抗冻蛋白 (Antifreeze protein，AFP) 是一类广泛存在于鱼类、植物、真菌、昆虫等变温生物中的蛋白质^{[1, 2]}，具有来源、类型、结构和活性的多样性^[3]。抗冻蛋白的主要功能是热滞效应 (Thermal hysteresis activity,THA)，即降低溶液的冰点，但不改变其熔点，从而产生冰点与熔点之间的温度差值。这种热滞值越大，抗冻蛋白的活性就越高^[4]，因而AFP亦称为热滞蛋白 (Thermal hysteresis protein,THP)。抗冻蛋白可以抑制冰晶生长，并改变冰晶形态；植物和鱼类抗冻蛋白还具有重结晶抑制效应 (Recrystallization inhibition,RI)^[5]。昆虫抗冻蛋白具有十分独特的b-螺旋结构，由数目不等的保守基序TCTxSxxCxxAx (X代表任意氨基酸) 组成，分子内部可形成众多二硫键^[6]。在所有抗冻蛋白中，昆虫抗冻蛋白具有很高的热滞活性，黄粉虫抗冻蛋白浓度为1 mg/mL时的热滞活性可达5.5 ℃，为鱼类抗冻蛋白热滞活性的10−100倍^{[7, 8]}。因此昆虫抗冻蛋白可能具有更高的应用价值。

抗冻蛋白可用于细胞、组织和器官的超低温保存^{[9, 10]}，使冷藏和冷冻食品保持质地柔软，减少滴液以防止营养成分的损失^{[11, 12, 13]}。鱼类AFP添加于冰淇淋和牛奶中，可消除冰渣，改善质量和口味^[14]。目前，昆虫抗冻蛋白已在原核生物中成功表达，赵干等^[15]克隆并利用大肠杆菌表达了小胸鳖甲 Microdera punctipennis 融合抗冻蛋白，该蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用。大肠杆菌表达系统具有时间短、成本相对较低的优势，但由于目的蛋白常以包涵体形式表达，影响产物的活性^[16]。Leinala等^[17]在大肠杆菌中表达了云杉卷叶蛾抗冻蛋白，但都是无活性的包涵体，需经变性复性处理，得到部分有活性的蛋白。L oewen等^[18]用酵母菌表达美绒杜父鱼Hemitripterus americanus II型AFP，经过对发酵条件的优化，可使l0 L发酵罐的产量达30 mg/L。Li等^[19]用分泌载体pGAP ZaA在巴斯德毕赤酵母的蛋白水解酶缺陷型SMDl168H体内表达大西洋鲱鱼Clupea haren gus的Ⅱ型AFP，该蛋白具有抗冻功能，酵母细胞在低温下的存活率得以提高。赵干等^[20]利用pGAPZαA真核表达载体在SMD1168中表达了有活性的小胸鳖甲抗冻蛋白。由于SMD1168为蛋白酶缺失型菌株，生长缓慢，导致外源蛋白的产量不高^[21]。另外，pGAPZαA表达载体以Zeocin为选择性标记，而Zeocin是一种强诱变剂，可能导致转化子发生突变。从应用的角度考虑，需要建立一个更为可行的表达系统。

本研究选用pPIC9K作为酵母整合载体，该载体在多克隆位点前含有信号肽编码序列，使表达的蛋白分泌到胞外，而酵母自身分泌的蛋白很少^{[22, 23]}，便于目的蛋白的纯化与浓缩。pPIC9K含组氨酸脱氧酶基因 (HIS4)，在转化菌株中作为筛选标志，含有抗G418 (Kanamycin) 的基因，可通过提高G418的浓度，简便快速地筛选高拷贝的转化子。本研究所采用的抗冻蛋白MpAFP698源自新疆荒漠昆虫小胸鳖甲^[15]，通过原核表达质粒pGEX-4T-1-Mpafp698，获取目的基因Mpafp698，构建真核表达载体pPIC9K-Mpafp698，电转化毕赤酵母，并将Mpafp698导入酵母GS115基因组中，筛选高拷贝转化子，以期提高抗冻蛋白的表达量，为昆虫抗冻蛋白的应用奠定基础。

大肠杆菌Escherichia coli菌株，pGEX-4T-1- Mpafp698质粒，pPIC9K质粒，宿主菌Pichia pastoris GS115均为本实验室保存。昆明白小鼠购自新疆医科大学动物中心。

超纯水，氨卞青霉素 (Amp)、G418抗生素，限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和pMD18-T载体均购自大连TaKaRa公司；DNA相对分子质量标准物、蛋白质相对分子质量标准物和DNA片段回收试剂盒购自北京天根生物工程公司；YPD固体培养基、YPD液体培养基、BM GY培养基、BMMY培养基及其他试剂均为国产分析纯。

利用本实验室构建的原核表达质粒pGEX-4T-1-Mpafp698，获取小胸鳖甲的抗冻蛋白基因Mpafp698 (GenBank Accession No. AY821792)。用限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEX-4T-1-Mpafp698，经0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Mpafp 698基因片段；将质粒pPIC9K同样用NotⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收pPIC9K载体片段，用T4 DNA连接酶在16 ℃过夜连接pPIC9K载体与Mpafp698基因片段，获得重组质粒pPIC9K-Mpafp698 (图1)。连接产物转化E. coli TOP10感受态细胞，涂布于LB平板上 (含1‰氨苄青霉素)，筛选重组子。碱裂解法小量提取重组质粒pPIC9K-Mpafp698，并用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化，用电转仪 (2.0 kV，5−10 ms) 转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并涂布于G418抗性选择YPD平板上，30 ℃培养2−4 d后，挑取抗G418的阳性克隆，提取酵母基因组DNA。载体上携带有醇氧化酶基因(AOX1)，用3′AOX1引物和5′AOX1引物 (表1) 进行PCR扩增，鉴定转化菌。以空载体pPIC9K同样转化酵母菌，作为对照。

图1 pPIC9K-Mpafp698重组质粒示意图 Fig.1 Schematic diagram of pPIC9K-Mpafp698 recombinant plasmid

图选项

在无菌条件下将重组转化的酵母菌单克隆接种到25 mL BMGY培养基中，30 ℃摇床振荡培养 (250 r/min) 至OD₆₀₀达到4.0−6.0 (大约16−18 h)。室温条件下4 500 r/min离心5 min后收获菌体，用BMMY培养基稀释菌体至OD₆₀₀=1.0。在1 L的三角瓶中培养，在30 ℃恒温摇床振荡培养菌液 (250 r/min) 。每隔24 h补加100％甲醇至终浓度0.5%，培养至96 h时终止诱导。三氯乙酸 (TCA) 法浓缩纯化酵母表达的MpAFP698。对空载体pPIC9K转化菌也进行同样的诱导表达。

取发酵上清浓缩液加入6×SDS上样缓冲液煮沸5 min，12 000 r/min离心2 min，取上清进行Tricine SDS-PAGE检测，以等量空载体转化菌的诱导后上清液做相同处理作为对照组。电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。用1%脱脂奶粉封闭2 h，依次滴加一抗稀释液 (室温反应2 h、PBS洗涤3次) 及羊抗兔IgG：HRP (室温反应1 h、PBS洗涤3次)，最后加底物DAB显色并拍照。一抗为小胸鳖甲抗冻蛋白的特异性兔抗血清，由本实验室制备。

使用渗透压仪 (Automatic Osmometer，Model 5004，北京迪索公司) 测量溶液的渗透浓度，单位为毫渗 (mOsm)｡1 mOsm相当于 1 mmol/L溶质溶于1 kg水中，而1 Osm/kg的溶质会使溶液的冰点下降1.858 ℃。所以，将渗透浓度乘以-1.858可估算样品的冰点值。因此，热滞活性 (THA) 的近似计算方法为：-1.858× (对照溶液的渗透浓度−抗冻蛋白溶液的渗透浓度) mOsm/1 000。选取不同浓度的抗冻蛋白，每组设3个重复。

选取昆虫卵巢细胞SF9为实验材料。收集对数生长期的细胞，在培养液中分别加入：BSA (阴性对照)、10%DMSO、MpAFP，另设一组只有培养液的空白对照。细胞的最终密度为5×10⁶/mL-1×10⁷/mL，将细胞分装入冻存管中，放入−20 ℃冰箱2 h，然后放入−70 ℃冰箱过夜，之后移入液氮容器内。细胞在37 ℃温水中复苏后，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，用尼康光学显微镜 (Nikon,Japan) 观察细胞形态 (10×20倍)，用细胞计数板计数。同时，使用电导仪 (雷磁，DDS-307A，上海) 测定细胞电导率，单位以微西门子每米 (mS/m) 表示，通过电导率来判断细胞完整性以及冷冻保藏剂对细胞的保护效果。

为了检验抗冻蛋白在血细胞保存方面的效果，采用后眼眶采血法采集昆明白小鼠血液，经2 000 r/min离心10 min弃上清。用10 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗涤红细胞3−4 次，PBS重悬细胞，并将红细胞稀释为10%浓度。将75 µL 10%红细胞悬液与不同体积的MpAFP698和BSA混合至终体积为150 µL，使抗冻蛋白终浓度为0.05 mg/mL，BSA终浓度为0.05 mg/mL。加入同体积PBS的细胞悬液作为阴性对照。每个样品设3个重复。分别置于4 ℃、室温 (20 ℃)、−20 ℃处理，观察溶血情况并拍照。

使用颈椎脱臼法处死昆明白小鼠，分别取出心、肝、脾、肾和股骨肌，用生理盐水洗净。实验组使用抗冻蛋白溶液浸泡器官，对照组以生理盐水浸泡器官，分别将实验组和对照组置于4 ℃和−20 ℃处理后，制作小鼠组织器官的石蜡切片，用尼康光学显微镜观察石蜡切片 (10×20倍)。

对整合了pPIC9K-Mpafp698外源基因的酵母菌提取基因组DNA，以3′AOX1和5′AOX1分别为上下游引物，进行PCR扩增 (图2)。空白酵母由于自身带有野生型AOX1基因，可扩增出一条2 200 bp的条带。线性化的pPIC9K空载整合到酵母基因组后，PCR扩增会出现一条 2 200 bp的条带和一条来源于GS115/pPIC9K的AOX1基因，大小为492 bp (图2，泳道1、2)。若宿主菌的基因组中整合了线性化的pPIC9K-Mpafp698，则PCR会扩增出一条 2 200 bp的条带和一条与AOX1 (GS115/pPIC9K) 相融合、带有目的基因的798 bp的条带 (492 bp+ 306 bp) (图2，泳道3−9)。

图2 pPIC9K-Mpafp698整合的重组酵母的PCR 鉴定 Fig.2 Identification of the recombinant yeast containing pPIC9K-Mpafp698 by PCR. M: DNA marker DL15000+2000; 1−2: GS115-pPIC9K; 3−9: GS115-pPIC9K-Mpafp698; 10: pPIC9K; 11: negative control with no template

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选取抗高浓度G418 (4.0 mg/mL) 的酵母菌株 (含pPIC9K-Mpafp698) 和空载体转化菌 (含pPIC9K) 进行甲醇诱导表达，上清液经TCA沉淀纯化，制备成电泳样品后，进行Tricine SDS-PAGE分析 (图3)。泳道1−4是不同的重组转化菌株，泳道5是空载体pPIC9K转化菌。结果显示，与空载体转化菌相比，在15 kDa和30 kDa附近重组菌均有诱导表达蛋白的条带出现，其中30 kDa条带大于理论值，可能是二聚体。

图3 发酵上清液的SDS-PAGE检测 Fig.3 SDS-PAGE analysis of the fermentation supernatants. M: protein molecular weight standard; 1−4: fermentation supernatant of GS115-pPIC9K-Mpafp698 recombinant yeast; 5: fermentation supernatant of GS115-pPIC9K recombinant yeast. The arrows indicate the bands of the target protein

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将Tricine SDS-PAGE后的凝胶转印到硝酸纤维素膜进行Western blotting 分析，结果显示，pPIC9K-Mpafp698整合菌在15 kDa和30 kDa附近分别出现特异性条带，而空载体转化菌未出现任何条带 (图4)，证明重组菌表达的蛋白能被抗冻蛋白MpAFP698的特异性抗血清所识别，发生抗原抗体特异性免疫反应，表明MpAFP698获得表达。其中30 kDa附近的条带呈扩散状，可能与存在不同程度的糖基化修饰或形成聚合体有关。每升发酵液中抗冻蛋白的表达量可达0.85 g，热滞活性为1.55 ℃。

图4 发酵上清液的Western blotting检测 Fig.4 Western blotting analysis of the fermentation supernatant. M: prestained protein molecular weight standard; MpAFP: GS115-pPIC9K-Mpafp698 fermentation supernatant; pPIC9K: GS115-pPIC9K fermentation supernatant. The arrows indicate the bands of the expressed protein

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将对照组和分别添加了DMSO、BSA和MpAFP的不同处理组的细胞冰冻复苏后，进行细胞计数。结果表明，添加抗冻蛋白组的细胞数显著多于其他各组 (图5)，说明抗冻蛋白可以有效地保护细胞。设置BSA无关蛋白组可以排除添加的蛋白本身对细胞存活的影响。

图5 不同处理组SF9细胞冰冻复苏后的计数结果 Fig.5 Numbers of SF9 cells after freeze-thaw with addition of different agents. CK: cell culture only; BSA: with addition of BSA; DMSO: with addition of DMSO; AFP with addition of MpAFP

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在上述细胞计数的同时，观察细胞形态。可以看到，在冰冻复苏后，添加MpAFP的SF9细胞形态饱满，活细胞数高于对照组和添加DMSO保护剂的细胞 (图6)，说明抗冻蛋白对细胞具有良好的抗冻保护作用。

图6 不同处理组SF9细胞冰冻复苏后的显微形态观察(10×20倍) Fig.6 Microscopic morphology (10×20 times) of SF9 cells after freeze-thaw with addition of different agents. CK: cell culture only; BSA: with addition of BSA; DMSO: with addition of DMSO; AFP with addition of MpAFP

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通过检测冰冻复苏后细胞的电导率，可以判断细胞完整性。结果表明，添加抗冻蛋白组的电导率和添加DMSO组的电导率均低于CK对照组 (图7)，抗冻蛋白组极显著地低于CK对照组 (F_2,6=25.10,F_{0.01 (2,6)} =10.92,P＜0.01)，且显著低于DMSO组 (F_2,6=8.815,F_{0.05 (2,6)} =5.143,P＜0.05)，说明AFP组的细胞完整性较好。

图7 不同处理组SF9细胞冰冻复苏后的电导率 Fig.7 Conductivity of SF9 cells after freeze-thaw with addition of different agents. CK: cell culture only; BSA: with addition of BSA; DMSO: with addition of DMSO; AFP with addition of MpAFP. Different letters show statistical significance

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对红细胞的保护实验结果显示，在室温 (20 ℃) 放置2 d时，PBS空白对照组和BSA对照组都出现了浑浊，表明有溶血现象，而抗冻蛋白组的上清液仍保持清澈，溶血现象不明显；在室温放置4 d时3组均出现了浑浊，表明发生了溶血现象(图8A)。在4 ℃放置2 d时，PBS组、BSA组和MpAFP处理组的血液上清液都很清澈，红细胞溶血现象均不明显；而在4℃放置4 d时，PBS组和BSA组都出现了严重的溶血现象，相比之下，添加抗冻蛋白组的上清液较为清澈，溶血现象较轻 (图8B)，说明在4 ℃低温条件下抗冻蛋白对红细胞起到明显的保护 效果。

图8 不同温度下MpAFP对红细胞的保护效果 Fig.8 Protective effect of MpAFP698 on red blood cells at different temperatures. Red blood cells were added with PBS,BSA and AFP respectively at 20 °C (A) and 4 °C (B) for 2−4 days

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检测MpAFP698对低温处理的小鼠肌肉、心、肝、肾的保护作用，石蜡切片在光学显微镜下 (10x20倍) 观察显示，与对照组相比，AFP组的肌肉 (图9)、肾脏 (图10)、肝脏 (图12) 在4 ℃和−20 ℃处理后，细胞间隙较小，保护效果显著。其中，抗冻蛋白对肝脏的保护效果在4 ℃最为显著，而对心脏 (图11) 的保护效果在两种温度下都不明显。

图9 MpAFP对肌肉保护的石蜡切片观察(10× 20倍) Fig.9 Paraffin sections (10×20) of mouse muscle protected with MpAFP

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图10 MpAFP对肾脏保护的石蜡切片观察(10× 20倍) Fig.10 Paraffin sections (10×20) of mouse kidney protected with MpAFP

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图11 MpAFP对心脏保护的石蜡切片观察(10× 20倍) Fig.11 Paraffin sections (10×20) of mouse heart protected with MpAFP

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图12 MpAFP对肝脏保护的石蜡切片观察(10×20倍) Fig.12 Paraffin sections (10×20) of mouse liver protected with MpAFP

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利用抗冻蛋白进行生物材料的低温保存，具有无毒无害、环保友好的优势。本研究通过构建荒漠昆虫抗冻蛋白基因的酵母表达载体pPIC9K-Mpafp698，并将其整合到酵母基因组中，获得了可分泌表达昆虫抗冻蛋白的重组酵母菌GS115-pPIC9K-Mpafp698。经甲醇诱导表达，可获得目的蛋白MpAFP698的分泌表达。以空载体转化菌为对照，对发酵上清液进行Tricine SDS-PAGE检测，结果显示，分泌表达的绝大多数蛋白都是抗冻蛋白，表明该系统用于抗冻蛋白表达具有杂蛋白少、纯化方便的优势，这与酵母pPIC9K表达载体分泌表达外源蛋白而自身蛋白很少分泌表达是一致的^{[22, 23]}。在15 kDa和30 kDa附近都出现了诱导表达的蛋白条带，经免疫印迹分析，两个条带都能与目的蛋白MpAFP698产生特异性的抗原抗体反应，所以可以确定二者都是目的条带。出现较大条带的原因可能是糖基化、脂质化等修饰作用^[24]。还可能存在多聚体现象，甲虫抗冻蛋白的显著特征是以不同数目的12-氨基酸重复序列组成的大量长短不一的蛋白质大家族，富含半胱氨酸^[6]，有可能在分子间形成二硫键而聚合，导致蛋白多聚体的出现，30 kDa条带有可能是二聚体。该蛋白的相关理化性质值得深入研究。我们所表达抗冻蛋白浓度为12.85 μmol/L (0.85 g/L)，热滞活性为1.55 ℃，活性远高于鱼类抗冻蛋白，如美洲拟鲽 Pleuronectes americanusⅠ型AFPs在浓度达400 μmol/L时，仅能使冰点降低0.27 ℃^[25]，但这一活性低于黄粉虫幼虫天然抗冻蛋白的5.5 ℃^[7]，可能是由于抗冻蛋白特殊的β-螺旋结构折叠不完全所致^[26]。

荒漠甲虫小胸鳖甲抗冻蛋白在冰冻条件下能够有效保护SF9细胞，细胞复苏后的活细胞数和生长状态都比BSA对照组要好，电导率低于对照组，表明细胞膜的完整性较好。Tomczak等研究认为，抗冻蛋白具有稳定膜结构的功 能^[27]。Prathalingam等发现鱼类Ⅰ型抗冻蛋白可以显著提高精子细胞的渗透调节能力^[28]。在室温和低温下的一定时间内，MpAFP都能有效保护红细胞，与其能够稳定细胞膜结构的推测是一致的。这是首次报道抗冻蛋白在室温条件下仍能发挥保护作用。除了对单细胞具有保护作用外^[29]，本研究还发现，小胸鳖甲抗冻蛋白对组织器官在低温下也有显著的保护作用，尤其是对肝脏的低温保护效果十分显著 ，鱼类抗冻糖蛋白对小鼠肝脏也有很好的低温保护效 果^[30]。比较抗冻蛋白对不同器官的低温保护效果，发现MpAFP对心脏的保护效果不显著，抗冻蛋白这种低温保护效果的组织差异性的原因还有待深入研究。

本研究通过酵母表达系统获得荒漠甲虫抗冻蛋白MpAFP698，该蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等的细胞形态，提高SF9细胞的存活率，降低血细胞的溶血率，为今后利用基因工程手段降低生产成本、生产高活性的抗冻蛋白奠定了基础，抗冻蛋白在医学、农业、食品等领域将具有广阔的应用前景。