2015, Vol. 108服务
文章信息
- 朱贵明, 邱立红, 孙洁, 商宇, 江旭东, 葛堂栋, 张涛 江旭东, 葛堂栋, 张涛
- Zhu Guiming, Saleh Abdulmomen Ali Mohammed, Bahwal Said Ahmed, Qiu Lihong, Sun Jie, Shang Yu, Jiang Xudong, Ge Tangdong, Zhang Tao
- 哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸
- Reconstitution of polyunsaturated fatty acid synthesis enzymes in mammalian cells to convert LA to DHA
- 生物工程学报, 2015, 108(2): 281-291
- Chin J Biotech, 2015, 108(2): 281-291
- 10.13345/j.cjb.140235
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文章历史
- Received: April 19, 2014
- Accepted: July 11, 2014
DHA (Docosahexaenoic acid,22:6n-3) 是一种碳链长为22C且含有6个双键的ω-3系的多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids,PUFA)，俗称“脑黄金”，通常来源于深海鱼油以及一些藻类等生物[1]。DHA在人体内的生物学功能例如促进大脑及其他中枢神经系统的发育、提高婴幼儿认知能力、抗炎症反应及抗肿瘤作用等已经有了比较深入的研究和揭示[1, 2, 3, 4, 5, 6]。目前，DHA制品已经被广泛加入婴幼儿食品等食物及其他保健品中，并被用于抗炎症及抗肿瘤等相关疾病治疗的辅助药物[7, 8, 9, 10]。然而，随着深海鱼类等资源的枯竭以及污染等问题，DHA的自然来源却越来越受到限制。因此，开发DHA等多不饱和脂肪酸新型产品以满足人类的需求成了必经之路。
相对于深海鱼类等海洋食物资源，陆地型的动植物食物资源才是世界范围内更多人群的主要选择，陆地型的肉类食品更是占有重要的地位。这些动物脂肪以饱和脂肪酸为主，不饱和脂肪酸含量很低，DHA等多不饱和脂肪酸则更低，例如100 g猪肉仅含2 mg DHA,100 g牛肉仅含1 mg DHA[11]。这种不平衡的动物脂肪酸已经成为了现今危害人们健康的重大因素。事实上，哺乳动物中存在比较完整的多不饱和脂肪酸去饱和酶和延长酶，它们交替作用，可以将来源于植物油脂的α-亚麻酸 (ALA,18:3n-3) 转化成为DPA (22:5n-3)。接下来，DPA (22:5n-3)进入“Sprecher”途径，进一步延长为24:5n-3，再由Δ6-脂肪酸去饱和酶转变为24:6n-3，最后经β-氧化后生成DHA (22:6n-3)[12, 13]。然而，上述过程的效率很低 (小于1%)[14, 15, 16]，说明哺乳动物具有某种抑制DHA (22:6n-3) 等长链多不饱和脂肪酸高水平合成的机制。
我们的前期研究应用转基因技术将哺乳动物来源的Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶4种酶的编码基因构建成为一个多基因表达载体，然后转染哺乳动物细胞HEK293T，实现了4个目的基因的超表达。气质联用 (GC-MS) 分析证实了添加在细胞培养基中的底物ALA (18:3n-3) 被细胞摄取后能有效地转化成为DHA (22:6n-3)，其含量较对照组细胞提高了2.5倍[17]。在另一项研究中，我们将来源于线虫C. elegans的Δ15去饱和酶基因和小眼虫Euglena gracilis的Δ4去饱和酶基因构建成一个双基因表达载体转染胞HEK293T，结果证明Δ4去饱和酶可与Δ15去饱和酶协同作用，即Δ15去饱和酶不仅将添加的亚油酸 (LA,18:2n-6)和花生四烯酸 (ARA,20:4n-6) 转化为ALA (18:3n-3) 和EPA (20:5n-3)，而且也能将22:4n-6 (为20:4n-6经过延长作用的产物) 转化为DPA (22:5n-3)；Δ4去饱和酶活性则正好将细胞中积累的DPA (22:5n-3) 直接转化为DHA (22:6n-3)，而不必经过复杂而低效的“Sprecher”途径[18]。尽管这两项研究均能够有效提高了DHA的水平，但在实践中可能会受到一些限制，例如第一项研究需要添加ALA，而自然界ALA的资源分布远少于LA，且远不如LA经济；第二项研究在添加LA的同时也要添加ARA才能够有效获得DHA，而ARA价格也昂贵。最佳的思路是找到一种策略可将LA有效转化为DHA。
本研究将上述两项研究结合起来，将含Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶编码基因的多基因表达载体，与含Δ15去饱和酶和Δ4去饱和酶编码基因的双基因表达载体共转染哺乳动物细胞，使上述6种酶联合表达 (或表达)，实现了将唯一添加到细胞培养基中的LA (18:2n-6)逐步代谢转化为DHA (22:6n-3)，为动物个体的遗传改造提供可行性依据。
1 材料与方法 1.1 材料大肠杆菌DH5α、质粒pcDNA3.1(-)以及下文中各种基因表达质粒载体均为本实验室保存。HEK293T细胞购于中国协和医科大学细胞库。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、总RNA提取试剂RNAiso plus、RT-PCR试剂盒等购于宝生物工程 (大连) 有限公司。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等购于天根生化科技 (北京) 有限公司。转染试剂LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。细胞培养所用培养基、血清、培养皿等为Hyclone产品。
1.2 方法 1.2.1 基因表达载体的构建多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2的构建：来源于人的Δ6-脂肪酸去饱和酶基因 (Fads2,编码445个氨基酸) 和Δ5-脂肪酸去饱和酶基因 (Fads1,编码448个氨基酸) 以及来源于小鼠的Δ6-脂肪酸延长酶基因 (Elovl5,编码300个氨基酸) 和Δ5-脂肪酸延长酶基因 (Elovl2,编码297个氨基酸) 4个基因构建为一个多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2。在该载体中，每个目的基因各自有独立的启动子和终止信号polyA，故能独立表达不相互影响。此多基因表达载体总大小为12 760 bp。具体的载体构建方法参照文献[19]。
双基因表达载体pcDNA3.1-sD15-sEgD4的构建：将线虫C. elegans的Δ15去饱和酶基因sD15 (GenBank Accession No. NM_001028389) cDNA序列 (编码框全长为1 200 bp) 和小眼虫Euglena gracilis的Δ4去饱和酶基因sEgD4 (GenBank Accession No. AY278558) 的cDNA序列 (编码框全长为1 626 bp) 分别进行密码子优化并克隆到表达载体pcDNA3.1，然后再构建两者的双基因表达载体pcDNA3.1-sD15-sEgD4。具体的载体构建方法参照文献[18]。
1.2.2 细胞培养和瞬时转染HEK293T细胞生长培养基为高糖DMEM中添加1%双抗 (青霉素100 U/mL＋链霉素 100 μg/mL)、1%丙酮酸钠 (11.0 mg/mL)、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清。转染前一天将培养的细胞分散至60 mm平皿，加无双抗培养基 5 mL培养，同时添加10 μmol/L亚油酸 (LA,18:2n-6)。待其生长至90%左右汇合时用于转染。转染操作按照脂质体LipofectamineTM 2000说明书进行，转染时实验组为质粒pcDNA3.1-F2F1- E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (两个质粒等比例混合)，对照组为质粒pcDNA3.1-EGFP，两组各为8 μg。转染后48 h，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集备用。
1.2.3 RT-PCR鉴定目的基因的超表达取上述收集的细胞1/3用于RT-PCR实验。总RNA提取和RT-PCR实验均按照宝生物工程 (大连) 有限公司相关试剂说明书进行。简言之，总RNA提取之后先进行定量测定各样品含量，然后将总RNA中的mRNA反转录成为cDNA，每个样品取2 μL反转录产物用于PCR检测，每个PCR反应体系为25 μL。PCR中使用的目的基因表达检测引物见表1 (其中引物ActD-s和ActD-a用于检测内参基因β-actin)。
| Primer name | Primer sequence (5′−3′) | Tm (℃) | Size (bp) |
| Fd2D-s | TTCGGGAGAAGATGCTACGGATG | 65.3 | |
| Fd2D-a | AAGGCTGTGACGAGGGTAGGAATC | 65.0 | 309 |
| Fd1D-s | TCGGGAGGGAAAAGAAGAAGCAC | 65.9 | |
| Fd1D-a | GTGAAGGTAAGCGTCCAACCAGAG | 64.3 | 584 |
| Ev5D-s | ACCTTGGACTCACACTGCTGTCTCTG | 66.0 | |
| Ev5D-a | TGGTGGTCCTTCAGGTGGTCTTTC | 66.3 | 604 |
| Ev2D-s | TGTGTCTTGAACTGGATACCTTGTGG | 64.4 | |
| Ev2D-a | AAAACCATTCTTCACTTCTTTCCCTG | 63.8 | 363 |
| sD15-s | ACGTGAACGCCAACACCAAGC | 65.4 | |
| sD15-a | ACACGCCCATGAAGATGTTCCAC | 65.7 | 235 |
| sEgD4-s | TCATCATCAACCACATCAGCGAG | 63.2 | |
| sEgD4-a | TTTAGCTCTTCTTGTCGCCGTTG | 63.8 | 426 |
| ActD-s | CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC | 65.7 | |
| ActD-a | TGCCACAGGATTCCATACCCAAG | 65.5 | 210 |
PCR反应结束后，取5 μL进行电泳检测，观察基因表达情况。
1.2.4 脂肪酸的提取与GC-MS分析取上述收集的细胞余下的2/3用于脂肪酸提取：用去离子水漂洗3次，1 000 r/min离心 5 min，加入1 mL 2.5% H2SO4/甲醇溶液，轻轻混匀，80 ℃水浴90 min，待冷却至室温，加入1.5 mL 0.9% NaCl溶液和1 mL正己烷，剧烈振荡混匀，3 000 r/min离心5 min，将脂肪酸萃取到有机相中，吸取上清经氮气吹干浓缩后-80 ℃保存备用。GC-MS检测时可添加适量的正己烷稀释，使用仪器为安捷伦气质联用仪HP-5890/ HP-5971。检测使用参数参考Kang等的报道[20]。
1.3 统计分析 脂肪酸含量等结果采用
±s (算术平均值±标准偏差) 表示。组间数据比较采用Student’s t-test，以P<0.05作为统计学差异显著性的判断标准。每一种脂肪酸百分含量按其峰面积除以表2中所列所有脂肪酸峰面积总和而计算获得。
| Fatty acids | EGFP (%) | F2F1-E5E2+sD15-sEgD4 (%) |
| ω-6 Polyunsaturates | ||
| 18:2n-6 | 39.29±2.15a | 23.76±1.90b |
| 20:3n-6 | 5.65±0.71 | 5.11±0.67 |
| 20:4n-6 | 19.96±1.92 | 17.05±1.88 |
| Total | 64.90±4.13a | 45.92±3.27b |
| ω-3 Polyunsaturates | ||
| 18:3n-3 | 1.61±0.20b | 4.54±0.38a |
| 20:5n-3 | 5.64±0.62b | 9.66±0.83a |
| 22:5n-3 | 11.10±0.97b | 14.64±1.01a |
| 22:6n-3 | 16.74±1.24b | 25.30±1.32a |
| Total | 35.09±3.46b | 54.14±4.84a |
| ω-6/ω-3 ratio | 1.85±0.31a | 0.84±0.25b |
| Notes: values are means of three measurements; values for each fatty acid with different superscript differ significantly (P﹤0.05) between control (EGFP) and F2F1-E5E2+sD15-sEgD4. |
将多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2和双基因表达载体pcDNA3.1-sD15-sEgD4共同用于转染哺乳动物细胞NHK293，转染时利用pcDNA3.1-EGFP质粒作为对照，其绿色荧光可以比较准确地反映转染效率。转染后第二天观察细胞，可以看到对照组的绿色荧光，在转染后48 h绿色荧光基本达到最强的状态，约90%以上细胞被成功转染。此时收集细胞提取总RNA进行RT-PCR分析，结果表明转染了pcDNA3.1-F2F1-E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4的细胞中，Fads2,Fads1,Elovl5,Elovl2,sD15和sEgD4均成功表达 (或超表达) (图1)。
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| 图1 RT-PCR检测转染后细胞中目的基因的转录水平 Fig.1 Analysis of transcripts in transfected cells by RT-PCR. 1: cells transfected with pcDNA3.1-EGFP; 2: cells transfected with pcDNA3.1-F2F1-E5E2+ pcDNA3.1-Sd15-sEgD4. |
通过RT-PCR实验确认6个目的基因均获得超表达后，提取细胞中的脂肪酸，并利用GC-MS进行分析，结果如图２所示。色谱图中横坐标为各种脂肪酸出现的保留时间，不同的脂肪酸出现的时间不一样，由此可以将各种脂肪酸在色谱图中分别开来，再通过质谱分析和搜库对比就可以准确判定各个色谱峰所代表的不同脂肪酸的具体种类。各个色谱峰的高低则表明此脂肪酸的含量，按照其峰面积计算出它的含量，进而可计算出每一种脂肪酸的百分含量 (表2)。这些数据表明，与转染对照质粒pcDNA3.1- EGFP的细胞相比，同时转染pcDNA3.1-F2F1- E5E2和pcDNA3.1-sD15-sEgD4质粒的细胞中，Fads2,Fads1,Elovl5,Elovl2,sD15和sEgD4这6个目的基因的表达 (或超表达) 显著地促使LA (18:2n-6)向长链多不饱和脂肪酸的生物合成方向转化。对图1和表2分析可知，一部分LA (18:2n-6)被Δ15去饱和酶转化为ALA (18:3n-3)，然后在Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的交替作用下，按照ω-3代谢途径合成其下游长链的ω-3多不饱和脂肪酸如EPA (20:5n-3) 和 DPA (22:5n-3) 接着被Δ4脂肪酸去饱和酶直接转化为DHA (22:6n-3)；另一部分LA (18:2n-6) 可以在Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的交替作用下，按照ω-6代谢途径合成20:3n-6和20:4n-6，同时，这些产物还可以被Δ15去饱和酶转化为20:4n-3 (未检测到) 和20:5n-3，继而进入ω-3代谢途径，直至合成DHA。总体看来，实验组细胞与对照组相比较，添加的LA显著下降，而ω-3系的多不饱和脂肪酸如ALA (18:3n-3)、EPA (20:5n-3)、DPA (22:5n-3) 和DHA (22:6n-3) 的含量均显著升高，其中DHA (22:6n-3) 的含量从16.74%提高到25.3%。此外，本研究结果还表明，6个目的基因的表达或超表达显著降低了ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸之间的比率，即从对照组的1.85降至实验组的0.84。
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| 图2 转染pcDNA3.1-EGFP (A) 或pcDNA3.1-F2F1-E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (B) 质粒的HEK293T细胞中多不饱和脂肪酸的色谱图 (局部) Fig.2 Partial gas chromatograph traces of PUFA from HEK293T cells transfected with pcDNA3.1-EGFP (A) and the HEK293T cells transfected with pcDNA3.1-F2F1-E5E2+pcDNA3.1-sD15-sEgD4 (B) |
如何获取丰富的DHA等长链多不饱和脂肪酸资源是当今世界范围内人们所关心的一个问题。相关的研究显示，通过转基因动物技术在哺乳动物中生产这些长链多不饱和脂肪酸是有可能的。1997年，Spychalla等从线虫C. elegans中筛选克隆了第一个动物Δ15去饱和酶 (通常也称为ω-3去饱和酶) 基因，命名为 fat-1[21]，在后续的研究发现fat-1基因可以将16-20碳ω-6 PUFAs去饱和变成ω-3 PUFAs。Kang等将fat-1基因转入哺乳动物细胞，ω-6/ω-3PUFAs比从15:1下降到1:1，使哺乳动物中的ω-3 PUFAs含量显著提高[20]。之后又于2004年将fat-1基因转入小鼠，使得ALA、EPA、DPA 等ω-3 PUFAs均显著提高[22]。2006年，Lai等制备的fat-1的转基因猪，也表现出了与转基因小鼠类似的情况[23]。然而，这些转基因动物体内所合成的ω-3 PUFAs中以18C和20C的ω-3 PUFAs为主，而更为重要的22C的DHA总量仍然很少。事实上，后续的一些研究表明fat-1的Δ15去饱和酶活性并不能增加这些动物体内的DHA含量。因此，fat-1基因在用于提高哺乳动物长链多不饱和脂肪酸含量的实践中，关键性的缺憾就是不能增加DHA的含量。
在哺乳动物中，阻碍DHA高效生物合成的原因大概有3个：一是Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的活性可能受到某种机制的抑制，尤其是Δ6脂肪酸去饱和酶的活性。Δ6脂肪酸去饱和酶基本上是被公认的在哺乳动物长链多不饱和脂肪酸的生物合成过程中的第一个限速酶[24]。针对这一原因，我们前期研究将上述4种酶在HEK293T细胞中进行超表达研究，结果证实了哺乳动物自身形成了某种平衡机制，抑制长链多不饱和脂肪酸如DHA、ARA等的大量的高水平合成，但是通过对Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的超表达，能够打破哺乳动物这种平衡机制，从而显著提高DHA、ARA等的合成水平。二是哺乳动物缺失Δ15脂肪酸去饱和酶活性，不能将体内摄入的ω-6多不饱和脂肪酸转化为合成DHA的前体脂肪酸如EPA和DPA等。人类食品以及动物饲料脂肪酸中通常含有大量的亚油酸 (LA,18:2n-6)，并由此合成花生四烯酸 (AA,20:4n-6) 等ω-6系多不饱和脂肪酸，而ω-3系多不饱和脂肪酸含量很低，例如在西方人体ω-6与ω-3系多不饱和脂肪酸的比率通常高达10−20，这种比率的失衡不利于身体健康[25]。上文中所提及的线虫C. elegans的Δ15去饱和酶活性被引入动物或动物细胞后就能够将ω-6系多不饱和脂肪酸转化为ω-3系多不饱和脂肪酸，从而改变两者之比率。三是哺乳动物在ω-3长链多不饱和脂肪酸生物合成途径中从DPA转化为DHA这一环节的低效性，即“Sprecher”通路对高效转化DPA为DHA的具有某种制约性。但是在自然界中，一些生物，例如一种原生动物小眼虫Euglena gracilis、海洋真菌破囊壶菌Thraustochytrium和巴夫藻Pavlova lutheria，在合成DHA时并不需要经过“Sprecher 通路”，而是直接利用Δ4去饱和酶活性将DPA转化成为DHA，因此这类生物中DHA含量一般比较 高[26, 27, 28]。前面提及fat-1基因在哺乳动物中表达后能够生成很高水平的DPA，但不能进一步转化成为DHA。我们前期研究已经证实，源自于小眼虫Euglena gracilis Δ4去饱和酶活性正好可以与fat-1基因 (我们研究中所用的sD15与之同源，但进行了密码子优化) 配合，将累积的DPA直接转化成为DHA。
本研究正是致力于解决上述阻碍DHA高效生物合成的3个因素或环节，目标是使哺乳动物细胞甚至是哺乳动物个体通过遗传改造后能够高效地利用自然界大量存在的亚油酸 (LA,18:2n-6)，将其转化为DHA (22:6n-3)，使动物脂肪变成对人体健康有益成为可能。此项研究明确证实，Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶、Δ6和Δ5脂肪酸延长酶以及Δ15和Δ4脂肪酸去饱和酶这6种酶活性在哺乳动物细胞中的表达或超表达显著地提高了这种转化能力，既能够将ω-6系多不饱和脂肪酸转化为ω-3系多不饱和脂肪酸，又能够将短链的LA或ALA转化为长链的ARA、EPA、DPA等，最后还能将细胞中积累的DPA直接转化为DHA。可以说，这种思路是在哺乳动物及其细胞中将LA (18:2n-6)代谢转化为DHA (22:6n-3) 的最佳转基因组合。当然，多个目的基因用于制作转基因动物将变得更加困难，还需要解决一些技术问题。
我们的研究以及技术路线除了为将来改造陆地型动物以提供DHA等长链多不饱和脂肪酸提供理论和数据支持外，还可以将其应用于DHA等长链多不饱和脂肪酸生物学功能的相关基础研究中，因为这种转基因动物本身就是一个很好的动物模型。因此，本研究不仅具有潜在的实践应用价值，也为相关理论研究奠定了基础。
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