中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 余萌, 曹帅帅, 郑伟楠, 贾潇潇, 李晶, 刘文军
- Yu Meng, Cao Shuaishuai, Zheng Weinan, Jia Xiaoxiao, Li Jing, Liu Wenjun
- 不同亚型流感病毒NS1蛋白的细胞定位差异分析
- Comparison of cellular localization of NS1 from different subtypes of influenza A virus
- 生物工程学报, 2016, 32(11): 1600-1609
- Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1600-1609
- 10.13345/j.cjb.160055
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文章历史
- Received: January 27, 2016
- Accepted: March 11, 2016
2 中国科学院大学,北京 100049
3 安徽大学 生命科学学院,安徽 合肥 230039
2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China ;
3 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039, Anhui, China
流感病毒属于正黏病毒科,其中A型流感病毒基因组由8节段的负链单股RNA组成,编码17种蛋白。该病毒的感染能够引起多种宿主因子发生变化,从而引起宿主细胞的各种生理生化反应,如炎症反应、细胞形态变化以及信号转导通路抑制或激活等[1],最近流行的H7N9和H5N6亚型流感,均由A型流感病毒引起,给人类带来了严重危害[2-3]。在流感病毒感染周期中,许多宿主因子蛋白通过多个途径抑制病毒复制和调控细胞凋亡,以减少病毒对宿主的损伤。而流感病毒能够产生多种机制来应对这种抗病毒免疫反应,NS1蛋白是流感病毒编码的一个重要毒力蛋白,以抵抗宿主细胞的免疫反应[4-6]。
NS1由病毒基因组第8段RNA编码,由2个独立的功能域所组成[7-8],即N端的RNA结合结构域(第1−73位氨基酸),可与多种类型的RNA以低亲和力的方式结合;C端的“效应”区域(第87−230位氨基酸),主要与宿主细胞蛋白质相互作用,同时稳定与RNA结构域的作用,抑制宿主细胞的免疫反应。
NS1蛋白是一种多功能蛋白,一方面可抑制宿主天然免疫系统对病毒复制的抑制,另一方面又可调节病毒RNA的合成及提高病毒mRNA的翻译水平[9-11]。NS1蛋白在细胞中的不同定位可与不同的宿主蛋白发生相互作用,从而发挥不同的功能,NS1蛋白包含有2个入核定位信号NLS和1个出核信号NES。有报道称NS1在病毒复制的早期定位到细胞核中,在复制的后期出核,主要定位在细胞质中[12]。NS1在细胞核内主要与CPSF30、PAPB Ⅱ相互作用,抑制宿主自身的mRNA后加工修饰[13],而在细胞质中,NS1可与RIG-I、TRIM25结合[14-16],抑制干扰素的产生。
为了探究H1N1亚型流感病毒的复制和传播机制以及其毒力和致病机理,发现引起不同流感病毒毒力差异的因素,我们分析了不同亚型流感病毒NS1蛋白的细胞定位情况,旨在研究细胞定位情况是否与不同流感毒株的毒力存在相关性,并且这种细胞定位情况是否与某个关键氨基酸位点的作用相关。
1 材料与方法 1.1 细胞株及病毒株流感病毒A/WSN/33 (H1N1) (以下简称为WSN)、A/H1N1/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (以下简称为PR8)、A/California/04/2009 (H1N1) (以下简称为CA04)、A/Shandong/lx1023/2007 (H9N2) (以下简称为SD),A/Anhui/1/2013 (H7N9) (以下简称为AH01),由本实验室繁殖、传代并保存。293T细胞系、A549细胞系及MDCK细胞系,由本实验室传代并保存。
1.2 载体及菌株大肠杆菌TOP10由本实验室保存;载体pCMV-Myc,不同亚型的pCMV-Myc-NS1质粒,表达流感病毒的反向遗传系统的4个表达质粒Ben9、Ben10、Ben11、Ben13,均由本实验室构建及保存。
1.3 主要试剂用于构建克隆的各种工具酶均购自TaKaRa公司;点突变试剂盒由北京诺派生物科技有限公司惠赠;DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司;TRITC标记羊抗兔IgG购自康为世纪公司;Trizol购自Invitrogen公司;TritonX-100购自Amreso公司;转染试剂Lipo-2000、普通胰酶、蛋白酶抑制剂和TPCK处理的胰酶购自罗氏公司;Myc鼠单、抗AMV反转录酶、RNase抑制剂、荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司;兔抗NS1多克隆抗体由本实验室制备保存;多聚甲醛、BSA和DAPI购自Sigma-Aldrich公司。所有引物由深圳华大基因科技有限公司合成。
1.4 NS1表达载体及点突变克隆的构建取流感病毒A/WSN/33的十二质粒系统中的第8片段为模板,用P1/P2一对引物(表 1),进行PCR扩增获得NS1基因,PCR产物经BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ双酶切,与酶切后的pCMV-Myc载体连接。将连接产物转化TOP10感受态细胞,挑取阳性克隆,经深圳华大基因科技有限公司测序确认获得重组质粒。
Primers | Primer sequence (5′-3′) |
P1 | CCGGAATTCGGATGGATCCAAACACTGTG |
P2 | CGGGGTACCTCAAACTTCTGACCTAATTG |
V22F-F | CATGTCCGCAAAAGATTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCC |
V22F-R | TAGTTCTTGGTCTGCAAATCTTTTGCGGACATGCCAAAGAAAG |
M81I-F | GCACTCAAAATGACCATCGCCTCTGTACCTGCATCGCGCTAC |
M81I-R | TGCAGGTACAGAGGCGATGGTCATTTTGAGTGCCTCATCAGA |
A86S-F | ATGGCCTCTGTACCTTCATCGCGCTACCTAACTGACATGACT |
A86S-R | AGTTAGGTAGCGCGATGAAGGTACAGAGGCCATGGTCATTTT |
A86E-F | ATGGCCTCTGTACCTGAATCGCGCTACCTAACTGACATGACT |
A86E-R | AGTTAGGTAGCGCGATTCAGGTACAGAGGCCATGGTCATTTT |
T197N-F | GTTCGAGTCTCTGAAAATCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGC |
T197N-R | AGCGAATCTCTGTAGATTTTCAGAGACTCGAACTGTGTTATT |
D139N-F | GTGATTTTTAACCGGCTGGAGACTCTAATATTACTAAGGGCC |
D139N-R | GTGATTTTTAACCGGCTGGAGACTCTAATATTACTAAGGGCC |
S205N-F | AGATTCGCTTGGAGAAACAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCA |
S205N-R | CCCATTCTCATTACTGTTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGT |
S205E-F | AGATTCGCTTGGAGAGAGAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCA |
S205E-R | CCCATTCTCATTACTCTCTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGT |
N207D-F | GCTTGGAGAAGCAGTGATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACT |
N207D-R | AGGTCTCCCATTCTCATCACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTG |
同时,设计特异性的点突变引物(表 1),以此引物进行PCR扩增,将PCR产物SDM 37 ℃酶切2 h后转化SDM感受态细胞,挑取阳性克隆,经深圳华大基因科技有限公司测序确认获得重组质粒。
1.5 细胞培养、转染与病毒感染293T、A549、MDCK细胞在含有10%胎牛血清和加入10 000 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中贴壁生长,培养环境为37 ℃、5% CO2。将生长密度为80%的细胞传代至细胞培养皿中,待其生长密度为60%-80%时,进行转染。转染前1−2 h,为细胞更换新鲜的OPTI-MEM培养基。采用Lipo-2000为转染试剂,根据实验需要,转染不同剂量的质粒于293T细胞中。转染后4−6 h后更换新鲜DMEM培养基,转染并收取细胞。病毒感染实验在细胞传代24 h后,将病毒(MOI=0.01)加入病毒感染液中(DMEM、10 000 U/mL经青霉素和链霉素、1 μg/mL TPCK处理的胰酶),感染后1 h为细胞换液为病毒感染液,在合适的时间点收取并固定细胞。
1.6 Western blotting鉴定NS1兔多抗的有效性293T细胞传代至6 cm培养皿,分别用以上5种毒株NS片段为模板构建的pCMV-Myc-NS1转染细胞,8 μg/皿,转染后24 h用细胞裂解液(150 mmol/L NaCl,20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes),1 mmol/L EDTA,1% TritonX-100,10%甘油,蛋白酶抑制剂)收取细胞,4 ℃裂解30 min,12 000 r/min、4 ℃离心15 min,吸取上清中加入10×上样缓冲液,95 ℃处理样品10 min,SDS-PAGE电泳,后将蛋白转移至PVDF膜。用TBST配制含1% BSA,5%脱脂牛奶的封闭液,室温封闭2 h,分别用一抗NS1兔多抗(1:5 000)和Myc鼠单抗(1:2 000)对蛋白进行检测。内参β-actin鼠单抗(1:2 000),室温孵育1 h,TBST洗3次,15 min/次。二抗羊抗兔,羊抗鼠,稀释比例均为1:5 000,室温孵育1 h,TBST洗3次,15 min/次。使用底物显色试剂盒进行曝光显影。
1.7 免疫荧光检测NS1的细胞定位传代293T细胞至铺有玻片的24孔板中,用MOI=0.01的病毒感染细胞,或将0.8 μg/孔pCMV-Myc-NS1转染细胞,在感染或转染后不同时间点收取细胞。使用4%的多聚甲醛室温固定细胞30 min,然后利用含有4% BSA的PBST (PBS中加入0.5% TritonX-100) 37 ℃封闭1 h。加入1:200的兔抗NS1多抗(实验室自制)作为一抗,37 ℃结合1 h,PBST清洗细胞5次,每次10 min。然后加入1:200的荧光二抗TRITC标记抗兔IgG抗体,37 ℃结合1 h;PBST清洗5次,每次10 min。加入DAPI室温染色10 min,PBST清洗3次。然后用封片液(50%甘油,50% PBS)封片,以指甲油固定玻片。激光共聚焦显微镜观察NS1在细胞中的定位情况。
2 结果与分析 2.1 WSN-NS1兔多抗对于不同亚型NS1蛋白均有检测效果不同毒株构建的pCMV-Myc-NS1克隆在293T细胞中进行表达,分别用NS1兔多抗和Myc鼠单抗对蛋白进行检测(图 1),Myc鼠单抗检测组(图 1A)在25 kDa左右处均有明显条带,与预期NS1大小相符,其中CA04-NS1相较于其他毒株分子量略小,与实验结果吻合,未转染对照相应位置无条带;NS1兔多抗检测组(图 1B)在25 kDa左右处也有明显条带,与Myc检测组一致,但在WSN-NS1及PR8-NS1中各出现一条非特异性条带,推测与毒株差异相关。结果显示本实验中所用NS1兔多抗对于不同亚型毒株NS1蛋白均有检测能力。
2.2 不同亚型病毒感染A549细胞系NS1蛋白定位不同将WSN、PR8、CA04、SD四株流感病毒MOI=0.01感染A549细胞,在感染后的6、12和24 h分别固定样品,制片后激光共聚焦显微镜观察。结果如图 2所示,WSN、PR8毒株在感染后的6 h、12 h,NS1蛋白主要定位于细胞核中,而在感染后的24 h蛋白出核,主要定位于细胞质中;而CA04和SD毒株在感染后的3个时间点其NS1蛋白均主要定位于细胞核中,与前两株毒株存在明显的差异。
2.3 不同亚型病毒感染MDCK细胞系NS1蛋白定位差异为了进一步观察这种定位差异是否也存在于其他细胞系中,我们用WSN、PR8、CA04三株流感病毒以相同MOI (MOI=0.01)分别感染MDCK细胞,在感染后的6、12和24 h后收样并制片,后用激光共聚焦显微镜观察。如图 3所示,WSN、PR8感染MDCK后的6 h、12 h,NS1蛋白也主要定位于细胞核中;同样的感染后24 h NS1蛋白出核,主要定位于细胞质中;而CA04在感染后3个时间点NS1蛋白都主要定位于细胞核内。
结果显示,病毒感染后不同时间点NS1蛋白定位存在差异,这种差异有可能导致了NS1蛋白在不同病毒感染中发挥了不同的功能,这也可能在一定程度上解释了不同亚型的流感病毒的毒力、宿主的适应能力和致病性的不同。
2.4 pCMV-Myc-NS1转染293T细胞NS1蛋白差异性定位将质粒pCMV-Myc-NS1 (WSN、CA04、PR8、SD、AH01) 0.8 μg/孔,分别转染293T细胞中,转染后6、12和24 h后分别取出玻片固定后制片,后观察检测NS1蛋白的细胞定位。如图 4所示,在转染情况下不同毒株NS1定位上的差异仍然存在,转染后24 h WSN、PR8主要位于细胞质而CA04、SD主要定位于核内,与病毒感染的结果一致。
同时我们也构建了H7N9亚型毒株AH01-NS1的质粒,结果显示AH01的NS1在转染的后期也主要定位在细胞核中。NS1蛋白定位在细胞核内,主要抑制了宿主自身蛋白mRNA的转录后加工修饰和出核,引起宿主的多种蛋白表达下调,包括多种参与免疫应答的抗病毒免疫蛋白,这也可能与H7N9流感的致死性有较强关联。
2.5 不同亚型毒株的NS1蛋白序列比对分析为了了解这种蛋白定位的差异是否与不同亚型毒株自身的NS1蛋白特性相关,我们比对并分析了上述5种毒株的NS1蛋白序列。图 5结果显示,NS1蛋白的氨基酸序列在不同亚型毒株之间的保守性较差。根据图 5的比对结果,我们选取了关键差异性位点,在WSN-NS1的序列上分别是:V22、M81、A86、D139、T197、S205和N207,根据这些位点设计引物构建点突变克隆(表 1)。具体突变如下:V22F、M81I、A86S、A86E、D139N、T197N、S205E、S205N和N207D。
2.6 关键氨基酸位点突变后NS1蛋白的细胞定位差异以pCMV-Myc-WSN-NS1为模板,获得各点突变体的质粒,分别转染293T细胞,在感染后24 h收集细胞固定并制片。在激光共聚焦显微镜下观察NS1蛋白的细胞定位,结果如图 6所示。各突变体的NS1蛋白与野生型相比,并未发生明显定位差异,转染后24 h均主要定位于细胞质中,结果表明,在所选取的位点中单个氨基酸位点的改变并不能导致NS1定位的明显差异。NS1是一种重要的毒力因子,受到宿主免疫系统进化的巨大压力,只有在多个位点的协调作用下才有可能发生某些功能的改变,具体哪些位点可以协同发挥作用来改变其蛋白定位,将是我们下一步工作的重点。
3 讨论近年来,A型流感病毒严重危害人类健康并造成巨大的经济损失和社会负担,H1N1亚型流感病毒等变异毒株成为研究人员热点关注的领域。2013年首次爆发的H7N9亚型流感病毒为跨种间的传播,且其重要的独立因子NS1蛋白的细胞定位与WSN存在明显的差异,NS1蛋白可能在其跨种间传播和致病机制上发挥了重要作用[17-18]。
NS1蛋白的细胞内定位方式及NS1的分布很可与多种因素相关,如病毒株、细胞类型等。在病毒感染的细胞内NS1优先定位于细胞核,但在感染后期也会部分存在于细胞质中[19]。
NS1的主要功能为参与病毒与宿主相互作用,包括蛋白与蛋白之间、蛋白与RNA之间的相互作用[20-21]。宿主为了抑制流感病毒的复制,被病毒感染的细胞通常会激活多种抗病毒反应。在进化的压力下,流感病毒演变出多种机制来应对宿主细胞的抗病毒反应。NS1蛋白被认为是流感病毒抵制宿主细胞免疫反应的重要蛋白,且其主要功能是抑制宿主细胞干扰素的产生。
不同毒株的NS1蛋白序列长度不同,约在230-237氨基酸之间,相对分子量约为26 kDa。序列比对分析发现,在20世纪40年代,流行的人H1N1病毒NS1蛋白序列通过单核苷酸的突变,在C末端出现了7个氨基酸的延伸。这些延伸在随后的人H1N1、H2N2和H3N2病毒都存在;直到20世纪80年代,当H1N1和H3N2病毒通过回复突变,失去了多出来的7个氨基酸,并发生了共同流行。
在细胞核内NS1蛋白可以与CPSF30、PABPⅡ相互作用来抑制宿主细胞mRNA的成熟和出核,在细胞质中可以同更多的蛋白发生相互作用。近期的研究发现,NS1的C末端的最后几个氨基酸同NS1与宿主蛋白如PABPⅠ的相互作用以及NS1蛋白的核仁定位相关[22]。Burgui等[23]研究表明NS1同eIF4GⅠ、PABPⅠ的结合将翻译所需的细胞因子募集到病毒mRNA附近,有效地提高了病毒蛋白的翻译效率,随后Haller及Kochs等[24-26]报道称NS1同RIG-I、TRIM25等的相互作用,有效地抑制了IFN信号通路的激活,抑制了宿主免疫系统对病毒复制的免疫应答。这些结果表明,NS1蛋白是流感病毒抵制宿主细胞免疫反应的重要蛋白,抑制宿主细胞干扰素的产生。因此,NS1表现出多种抑制活性,对于病毒的复制和感染过程中毒力的提高起到了重要的促进作用。
研究表明,流感病毒在感染A549、MDCK细胞系时其NS1定位存在明显的差异,这种差异不仅存在于不同的亚型病毒间;而且普遍存在于同一种亚型的不同毒株间。我们对NS1序列进行分析,发现在转染的情况下,NS1的定位现象与感染一致。根据电荷差异和空间位阻的不同,本研究选取了其中的部分差异位点进行关键氨基酸位点的突变,其中几个位点是潜在的磷酸化位点,如S205,除突变为N外我们也将它突变为E模拟持续的磷酸化状态[27],但单独的点突变都没有导致WSN-NS1蛋白在细胞内的定位发生明显改变。分析结果认为,不同毒株间的NS1蛋白定位差异并不是由单一氨基酸位点所导致的。这些突变体的细胞定位与野生型病毒相比未发生改变,也许在其他方面能影响NS1蛋白的功能,如是否对干扰素活性存在抑制作用?是否由多位点协同影响其定位差异?某些宿主蛋白与NS1的相互作用是否影响了NS1的细胞定位及抗天然免疫功能?这些问题需要下一步探究。
综上所述,流感病毒的重要毒力因子NS1蛋白参与病毒与宿主相互作用,研究分析在不同亚型中的定位存在差异,这对进一步了解NS1蛋白同宿主细胞不同区域的蛋白的相互作用、流感病毒的调节机制以及病毒感染细胞中天然免疫反应具有一定的指导意义。
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