伏马毒素 (Fumonisin，FB) 是一种对啮齿动物具有致癌作用的真菌毒素，主要破坏肝肾功能^[1]，诱发多种疾病，如马脑白质软化症和猪肺水肿综合症^[2]，已被证明对多种家畜、实验动物有害^[3]。目前FB有11种，主要由轮状、层状镰刀霉菌产生，其中FB₁最常见^[4]。FB₁主要存在于玉米及玉米制品中，小麦、牛奶等食品及饲料易被污染^[5]。世界卫生组织对FB限量标准因各地的玉米及玉米制品的产量不同而异，美国食品与药物管理局规定以玉米为原料的食品中 FB的最高限量为2 mg/kg，动物饲料的限量范围为1−50 mg/kg。

目前检测FB₁的方法主要是薄层色谱法^[6]、高效液相色谱法^[7]、酶联免疫吸附试验 (ELISA)^[8]等。这些方法对检测仪器及操作人员要求较高，因此不宜进行现场检测；其中，基于抗体的ELISA方法所需的抗体制备繁琐^[9]，因此亟待建立一种快速检测FB₁的方法。

核酸适配体 (Aptamer) 是一种功能与抗体相似的单链寡核苷酸。经指数富集配体的系统进化技术^[10]筛选得到的核酸适配体可与目标物质特异性结合^[11]，如蛋白质^[12]和药物^[13]等。核酸适配体可直接合成使用，经济实用，易修饰且无免疫原性^[14]。现已报道的基于核酸适配体的检测方法有：磁珠法^[15]、胶体金法^[16]、荧光标记法^[17]等。

本文选用已报道的亲和度最高的FB₁特异性核酸适配体，利用非标记荧光染料PicoGreen识别双链核酸的特异性，建立了一种快速、高效检测FB₁的方法。该方法的原理^[18]是：当核酸适配体与FB₁结合后，多余的、未结合FB₁的核酸适配体可以与反应体系中核酸适配体的互补链杂交生成双链DNA。由于PicoGreen不结合单链核苷酸，仅识别并结合双链DNA的螺旋沟，继而可以释放荧光信号^[19]。当不同浓度的FB₁与特定浓度的核酸适体结合时，反应液中的荧光强度不同，从而可以实现快速定量检测FB₁的目的。

96孔板购自Conning公司 (Costar2592)；荧光检测仪购自BioTek公司 (Synergy™ H1)；超纯水仪购自Thermo Fisher Scientific公司 (D11921)。

FB₁、赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)、黄曲霉毒素B₁ (Aflatoxin B₁，AFB₁)、桔毒素 (Citrinin，CTN) 和玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN) 购自Sigma公司；PicoGreen购自 Life Technologies公司 (P7581)；伏马毒素ELISA检测试剂盒购自Reagen公司 (RNM98009，检测线性范围：1−50 ppb)。

FB₁核酸适配体 (FB₁ 39号)^[20]、核酸适配体互补链Seq1 (表1) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

PicoGreen是一种定量检测双链DNA的染料，灵敏度可达pg级，与双链DNA结合后荧光增强1 000倍以上，且不与单链DNA结合。当FB₁核酸适配体结合FB₁后，适配体的空间构象发生变化，不能再与其互补链Seq1结合。未与FB₁结合的核酸适配体可与其互补链杂交形成双链DNA。由此产生的双链DNA可通过由PicoGreen检测，通过荧光信号的变化确定样品中的FB₁浓度^[21] (图1)。

图1 PicoGreen和适配体检测FB1的原理图 Fig.1 Schematic presentation of the PicoGreen/aptamer- based method for detection of FB1

图选项

所有反应试剂以10 mmol/L Tris、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl₂ (pH 8.5) 组成的缓冲液^[22]为稀释溶液。分别取50 μL 10 nmol/L核酸适配体与50 μL 10 nmol/L 互补链Seq1，于95 ℃变性5 min，静置于冰上10 min^[23]。将核酸适配体与互补链于孔内混匀，于25 ℃反应5 min^[24]，再加入10 μL 10×PicoGreen溶液避光反应，检测荧光强度 (参数设置：激发波长为480 nm，发射波长为520 nm)。

取50 μL核酸适配体和50 μL互补链Seq1于孔内混匀 (1∶1)，于25 ℃反应5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen后立即放入荧光检测仪内，连续检测30 min。

将FB₁稀释成质量浓度为0−1 μg/L的溶液，取50 μL FB₁溶液与25 μL 20 nmol/L核酸适配体混匀，25 ℃反应20 min，加入25 μL 20 nmol/L互补链Seq1溶液反应5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混匀避光，检测荧光强度。

稀释FB₁、OTA、AFB₁、CTN和ZEN质量浓度为1 μg/L，分别取50 μL霉菌毒素溶液与25 μL 20 nmol/L FB₁核酸适配体混匀，25 ℃反应20 min，加入25 μL 20 nmol/L互补链Seq1溶液反应5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混匀避光，检测荧光强度。

在含1%牛奶的溶液内添加FB₁，其中28份样品内含有FB₁，浓度分别为1、2、2.5、5、10、50和100 μg/L (样品重复数n =4)，10份样品无FB₁，使用本文建立的方法检测，计算实际检测值与理论值的比值。同时用商品化的ELISA试剂盒方法进行检测，计算Kappa值，并评估两种方法是否一致。本研究方法：将样品稀释为 1 μg/L，取50 μL样品溶液与25 μL 20 nmol/L核酸适配体混匀，25 ℃反应20 min，加入25 μL 20 nmol/L互补链Seq1溶液反应5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混匀避光，检测荧光强度。ELISA检测试剂盒操作方法：在包被有FB₁抗原的微孔板中，每孔加入50 μL样品溶液，再依次加入50 μL HRP标记的二抗，50 μL FB₁抗体，室温孵育30 min，用300 μL洗涤缓冲液清洗3次，每孔加入100 μL TMB溶液，室温孵育15 min，再加入100 μL终止液终止反应，读取OD₄₅₀，根据制作的标准曲线计算样品中OTA含量。计算ELISA方法和本试验建立的核酸适体-荧光染料检测法之间的Kappa值^[25]。

建立基于PicoGreen和核酸适配体方法检测FB₁的前提是确定PicoGreen分别与适配体单链核苷酸、适配体和互补链之间形成的双链核苷酸、缓冲液、FB₁反应后是否释放荧光，该荧光是否可以被仪器识别并能用于后续的检测。

结果显示，核酸适配体与互补链Seq1的杂交产物双链DNA结合PicoGreen后能够释放荧光信号，可以被荧光检测仪捕捉。单链核苷酸或缓冲液本身不与PicoGreen结合，不能释放出荧光信号 (图2)。这说明PicoGreen和核酸适配体可以用于FB₁毒素检测技术的开发。

图2 FB1核酸适配体形成的双链DNA与PicoGreen结合后的荧光检测 Fig.2 Detection of PicoGreen fluorescence in the presence of FB1 aptamer hybridizer

图选项

PicoGreen结合双链DNA后会被瞬间激发产生荧光，随着时间推移荧光强度不断增强，直到反应体系中PicoGreen与双链DNA的结合达到饱和为止。对于FB₁特异性检测技术的开发，加入反应体系中的PicoGreen和核酸适配体浓度均为固定值，因此需要确定在特定浓度下荧光强度达到峰值的时间。由图3可知，反应体系内加入PicoGreen后，PicoGreen与FB₁核酸适配体形成的双链DNA结合后随即释放出荧光，随着反应时间的推移，荧光强度在15 min时趋于稳定，并达到峰值。当PicoGreen浓度固定时，荧光强度随双链DNA的增多而增强，直到PicoGreen完全结合双链DNA为止。因此，在后续的检测技术的开发中，选择15 min 作为PicoGreen与样品的反应时间。

图3 PicoGreen与双链DNA最佳反应时间的确定 Fig.3 Determination of the optimal reaction time of PicoGreen and double-stranded DNA. F0 and F stand for the fluorescence intensity with or without DNA

图选项

灵敏度又称敏感性或最低检测限，是检测技术开发的一个关键参数。根据上述确定的最佳反应时间，利用PicoGreen和核酸适配体方法对不同浓度的FB₁进行检测。结果表明，在反应体系中随着FB₁质量浓度的增加，PicoGreen释放的荧光强度逐渐减小 (图4A)。这说明FB₁结合的核酸适配体增多，导致与后加入的互补链Seq1结合的核酸适配体减少，因此与PicoGreen结合的双链DNA量减少，激发产生的荧光强度减小。该方法的检测下限为0.1 μg/L (0.1 ppb)，线性范围为0.1−1 μg/L (0.1−1 ppb) (图4B)。

图4 FB1的灵敏度检测 Fig.4 Sensitivity test of the aptamer/PicoGreen-based method. (A) Sensitivity determination at FB1 concentrations ranging from 0.1 to 1 μg/L. (B) Standard curve plotted with F/F0 against the concentration of FB1. F0 and F stand for the fluorescence intensity with or without FB1

图选项

特异性又称交叉反应性，是评价检测技术好坏的一个重要标志。为了证实本检测技术采用的核心试剂FB₁适配体和PicoGreen是否只能用于检测FB₁，不能和其他毒素发生交叉反应。我们对食品中常见的霉菌毒素FB₁、OTA、ZEN、CTN、AFB₁进行了检测。结果表明，毒素质量浓度相同时，PicoGreen检测OTA、ZEN、CTN、AFB₁反应体系的荧光强度最大，而FB₁反应体系的荧光强度最小 (图5)。这说明在有FB₁的反应体系内，核酸适配体与FB₁发生了特异性结合，少量的核酸适配体与互补链Seq1结合，产生与PicoGreen结合的双链DNA，因此激发产生少许荧光；其他毒素的反应体系中的核酸适配体与互补链Seq1完全结合，产生大量双链DNA，激发产生更多的荧光。即当样品中有FB₁时，荧光强度较小，反之荧光强度较大。由此可知，本文选择的核酸适配体可特异性识别并结合FB₁，与OTA、AFB₁、CTN或ZEN不发生交叉反应。

图5 基于核酸适配体与PicoGreen检测FB1的特异性试验 Fig.5 Specificity test of the aptamer/PicoGreen-based method

图选项

为了比较基于核酸适体的荧光检测法与基于抗体的商业化ELISA检测试剂盒方法之间的符合度，以验证本方法检测样品的准确度。本实验室对38份牛奶样品进行了检测，计算出本方法的回收率 (表2)，低浓度条件下，回收率较低；当浓度大于10 μg/L时，回收率高达99%。利用统计方法计算Kappa值为0.857 (检测样品浓度为0、1、2、2.5、5、10 μg/L)，两种方法的检测结果具有良好的一致性 (表3)，可用于样品中FB₁的检测。

食品安全问题一直是世界关注的焦点，其中霉菌毒素污染最为常见。FB₁主要污染玉米和玉米制品，严重危害人类和动物的健康^[26]。食品和饲料行业的检测目前主要是免疫法和色谱分析法，存在设备与试剂昂贵、样品处理繁琐等不足之处^[27]。

核酸适配体是完全不同于抗体的一种单链核苷酸，可形成茎环、发夹和G-四聚体 (G-quadruplex) 等结构并与靶分子特异性结合，目前已被广泛应用于生物样品的检测^[28]。

由本研究建立的基于核酸适配体的荧光检测法选择的FB₁核酸适配体具有高特异性，与常见的霉菌毒素不发生交叉反应。该荧光检测法的检测灵敏度为：0.1 μg/L，比商业化的检测灵敏度高10倍 (美国Reagen公司，RNM98009，检测灵敏度为：1.0 μg/L)。

本研究建立的检测方法线性范围0.1−1 μg/L是根据伏马毒素标准品 (纯品) 进行的检测。回收率是根据人工污染牛奶样品进行的检测。对于人工污染的样品，需要利用甲醇萃取等步骤进行回收，然后才能按照标准步骤进行FB₁含量检测。原始样品中伏马毒素含量越少，回收时损失越大。当样品中伏马毒素含量超过10 μg/L (μg/kg) 时，本方法的回收率可以达到97%以上，而国际上对食品和动物性饲料中允许的最大残留量分别是1 000−2 000 μg/kg，因此可以用于实际样品的检测。所以本实验针对的原始样品中伏马毒素的回收率是符合要求的，检测线性范围和回收率不矛盾。为保证检测结果的准确性，当样品中FB₁含量超过1 μg/L时，需要将样品稀释到线性范围内。

本研究建立的基于核酸适配体与荧光染料PicoGreen的新方法将反应体系内未知浓度的FB₁转换为可以定量检测的荧光信号，达到检测FB₁的目的，特异性强，灵敏度高。整个检测过程可在40 min内完成，具备快速、易操作的特点。本研究建立的基于核酸适配体与PicoGreen检测FB₁的方法为霉菌毒素的检测提供了新的思路，具有广阔的应用前景。