蛋白质药物与小分子药物相比，具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。1982年，美国Likky公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。作为治疗性蛋白质药物，不仅需要其氨基酸序列正确，而且，往往还需要正确的空间结构^[1]。若构象改变，其生物学功能也可能发生变化。在生产、运输、储藏过程中，蛋白质药物由于外界条件的改变，可能会引起变性，进而影响其生物学活性的发挥^{[2, 3]}。另外，细胞是生命活动的基本单位，药物对机体的作用必然呈现在细胞水平上的变化。因此，探索蛋白质药物在细胞水平上的生物学功能 与其空间结构的相关性，对于药物的临床应用具有重要意义。目前，已经有多种方法可以用于蛋白质结构与功能的研究。其中，圆二色谱 (Circular dichroism,CD) 可以分析溶液状态下蛋白质的构象，能够反映其自然状态的性质，是药物构象研究的常用技术^[4]。流式细胞术 (Flow cytometry,FCM) 是单细胞水平上研究细胞功能的常用技术^[5]。两者结合，是研究蛋白质构象与其在细胞水平上的生物学功能的较好组合。

干扰素-α (Interferon-α,IFN-α) 是由5个α-螺旋组成的球状结构，能够诱导抗病毒活 性^{[6, 7]}。利用基因工程手段获得的重组原核表达产物rIFN-α2b和rIFN-α2a仍然具有该活性^{[8, 9]}，并已经被批准用于临床治疗^[10]，如针对乙肝、丙肝、恶性黑色素瘤等疾病^{[11, 12]}。目前，关于IFN-α构象的改变在多大程度上影响其抗病毒活性的发挥鲜有明确报道，另外，如何评价蛋白质药物的构象与其活性之间的相关性也尚无标准方法可以借鉴。本实验以rIFN-α2b和rIFN-α2a为材料，利用CD和FCM技术相结合，分析其在变温条件下的构象变化，以及构象变化前后对其抗病毒活性的影响。同时，探讨CD和FCM技术组合在分析蛋白质药物的构象与其生物学活性的相关性方面的应用前景。

人子宫颈癌细胞HeLa细胞为江苏省人兽共患病学重点实验室保存。表达绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP) 的新城疫病毒NDV (GFP) 由江苏省高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心保存。重组人IFN-α (rIFN-α2b和rIFN-α2a) 为厦门特宝生物工程股份有限公司产品；胎牛血清 (Fetal bovine serum,FBS) 为美国Gibco公司产品；无酚红DMEM为美国Promega公司产品。

J-810圆二色谱仪为日本Jasco公司产品；FACSAria流式细胞仪 (分析软件为FACSDiva)为美国BD公司产品；TS100-F倒置显微镜为日本尼康公司产品。Cary5000紫外分光光度计为美国Varian公司产品。

为了分析rIFN-α2b和rIFN-α2a在变温过程中构象的变化，利用圆二色谱仪记录远紫外(190-250 nm) CD谱。利用pH 7.2的磷酸盐缓冲液 (Phosphate-buffered saline,PBS) 稀释样品，浓度均为0.2 mg/mL。具体参数：扫描速度(Scanning speed) 为100 nm/min，响应时间(Response) 为4 s，光程 (Cell length) 为0.2 cm，带宽 (Band width) 为1 nm，灵敏度 (Sensitivity) 为Standard (100 mdeg)，数据步长 (Data pitch) 为0.1 nm，重复测量次数 (Accumulation) 为4。

在变温过程中，利用JULABO F-12变温附件控制样品架的温度，用CDF-426L Pelitier自动调温附件控制样品温度，温度范围(Temperature range) 为5-80 ℃，变温速度(Temperature slope) 为1 ℃/min，延迟时间(Delayed time) 为1 min。升温过程中，每间隔5 ℃记录一次。升温结束后选择“返回初始温度”，即返回5 ℃ (F5 ℃)。变温处理后的样品分别命名为rIFN-α2at和rIFN-α2bt。以PBS的CD谱作为基线，所有样品的CD谱均为扣除背景基线后的结果。

用二级结构分析软件“Secondary Structure Estimation (以Yang等^[13]为参考)”分析以上CD谱的二级结构比例，包括α-螺旋 (Helix)、β-折叠 (Sheet)、β-转角 (Turn) 和不规则卷曲 (Random coil)。

为了分析变温处理过程中，rIFN-α2bt和rIFN-α2at的降解情况。选用12%的分离胶，对变温处理前、后的样品进行SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)，凝胶置于R-250染色液中染色4 h，然后，转入脱色液中脱色，拍照。

将HeLa细胞 (3×10⁵细胞/mL) 加入96孔组织培养板中。37 ℃培养2 h，待细胞长成单层后，将rIFN-α2a和rIFN-α2b以及rIFN-α2at和rIFN-α2bt用培养基分别稀释至25 ng/mL，再5倍梯度稀释后，分别替换96孔板中的培养基。孵育18-24 h后，弃上清，分别加入等体积的用培养基稀释的100 TCID50的NDV (GFP)。孵育16 h后，收集细胞，充分洗涤后，用FCM检测GFP阳性细胞数量^[14]。以未用IFN-α预处理但感染病毒的细胞作为对照。

结果表明，在整个变温过程中，rIFN-α2b和rIFN-α2a具有类似的变化趋势。在5-60 ℃范围内，两者在190-250 nm范围内均呈现稳定的二级结构。在高于60 ℃以后，随着温度的升高，反映α-螺旋结构的208 nm和222 nm处的峰高逐渐降低 (图1A)。从222 nm处的变化也可以看出，60 ℃以后变化非常明显 (图1B)。温度又降低到5 ℃ (F5 ℃) 后，其CD谱和80 ℃时相似 (图1C)，说明其二级结构的改变是不可逆的。二级结构比例分析结果 (图2D) 也表明，65 ℃以后二级结构变化最为明显。分别将变温处理后的rIFN-α2bt和rIFN-α2at于-20 ℃放置不同时间后，检测其构象的变化，结果表明，其CD谱与F5 ℃时一致，这也进一步验证了其构象的不可逆变化。

图1 变温CD谱分析 Fig.1 Circular diachroism (CD) analysis during thermal denaturation. (A) CD spectra of rIFN-α2 at 5 ℃,60 ℃,65 ℃,70 ℃,75 ℃ and 80 ℃,respectively. (B) CD signals of rIFN-α2b at 222 nm during thermal denaturation. (C) CD spectra of rIFN-α2 at the initial 5 ℃,80 ℃ and the final 5 ℃ (F5 ℃). (D) Secondary structure contents of rIFN-α2.

图选项

在SDS-PAGE结果 (图2) 中，变温处理后的rIFN-α2bt和rIFN-α2at依然呈现高浓度的蛋白条带，与变温处理前相似。说明短时间的变温处理未引起明显的蛋白质降解。

图2 SDS-PAGE分析 Fig.2 SDS-PAGE assay. M: protein marker; 1: rIFN-α2at; 2: rIFN-α2bt; 3: rIFN-α2a; 4: rIFN-α2b.

图选项

对于未用rIFN-α处理的对照组，加入病毒并孵育16 h后，GFP阳性细胞所占比率约为60%。而预先用rIFN-α孵育的4个组均低于对照组。相对于rIFN-α2b处理组，在高浓度时，rIFN-α2bt处理组GFP阳性细胞所占比率与之相近，随着浓度的降低，特别是低于1 ng/mL时，rIFN-α2bt处理组的阳性率逐渐升高 ，与rIFN-α2b处理组差异显著 (P＜0.05)。说明rIFN-α2bt的抗病毒活性逐渐降低 (图3)。相对于rIFN-α2a处理组，rIFN-α2at处理组也出现类似的变化趋势。

图3 rIFN-α2的抗病毒活性分析 Fig.3 Antiviral activity of rIFN-α2 on Newcastle disease virus. Percentage of GFP-positive cells after incubation with serial diluted rIFN-α2 and then with NDV (GFP).

图选项

IFN是动物细胞在受到某些病毒感染后分泌的具有抗病毒活性的蛋白质。它能与周围未感染的细胞上的相关受体作用，促使这些细胞合成抗病毒蛋白，防止进一步感染，从而发挥抗病毒作用。IFN-α包括多个亚型^{[15, 16, 17]}，其中，IFN-α2b和IFN-α2a均为165个氨基酸^[18]，只有第23位氨基酸不同 (IFN-α2a是精氨酸R，IFN-α2b是赖氨酸K)。晶体结构表明，IFN-α2b是Zn离子介导的二聚体球状蛋白，IFN-α2a与IFN-α2b的结构相似，均含有5个α-螺旋 (A-E) 和4个环 (一长三短) ^{[6, 19]}。在CD谱分析过程中，190-240 nm范围的CD谱常用于分析蛋白质二级结构的变化，而192 nm的正峰和208 nm、 222 nm的负峰是α-螺旋结构的特征峰。本实验CD谱分析结果也表明，在低温条件下，两者均呈现明显的α-螺旋结构。

据报道，由于IFN-α独特的物理和化学特性，重组人IFN-α2b在溶液状态下的稳定性较差^[3]，易受到制备和贮藏等条件的影响，造成药物的修饰^[20]。目前，关于IFN-α构象的研究已有众多报道。Johnston等^[1]发现，当牛血清白蛋白与IFN-α2b比率为5∶1 (W/W) 时，α-螺旋和β-折叠构象发生明显的变化。100 ℃热处理1 h后，IFN-α2b的α-螺旋含量由50%降低到15%。与人血清白蛋白融合表达的albinterferon alfa-2b的甲硫氨酸696的氧化作用 (Methionine oxidation) 明显地改变了其空间结构，并且对温度的敏感性增高^[4]。史新昌等报道，在60-95 ℃之间，rIFN-α2a的二级结构发生改变；在5-60 ℃范围内则相对稳定^[21]。本实验动态分析了IFN-α2b和IFN-α2a在变温过程中CD谱的变化，不仅证实了65 ℃左右是其空间结构不可逆变化的拐点，而且也表明rIFN-α2a和rIFN-α2b具有类似的变化趋势。同时，在不改变rIFN-α2a和rIFN-α2b氨基酸序列的情况下，获得了构象不可逆变化的两种蛋白，这为后续的抗病毒活性的研究奠定了基础。

目前，关于IFN-α抗病毒机制的研究已经取得了较大的进展。例如，IFN-α通过与细胞表面受体复合物 (IRNAR) 结合而介导抗病毒活性^{[17, 22, 23, 24]}，其中，IFNAR1的结合位点是螺旋B和C的中心^[25]，IFNAR2是主要的配体结合成分^[26]；另外，IFN-α的 C端非结构尾巴^[23]和第129、122位的酪氨酸残基^[27]的变异影响抗病毒活性的发挥；C端112-148位氨基酸残基可能是IFN-α2c诱导抗病毒活性的位点，而N端36-41是与细胞结合的位点^[28]；此外，AB环、螺旋C和螺旋D参与受体互作^[29]，N端1-95位氨基酸的变异影响其抗病毒活性^[30]；除此之外，翻译后修饰也是影响抗病毒活性的重要因素，糖基化的rIFN-α2b的抗病毒活性对温度的敏感性降低^[3]。但对IFN-α中发挥抗病毒活性的活性成分尚不完全清楚。因此有学者推测，IFN分子的抗病毒活性可能是整个活性区与靶细胞上受体结合而发挥作用^[31]。由于IFN的抗病毒活性需要与受体相结合，因此，氨基酸位点的改变和翻译后修饰可能影响其构象，导致与受体结合的能力减弱或者虽然结合但激活下游信号通路的能力受损，以致影响宿主细胞中的抗病毒基因的表达，从而影响宿主的抗病毒作用。因此，研究IFN的构象与抗病毒活性之间的相关性具有重要意义。NDV感染HeLa细胞是常用的研究IFN-α2的模型^{[32, 33, 34]}。本实验利用该模型，通过FCM技术对病毒感染细胞的分析，进一步证实了rIFN-α2a和rIFN-α2b空间结构的改变在一定程度上降低了其抗病毒活性的发挥，这为空间结构的改变影响其抗病毒活性的发挥的论述提供了直接证据。

蛋白质药物的空间结构与其生物学功能的相关性分析，对其生产、运输、临床应用等均具有重要指导作用。温度的变化引起的变性是经常遇到的问题。虽然关于温度影响rIFN-α构象以及高温处理后其抗病毒活性的研究已有相关报道，但很少有学者将两者结合起来分析，即构象的改变与其生物学活性的相关性的研究尚未见明确报道。CD谱可以分析溶液状态下的蛋白质药物的空间结构，以此技术获得的数据更接近蛋白质的天然状态的性质。FCM技术能够在单细胞水平上分析细胞特性的变化，更能直观、简便地反映细胞水平上的变化情况。本实验通过分析表明，利用CD和FCM技术相结合可以较好地分析IFN-α的空间结构与其抗病毒活性的相关性，并且分析结果与报道的一致。该方法的建立为蛋白质药物的空间结构和功能分析奠定了技术基础。