氨酸终浓度增加为4 g/L，融合蛋白CP接近完全分泌 (图 3)；终浓度为5 g/L时，分泌效果与4 g/L无明显差异。诱导20 h后上清中总蛋白浓度达到 608 μg/mL；融合蛋白CP占总蛋白浓度的84.5%，融合蛋白CP浓度为513 μg/mL。配对数据t检验分析表明：乳糖+甘氨酸诱导组 (甘氨酸终浓度4 g/L) 胞外融合蛋白CP产量极显著高于乳糖诱导组。
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| 图3 乳糖诱导组和乳糖+甘氨酸诱导组SDS-PAGE 比较图 Figure3 Comparison between the lactose induction group and the lactose+glycine group by SDS-PAGE. 1: cell pellet of the lactose induction group; 2: culture supernatant of the lactose induction group; 3: cell pellet of the lactose + glycine group; 4: culture supernatant of the lactose + glycine group; M: protein marker (from bottom to top: 12, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 and 120 kDa). |
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不同时间点诱导培养上清中的总蛋白浓度变化曲线如图 4所示。乳糖+甘氨酸诱导组加入甘氨酸后，培养上清中总蛋白浓度显著增加，随后也一直高于乳糖诱导组。
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| 图4 培养基中总蛋白浓度随诱导时间变化曲线图 Figure4 Time course of the total protein concentration in culture supernatant. |
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盐酸浓度为100 mmol/L，水解温度65 ℃，水解时间24 h、48 h、72 h，均有目的条带出现；48 h和72 h目的条带含量没有明显差异 (图 5)。
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| 图5 融合蛋白Cheery-Pleurocidin 酸切割的 Tricine-SDS-PAGE 分析 Figure5 Tricine-SDS-PAGE analysis of Cheery- Pleurocidin Asp-Pro cleavage. 1: control sample incubated at the same condition without any acid added for 72 hours; 2-4: the supernatant of the hydrolysis solution at the time point of 24 h, 48 h and 72 h; M: low range protein marker (from bottom to top: 4.1, 6.5, 9.5, 14.4, 20, 27, 35, 45, and 66 kDa). |
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盐酸水解后的培养上清用Sephadex CM-FF层析柱吸附，用0.2 mol/L NaCl洗脱，洗脱液经电泳检测出现多个条带，对r-Pleurocidin条带利用电洗脱进一步纯化，经SDS-PAGE检测可以达到电泳纯 (图 6)。样品进行2DIC-MS质谱分析，样品的离子模式为[M+H]2+，对应的分子量为2 809.26 Da；与理论分子量2 808.2 Da相符，误差在仪器测量允许范围内 (图 7)。样品的实际二级碎片离子与MS2理论碎片离子一致，证实样品为r-Pleurocidin (图 8、9)。
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| 图6 r-Pleurocidin 的纯化图 Figure6 Tricine-SDS-PAGE analysis of purified r-Pleurocidin. (A) Purification of r-Pleurocidin by cation exchange chromatography. (B) Purification of r-Pleurocidin by electroelution. 1: fractions from the Sephadex CM-FF 5 mL column; 2: purified r-Pleurocidin; M: low range protein marker (from bottom to top: 4.1, 6.5, 9.5, 14.4, 20, 27, 35, 45, and 66 kDa). |
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| 图7 r-Pleurocidin 的一级质谱图 Figure7 Primary mass spectrometry (DIC-MS) of r-Pleurocidin. |
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| 图8 r-Pleurocidin 的二级质谱图 Figure8 The second grade mass spectrometry(DIC-MS) of r-Pleurocidin. |
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| 图9 r-Pleurocidin 的MS2 理论碎片离子 Figure9 MS2 theoretical fragment ions of r-Pleurocidin. |
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琼脂糖扩散法抑菌实验表明，r-Pleurocidin对大肠杆菌DH5α (500 μg r-Pleurocidin) 和枯草芽胞杆菌BS168 (250 μg r-Pleurocidin) 均有明显的抑菌活性 (图 10)。通过液体抑制测定法确定了r-Pleurocidin对大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌BS168的最小抑菌浓度分别为300、 150 μg/mL。
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| 图10 r-Pleurocidin 的抑菌活性检测 Figure10 Antibacterial activity assay of r-Pleurocidin. (A) Bacillus subtilis BS168. (B) E. coli DH5α. 1: ampicillin sodium salt; 2: r-Pleurocidin; 3: the fusion protein CP; 4: sterile ddH2O. |
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目前关于Pleurocidin的重组表达研究涉及原核和真核表达系统。Bryksa等用pET21a质粒为载体在大肠杆菌中融合表达Pleurocidin基因，融合蛋白在细胞内形成包涵体，溶解后用羟胺切除融合头而获得完整的重组Pleurocidin [12]；该方法的纯化过程较为复杂，而且所用羟胺是致癌剂。Burrowes等将Pleurocidin cDNA基因片段插入到pPICZα质粒中，转化毕赤酵母，用甲醇诱导表达，转录水平正常，但并未获得翻译产物，可能是Pleurocidin被蛋白水解酶降解或表达产量过低[13]。Brocal等用鱼类细胞系表达Pleurocidin，Western blotting结果显示转染EPC细胞系的培养上清和细胞内均有Pleurocidin，但表达产量低，表达时间长，成本较高，不适用于大规模生产[14]。
大肠杆菌异源表达是生产重组蛋白的有力工具，而分泌表达更具有避免胞内降解、可连续生产、便于分离纯化等优势。但大肠杆菌中外源蛋白的分泌表达面临一些困难，例如1) 大肠杆菌双层细胞膜不利于分泌，蛋白质有分泌到胞外和周质两种可能性；2) 与胞内表达比较，胞外分泌所对应的高密度发酵技术尚不够成熟[15]。随着对大肠杆菌蛋白分泌系统了解的深入，分泌表达技术也更为有效[16]，主要从以下几个方面提高分泌效率：1) 宿主菌本身的遗传改造；例如Wacker Biotech公司开发ESETEC®系统，其宿主菌若干外膜蛋白被突变[17]；2) 选择或改造信号肽序列[18]；3) 目的蛋白的修饰或结构改变[19]；4) 优化培养条件，如添加甘氨酸、Triton X-100，改变培养温度等[20-21]。
Ⅱ型分泌系统是最常用的分泌系统，它先通过SecB、SRP或TAT通路，将含信号肽的蛋白质前体转运至周质，再通过MTB机制由12-16个蛋白质组成的secreton分泌到胞外[15]。本实验成功构建了PelB-Cherry-Pleurocidin融合基因，表达过程中信号肽PelB切割完全，融合蛋白CP分泌到培养上清中。PelB信号肽属于Ⅱ型分泌系统的SecB途径，配合使用Cherry作为前导序列[21]，一方面抑制抗菌肽pleurocidin对宿主细胞的毒性，另一方面促进融合蛋白CP直接分泌到胞外。另外，甘氨酸干扰大肠杆菌细胞壁肽聚糖层的合成，破坏细胞外膜的完整性[22]，添加适量的甘氨酸促进了胞内蛋白质的释放，有效提高了产量和分泌效率。本实验中融合蛋白CP几乎全部分泌到胞外，在培养上清中的产量达 516 mg/L，在同类研究中 (20- 500 mg/L) 处于较高水平[23-26]。酸水解切割融合蛋白，成本低，安全性好，操作方便。本实验中融合蛋白盐酸水解效果优于甲酸和乙酸，但水解过程中出现了部分蛋白质沉淀的问题，需要进一步摸索条件加以改进。
本实验成功构建了含重组质粒pET22b (+)-CP的大肠杆菌工程菌，首次实现了Pleurocidin在大肠杆菌中高效分泌表达，结合下游高密度发酵，可以获得更高的产量，具有重要的应用价值。
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