γ干扰素 (IFN-γ) 主要是由被有丝分裂原或特异性抗原刺激而活化的CD4⁺ Th1细胞、CD8⁺ T细胞及NK细胞等产生的一种重要的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，是机体防御系统的重要组成部分^[1]。内源性IFN-γ水平的高低在一定程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的重要指标。动物γ干扰素及其单克隆抗体 (mAb) 在畜牧兽医领域有着广泛的应用^[2]，因此将基因重组牛IFN-γ (rBoIFN-γ) 及其mAb用于牛病的研究，建立抗原特异性BoIFN-γ ELISPOT试验用于多种牛疫病的检测，尤以在牛结核病诊断中的应用具有十分重要的意义。目前，IFN-γ释放试验已经在牛结核病检测中得到广泛应用，包括免疫胶体金技术^[3]、酶联免疫吸附测定法 (ELISA)^{[4, 5, 6, 7]}。ELISPOT技术是上世纪80年代出现，并逐渐发展和完善起来的可以从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞及特异性细胞因子分泌细胞的一种免疫学研究技术，具有稳定性好、敏感性高、特异性好等一系列优点^[8]。目前国内外有许多学者致力于以结核分枝杆菌特异性抗原为刺激原的ELISPOT方法的建立及其在人结核病诊断中的应用^{[9, 10, 11, 12, 13]}，用于人结核病诊断的ELISPOT商品化试剂盒也已问世并得到广泛应用，由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT TB试剂盒是通过结核分枝杆菌特异的6 kDa早期分泌性抗原靶和培养滤液蛋白10多肽进行刺激结核致敏T淋巴细胞分泌干扰素，并应用ELISPOT方法检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞用于人类结核病的检测。到目前为止，关于建立牛γ干扰素ELISPOT方法应用于牛结核病检测的相关研究，国内尚未见报道。因此本研究筛选出两株与天然牛γ干扰素反应的特异性单抗2G5和5E11，并以结核菌素为刺激原，建立了牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法，并对该方法在牛结核病检测过程中的效果进行了初步评价。

进行牛外周血单个核细胞分离制备的健康奶牛选择于扬州大学实验农牧场。

进行牛结核病检测的30头实验用黑白花奶牛 (皮试变态反应结果初步显示其中9头为牛结核阳性，4头为牛结核疑似阳性，17头为牛结核阴性) 选择于江苏地区某奶牛场。

牛外周血单个核细胞分离液购自天津灏洋生物有限公司；96孔滤膜板购自Millipore公司；1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；美洲商陆 (PWM) 购自Sigma公司；亲和素-碱性磷酸酶结合物购自BD公司；底物液5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和四唑硝基蓝 (BCIP/NBT) 购自eBioscience公司；BOVIGAM^TM Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle以及禽型PPD和牛型PPD均购自Prionics公司。

针对牛γ干扰素特异性单抗为本实验室 制备^[14]。

无菌采取5 mL健康奶牛尾静脉血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血。将抗凝血与灭菌PBS 1∶1稀释后，再按1∶1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下 2 000 r/min离心20-30 min。可见外周血单个核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于室温2 000 r/min离心10 min，重复两次。弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10 μL细胞悬液加入10 μL台盼蓝混匀后，取样加入血球计数板，在显微镜下进行计数。

参照文献^[15]方法，将Sf9细胞铺于24孔板中，10⁵细胞/孔，于27 ℃细胞培养箱中过夜培养12 h，使之贴壁，将P3代重组牛γ干扰素杆状病毒保 存液按1∶100的体积比感染Sf9细胞，待细胞病变达90%以上时，弃去培养上清；PBS洗3次，加入预冷甲醇500 μL/孔，固定15 min；PBS洗3次，加入1∶1 000的牛γ干扰素特异性单抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗涤3次，加入 1∶500稀释的FITC-羊抗鼠IgG，1 mL/孔，37 ℃孵育2 h；PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

在96孔细胞培养板中，将倍比稀释的牛γ干扰素特异性单抗分别与含天然BoIFN-γ的阳性血浆 (PWM刺激牛外周血制备) 和阴性血浆混合，37 ℃孵育2 h；把单抗与血浆的混合物相应地加入到已包被0.5 μg/mL的rHis-BoIFN-γ的ELISA板中，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；PBST洗3次，拍干，加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗3次，拍干，TMB显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪读出OD₄₅₀的吸光值。

通过相加ELISA实验确定不同牛γ干扰素特异性单抗是否针对同一抗原表位，首先根据腹水效价确定每株单抗腹水与所选包被抗原量反应的饱和度，然后将相加的两株单抗按饱和度分别进行稀释与包被的重组牛γ干扰素抗原反应，同时将两株腹水混合使各自达到饱和再与包被的重组牛γ干扰素抗原反应，测得3组ELISA反应OD值分别记为A1、A2、A1+2，计算相加指数AI= (2 A1+2/ A1+ A2) -1，若两株单抗AI＞50%，则表明两株单抗针对抗原表位不同。

参照文献^[16]方法，使用包被液稀释的捕获抗体2G5加入96孔滤膜板，100 μL/孔，4 ℃无菌过夜包被；弃包被液，使用含有0.05%吐温的灭菌PBST洗板3次，5 min/次；加入含10%胎牛血清的完全1640培养基，200 μL/孔，37 ℃孵育封闭2 h；弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测或置4 ℃保存。在上述包被的96孔滤膜板中加入50 μL刺激原，并设立对照组，然后每孔加入50 μL牛外周血单个核细胞悬液，将96孔滤膜板置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养48 h；将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5 min/次，洗板后甩干。加入稀释的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；用PBS洗板3次，5 min/次，洗板后甩干，加入 1∶1 000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL底物液BCIP/NBT，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37 ℃烤箱中2-3 h烘干；将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。

使用包被液稀释捕获抗体2G5至 1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL，加入96孔滤膜板，100 μL/孔，各设3个重复孔，4 ℃过夜包被，弃包被液，进行洗涤和封闭后备用。其他步骤均按照1.3.4中ELISPOT操作程序。

在上述包被的96孔滤膜板中加入50 μL完全1640培养基至每个对照孔，加入50 μL 5 μg/mL的PWM至每个检测孔。每孔加入50 μL牛外周血单个核细胞悬液，细胞数量分别为1.25×10⁵细胞/孔、2.5×10⁵细胞/孔、5×10⁵细胞/孔和1×10⁶细胞/孔，各设3个重复孔，将96孔滤膜板置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养48 h。其他步骤均按照1.3.4中ELISPOT操作程序。

将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5 min/次，洗板后甩干。分别加入稀释至0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL的牛γ干 扰素检测抗体Bio-5E11，100 μL/孔，各设3个重复孔，置于37 ℃孵育1 h。其他步骤均按照1.3.2中ELISPOT操作程序。

无菌采集30份奶牛尾静脉血，将抗凝血加入到24孔细胞培养板，每头牛抗凝血分装3孔，1 mL/孔，各孔分别加入相应的刺激原 (PBS、Avian PPD、Bovine PPD)，充分混匀，CO₂培养箱中孵育24 h，吸取50 μL上层血浆作为待检样品用于牛结核外周血IFN-γ释放试验的检测^[16]，参照BOVIGAM^TM Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle说明书进行。

在96孔滤膜板中分别加入2.5 μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体2G5，100 μL/孔，4 ℃过夜包被。弃包被液，进行洗涤和封闭后备用。对上述奶牛场30头奶牛分别无菌采取5 mL尾静脉血加入含肝素钠的抗凝管，进行牛外周血单个核细胞的制备和计数。在上述包被的96孔滤膜板中分别加入50 μL培养液至每个对照孔、50 μL 10 μg/mL的禽型PPD、50 μL 10 μg/mL的牛型PPD至每个检测孔。分别加入50 μL每头牛的外周血单个核细胞悬液至培养液对照孔、禽型PPD和牛型PPD检测孔，将96孔滤膜板置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养48 h。将96孔滤膜板取出，弃培养上清并进行洗涤，加入1 μg/mL的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h。用PBS洗板3次，5 min/次，洗板后甩干，加入1∶1 000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h；每孔加入100 μL底物液BCIP/NBT，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯水终止反应，对实验结果进行扫描计数和分析。

为了鉴定制备的牛γ干扰素特异性单抗是否与真核系统表达的牛γ干扰素蛋白有较好的反应性，本实验以制备的牛γ干扰素特异性单抗为一抗分别检测重组牛γ干扰素杆状病毒感染Sf9细胞，结果显示，2G5和5E11等单抗检测的感染重组杆状病毒的Sf9细胞出现明显绿色荧光，而4D3和5B8等单抗检测的感染重组杆状病毒的Sf9细胞没有出现明显绿色荧光 (图1)。

图1 间接免疫荧光鉴定单抗 Fig.1 Identification of mAbs in IFA. (A,B) Sf9 cells detected with antibody 2G5 and 5E11. (C,D) Sf9 cells detected with antibody 4D3 and 5B8

图选项

为了进一步筛选具有高亲和力，与天然牛γ干扰素可以特异性结合的单抗，本实验采用阻断ELISA方法，检测各株单抗与阳性血浆中天然牛γ干扰素蛋白的反应性。结果表明，2G5和5E11等单抗与阳性血浆具有一定的反应性，而6F8和8F8等单抗与阳性血浆混合后，并没有明显的阻断效果 (图2)。表明2G5和5E11等单抗与天然牛γ干扰素蛋白有着更好的反应性。

图2 阻断ELISA方法鉴定单抗 Fig.2 Identification of mAbs in blocking ELISA

图选项

为了鉴定筛选到的高亲和力单抗2G5和5E11是否针对牛γ干扰素同一抗原表位及便于单抗的进一步应用，本实验采用相加ELISA方法，检测各株单抗针对牛γ干扰素抗原表位情况。结果显示，单抗2G5和5E11进行相加ELISA检测AI值＞50%，表明两株单抗针对抗原表位不同。

为了确定最佳包被抗体浓度，将捕获牛γ干扰素抗体2G5分别稀释至1.25 μg/mL、 2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL进行包被，结果显示在非特异性刺激原PWM的作用下，实验组斑点数随着包被浓度的提高而有所增加，但是并不明显，包被浓度为2.5 μg/mL时，检测孔的斑点数在100个左右，便于计数，而且阴性对照组斑点数较少，因此选择2.5 μg/mL包被浓度比较合适 (图3)。

图3 包被抗体浓度对于检测斑点数的影响 Fig.3 Effects of concentrations of coating antibody on spot numbers. Spot numbers (Left) and spot forming pictures (Right) of ELISPOT assay using different concentration of coating antibody. (A) Peripheral mononuclear cells with PWM. (B) Peripheral mononuclear cells without PWM

图选项

为了确定最佳刺激细胞数量，在96孔滤膜板中分别加入了1.25×10⁵、2.5×10⁵、5×10⁵、10×10⁵制备的牛外周血单个核细胞，并加入刺激原进行孵育培养和检测。结果显示，随着细胞数量的增加，斑点数目显著增多，加入细胞数量为2.5×10⁵时，96孔滤膜板中斑点数目在100左右，便于计数。随着细胞数量的增多，阴性对照孔中的斑点数也有所增加，因此确定2.5×10⁵为最佳细胞数目 (图4)。

图4 细胞数量对于检测斑点数的影响 Fig.4 Effects of cell number on spot numbers. Spot numbers (Left) and spot forming pictures (Right) of ELISPOT assay using different cell number. (A) Peripheral mononuclear cells with PWM. (B) Peripheral mononuclear cells without PWM

图选项

为了确定最佳检测抗体浓度，本实验将牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11分别稀释至0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL加入96孔滤膜板进行检测，结果显示斑点数目随着检测抗体浓度的提高明显增多，包被浓度为1 μg/mL时检测孔的斑点数较为合适，并且随着检测抗体浓度的提高，阴性对照孔中的斑点本底数也有所提高，因此确定1 μg/mL为最佳检测抗体浓度 (图5)。

图5 检测抗体浓度对于检测斑点数的影响 Fig.5 Effects of concentrations of detecting antibody on spot numbers. Spot number (Left) and spot forming pictures (Right) of ELISPOT assay using different concentration of detecting antibody. (A) Peripheral mononuclear cells with PWM. (B) Peripheral mononuclear cells without PWM

图选项

本研究中使用牛结核γ干扰素ELISPOT方法对总共30头奶牛进行了牛结核病检测，参考文献^{[8, 9, 10]}并结合本研究实际设定判定标准，如果牛型PPD刺激孔中斑点数减去PBS对照孔中的斑点数以及牛型PPD刺激孔中斑点数减去禽型PPD刺激孔中斑点数都大于或等于6 个，则可以判定为阳性；如果牛型PPD刺激孔中斑点数减去PBS对照孔中的斑点数或牛型PPD刺激

孔中斑点数减去禽型PPD刺激孔中斑点数小于6个，则可以判定为阴性。根据这一判定标准，30头奶牛中有15头可以判定为结核阳性，阳性检出率为50% (15/30) (图6)。

图6 ELISPOT方法进行牛结核检测结果 Fig.6 Diagnosis of bovine tuberculosis with the established ELISPOT assay. Spot number of peripheral mononuclear cells isolated from 30 cows stimulated by avian PPD and bovine PPD (Left). The difference value of spot number between avian PPD and bovine PPD stimulated group (Right)

图选项

同时使用BOVIGAM^TM ELISA试剂盒 (图7) 和牛结核γ干扰素ELISPOT方法对30头奶牛进行了检测，结果显示，两种方法检出共同阳性数为11头，检出共同阴性数为12头 (表1)。以BOVIGAM^TM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准，14头BOVIGAM^TM ELISA试剂盒检测阳性牛中，ELISPOT方法检出的阳性牛为11头，敏感性为78.6% (11/14)；16头BOVIGAM^TM ELISA试剂盒检测阴性牛中，ELISPOT方法检出的阴性牛为12头，特异性为75% (12/16)。

图7 BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果 Fig.7 Diagnosis of bovine tuberculosis with BOVIGAMTM ELISA assay

图选项

牛结核病是一种重要的人兽共患病，可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人，其传播和流行严重影响畜牧业的发展和人类的健康^[18]。在一些畜牧业发达的西方国家，牛结核病疫情曾经也相当严重，通过实施“检疫-扑杀”措施后，疫情得到了一定程度的控制^[19]。近年来，由于我国人民生活水平逐渐提高，人们对于牛乳制品需求量急速上升，进而带动了奶牛业的迅猛发展，因此我国的牛结核病疫情正受到广泛而密切的关注。

目前世界各国都在致力于研究开发牛结核病的快速检测方法，并已经建立了一些准确、可靠的新型检测技术，并且在生产实践中得到了广泛的应用。牛结核病的检测方法，主要分为三类：第一类是细菌学检测，如涂片镜检、细菌培养 等^[20]；第二类为分子生物学诊断技术^{[21, 22, 23]}；第三类是免疫学检测，如皮试变态反应、IFN-γ释放试验 (IGRA) 等^[24]。IGRA具有特异度高、快速的优点、是目前可取代皮试试验的最有效方法，包括免疫胶体金技术、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫斑点法等。

免疫胶体金法适用于液体样品，如牛血浆样品中IFN-γ含量的测定，免疫胶体金法的特点在于使用方便快速，不需要特殊的仪器设备进行检测，便于基层使用和现场使用，可以进行多项检测，省去了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，关于免疫胶体金方法的建立及在牛结核病检测中的应用，国内学者已经进行了相关研究^[3]，但是该方法在检测灵敏度、特异性和稳定性方面有待提高，应用不是很广泛。牛结核IFN-γ ELISA检测方法的特点在于实验操作更加准确，降低检测主观性误差，因此检测结果更加客观可靠，检测灵敏度也高于免疫胶体金方法，也可以实现一次采血多病检测，该方法的研究最多且应用较广泛^{[4, 5, 6, 7]}，用于牛结核病检测的商品化BOVIGAM^® ELISA试剂盒也已问世并得到广泛应用^{[25, 26]}。

近年来随着免疫学检测技术的不断发展，以结核分枝杆菌特异性抗原为基础的ELISPOT实验作为一种新型的结核病免疫学诊断工具逐渐建立起来。ELISPOT方法同时具备细胞培养技术与ELISA技术的优点，能够分析经特异性抗原活化后分泌细胞因子的单个效应细胞的数目，能从20万-30万细胞中检测出单个分泌细胞因子的细胞，敏感性高且特异性好，相关研究证明其敏感性比ELISA法高10-200倍^[26]，这些独特优点使得ELISPOT技术成为公认的检测免疫效应细胞的一种重要研究方法。牛结核IFN-γ ELISPOT检测方法相比于免疫胶体金法和ELISA方法，都是通过抗原抗体间特异性结合的原理，对特异性刺激牛全血后牛IFN-γ的产生水平进行测定，从而对牛结核感染状态进行检测。由于检测媒介体、显色方式、样品类型等方面的不同，3种方法在使用流程、检测特异性和灵敏度方面有所差别，ELISPOT方法凭借其敏感性高且特异性好的独特优势，在牛结核病的检测中具有重要的应用 价值。

目前许多学者进行了以结核分枝杆菌特异性抗原为刺激原的ELISPOT方法的建立相关研究^{[9, 10, 11, 12, 13]}，而且用于人结核病诊断的ELISPOT商品化试剂盒也已问世并得到广泛应用，由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT TB试剂盒是通过结核分枝杆菌特异的6 kDa早期分泌性抗原靶和培养滤液蛋白10多肽进行刺激结核致敏T淋巴细胞分泌干扰素，并应用ELISPOT方法检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞用于人类结核病的检测。但是目前关于牛γ干扰素ELISPOT方法应用于牛结核病检测的相关研究，国内尚未见报道。

为了提高ELISPOT检测方法的灵敏度和特异性，以及该方法在牛结核病检测过程中的实际应用效果，本研究通过间接免疫荧光方法和阻断ELISA方法筛选到2G5、5E11等与天然牛γ干扰素蛋白有着很好反应性和实际应用价值的单克隆抗体，并将这两株单抗分别作为包被抗体和检测抗体，进行了牛γ干扰素ELISPOT检测方法的建立，随后确定ELISPOT方法的最佳实验条件为：包被抗体浓度2.5 μg/mL，每孔细胞数量2.5×10⁵，检测抗体浓度1 μg/mL。以结核菌素作为刺激原，使用建立的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法对30头奶牛进行牛结核病检测，并与BOVIGAM^TM ELISA试剂盒检测结果进行比较，结果显示，牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法与BOVIGAM^TM ELISA试剂盒具有较高的符合率。应用结核菌素作为刺激原的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法与免疫胶体金方法、ELISA等免疫学方法相比具有更好的灵敏度和特异性，可以应用于牛结核病检测，具有潜在的临床应用价值，为牛结核病的检疫提供了一种重要的辅助手段。