鸭病毒性肝炎 (Duck viral hepatitis，DVH) 是由鸭肝炎病毒 (Duck hepatitis virus，DHV) 引起的，主要感染21日龄以内的雏鸭，引起典型的肝炎症状，雏鸭死亡率高达80%以上，传播迅速，呈广泛性分布^{[1, 2, 3]}。2008年，DHV被重新命名为鸭甲型肝炎病毒 (Duck hepatitis A virus，DHAV)。DHAV分为A、B、C三个基因型，分别对应血清1型 (DHAV-1)^[4]、台湾新型 (DHAV-2)^[5]、韩国和中国新型 (DHAV-3)^{[6, 7]}{Li,2013 #12}。

为了解我国DVH的流行现状，Fu等^[8] 2001‒2007年从北京、天津等5个发病鸭场分离到的28份死亡雏鸭的肝脏样品进行核苷酸序列分析和血清型分析，分离到15株DHAV-3和13株DHAV-1。何冉娅等^[9]在2007‒2009年对华南地区发病鸭场的病料进行病原学鉴定和VP1基因序列分析，分离到15株DHAV-3和3株DHAV-1。由此可知，目前我国主要是DHAV-1和DHAV-3同时流行，且DHAV-3的流行地域分布在扩大。

多年来，科学工作者一直致力于DHAV疫苗的研究并取得了一定的进展。1981年，Gough等^[10]研制的鸭胚灭活疫苗3次免疫雏鸭后，血清中和滴度值为178，当与弱毒疫苗联合免疫雏鸭时，血清中和抗体滴度值高达768，比单独免疫高出4.3倍。2000年，陈克强等^[11]研制的蜂胶灭活疫苗，免疫雏鸭7 d后，攻毒保护率为85.7%。目前，DHAV-1的防制主要使用弱毒疫苗^[12]，该疫苗免疫雏鸭后免疫保护率为88.0%‒94.0%^[13]，或通过免疫种鸭为雏鸭提供母源抗体^[14]。但Woolcock等^[15]将弱毒疫苗免疫于易感雏鸭，连续传代检测其毒力情况，结果显示弱毒疫苗存在毒力返强现象。对于DHAV-3的预防可以采用经SPF鸡胚连续传代100次致弱的病毒研制而成的疫苗免疫雏鸭，结果显示对雏鸭有较好的临床保护，且疫苗不存在毒力返强现象，但疫苗是否能通过免疫种鸭为雏鸭提供保护还需要进一步研究^[16]。目前，我国DHAV的快速变异及广泛流行给养鸭业造成了巨大的经济损失，迫切需要研制针对流行毒株且安全有效的疫苗^[17]。为此，本试验选取目前临床流行毒株1型DHAV-SH和3型DHAV-FS的鸭胚胚体研磨液作为疫苗毒种研制成二价灭活疫苗并进行免疫效果评价，旨在为该病的防控提供一定的理论指导。

1 型毒株：DHAV-SH、DHAV-GD、DHAV-FJ、DHAV-PT；3型毒株：DHAV-FS、DHAV-BZ，毒株来源为上海、广东、福建、北京、山东某鸭场病死雏鸭，由中国科学院微生物研究所分离、鉴定和保藏。

1 日龄DHAV抗体阴性雏鸭 (雌性北京白羽鸭)、11日龄鸭胚均购自北京金星鸭业有限公司；5周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；4月龄雌性日本大耳白种兔购自北京维通利华实验动物技术有限 公司。

佐剂Montanide_ISA206购自法国赛比克公司；吐温-80购自上海申宇医药化工有限公司；硬脂酸铝购自上海裕明实业有限公司；甲醛溶液购自国药集团化学试剂有限公司；DHAV-1和DHAV-3标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；硫乙醇酸盐培养基 (T.G.)、酷胨琼脂 (G.A) 和葡萄糖蛋白胨汤 (G.P.) 均由福州大北农生物技术有限公司制备；DNA marker DL5 000、Taq DNA聚合酶、dNTPs、AMV反转录酶、RNase抑制剂购自宝生物工程 (大连) 有限公司；反转录试剂盒购自Promega公司。

取DHAV-SH、DHAV-GD、DHAV-FJ、DHAV-PT、DHAV-FS、DHAV-BZ (简称：6株DHAV)，分别用灭菌生理盐水稀释10倍后，接种11日龄鸭胚，0.1 mL/枚，无菌收取接种后24‒120 h死亡鸭胚胚体，在11日龄鸭胚上传代15次，收集鸭胚胚体并制成研磨液，于‒20 ℃保存，备用。

取6株DHAV的F₅代鸭胚胚体研磨液，按照Trizol试剂说明，提取病毒RNA，反转录后以合成的cDNA为模板，根据GenBank上登录的DHAV-1-R85952 (DQ22654.1) 和DHAV-3-FS (EU877916.1) 基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件设计引物，使用P1/P2、P3/P4两对引物 (表1)，分别进行PCR扩增，取10 μL PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物进行测序及序列分析。

取6株DHAV的鸭胚胚体研磨液，融化后3 000 r/min离心5 min，吸取上清进行10倍系列稀释，每个稀释度接种5枚鸭胚，0.1 mL/枚，37 ℃孵育120 h，记录24‒120 h内死亡和存活的鸭胚。按Reed-Muench氏法计算鸭胚半数致死量 (ELD₅₀)。

取6株DHAV的F₅代鸭胚胚体研磨液，进行10倍系列稀释，每个稀释度接种5只1日龄雏鸭，每只腿部肌肉注射0.1 mL，观察7 d，记录雏鸭发病和死亡情况，按Reed-Muench氏法计算雏鸭半数致死量 (LD₅₀)。

6 株DHAV经ELD₅₀和LD₅₀测定后，确定毒株DHAV-SH和DHAV-FS作为疫苗候选株。为了确定疫苗候选毒种的使用代次，分别将DHAV-SH和DHAV-FS经鸭胚传代15次，无菌收取F_1-15代鸭胚胚体并制成研磨液，然后对其进行ELD₅₀测定。

水相制备：取DHAV-SH和DHAV-FS的F₅代鸭胚胚体研磨液，作为疫苗毒种，使用2‰甲醛溶液进行灭活，检验合格后等量混合，再与吐温-80按96∶4比例混合，充分搅拌，使吐温-80完全溶解。

油相制备∶佐剂 (Montanide_ISA206) 94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，116 ℃灭菌30 min，冷至室温。

疫苗的配制：取1.5份油相置于乳化罐内，慢速搅拌，同时加入1份水相，以3 000 r/min搅拌5 min，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005%。乳化结束后进行定量分装，4 ℃保存，批号分别为LW2013001、LW2013002和LW2013003。

参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》^[18]附录方法，对3批二价灭活疫苗实验室制品进行物理性状检验。

1 日龄雏鸭10只，各颈部、背部皮下注射疫苗0.4 mL；5周龄雌性BALB/c小鼠10只，各背部皮下注射疫苗0.4 mL；4月龄健康的雌性日本大耳白种兔6只，各腿部肌肉注射疫苗0.4 mL，观察14 d，记录局部反应和临床症状。

将420只健康的1日龄雏鸭随机分成2组，免疫组360只，对照组60只。免疫组再随机平均分成3个组，每组120只，分别免疫3批二价灭活疫苗实验室制品，对照组注射生理盐水。雏鸭免疫后第7、14、21、28、42、63天分别从各免疫组取20只、对照组10只进行攻毒试验和血清学检测，其中免疫雏鸭10只和对照鸭5只，每只腿部肌肉注射DHAV-SH的F₅代鸭胚胚体研磨液0.2 mL；另外免疫雏鸭10只和对照鸭5只，每只腿部肌肉注射DHAV-FS的F₅代鸭胚胚体研磨液0.2 mL。

取60只1日龄雏鸭，分为3组：1型(DHAV-SH) 单价灭活疫苗组、3型 (DHAV-FS) 单价灭活疫苗组和不注射对照组，每组20只。采用颈部皮下注射的方法接种鸭肝炎病毒各单价灭活苗，0.4 mL/只。免疫后14 d，各组取10只攻击DHAV-FS毒株，另10只攻击DHAV-SD毒株，攻击量均为1 000 LD₅₀，观察14 d，记录各组发病情况。

对北京市、辽宁省等134个鸭场共352份样本进行DHV血清型分析，其中分离到201株DHAV-1、38株DHAV-3，结果显示DHAV-1和DHAV-3为我国流行优势血清型。挑选毒力较高的6株DHAV，以其cDNA为模板，PCR扩增得到大小分别为229 bp (DHAV-1)、311 bp (DHAV-3) 的阳性条带。由此判定分离到的DHAV-SH、DHAV-GD、DHAV-FJ、DHAV-PT为DHAV-1型毒株；DHAV-FS、DHAV-BZ为DHAV-3型毒株 (图1)，毒株分子测序鉴定结果见图2。

图1 6株分离毒株RT-PCR检测结果 Fig.1 RT-PCR identification of six isolate strains. 1‒4: represent type 1 strains: DHAV-SH,DHAV-GD,DHAV-FJ,DHAV-PT,respectively; 5‒6: represent type 3 strains: DHAV-FS,DHAV-BZ,respectively; 7: negative control; 8: marker DL5 000.

图选项

图2 DHAV-1和DHAV-3的分子测序结果 Fig.2 The results of molecular sequencing. (A) DHAV-1. (B) DHAV-3.

图选项

分别对6株DHAV进行ELD₅₀和LD₅₀测定，计算平均值。结果显示，在这6株DHAV中，DHAV-SH和DHAV-FS的ELD₅₀和LD₅₀的平均值是最高的 (表2)，因此确定DHAV-SH和DHAV-FS为疫苗候选毒株。

DHAV-SH和DHAV-FS在鸭胚上传代15次，F_1-15鸭胚胚体研磨液的病毒含量均≥10^-7.0 ELD₅₀/mL，毒力稳定。为了保证二价灭活疫苗实验室制品的质量，选取ELD₅₀最高且稳定的鸭胚胚体研磨液作为疫苗毒种，即DHAV-SH和DHAV-FS的F₅代鸭胚胚体研磨液，其ELD₅₀/mL分别为10^-7.3和10^-7.1。

3 批二价灭活疫苗实验室制品的物理性状的检测结果，如表3所示。

为了检测3批二价灭活疫苗实验室制品的安全性，分别给健康的雏鸭、BALB/c小鼠及日本大耳白种兔接种疫苗，观察14 d，结果显示，免疫的动物均无红肿、硬结和鸭病毒性肝炎的临床症状 (表4)。

在雏鸭免疫二价灭活疫苗实验室制品 0.4 mL/只后，第7、14、21、28、42、63天血清用鸭胚中和法测定其效价 (以10ⁿ表示)^[19]。结果显示第7天可检测到DHAV-SH和DHAV-FS中和抗体，分别为10^0.64‒10^0.75和10^0.62‒10^0.72；第7天开始缓慢上升，第28天达到最高值 (DHAV-SH和DHAV-FS的平均效价分别为10^1.48和10^1.33)，之后缓慢下降，第63天平均效价仍大于第7天。对照组在各个时间点的效价均为0 (图3)。

图3 血清中和抗体效价 (以10n表示) 的消长动态 Fig.3 The VN titers (Shown as 10n) of serum antibodies in immunized ducklings.

图选项

1 日龄雏鸭免疫后第7、14、21、28、42、63天，用F₅代的DHAV-SH和DHAV-FS的鸭胚胚体研磨液各0.2 mL进行攻毒。其保护率在第7天时开始产生保护，保护率为30%‒60%，14‒21 d时上升到90%‒100%；28 d达到100%。对照组的攻毒死亡率在7、14及28 d均为100%。28 d后雏鸭对强毒不太敏感 (表5)。从结果可知，本试验研制的二价灭活疫苗实验室制品对雏鸭有较好的免疫保护作用。

1 日龄雏鸭免疫单价灭活疫苗DHAV-SH和DHAV-FS后，第14天进行交叉攻毒保护试验，结果显示，DHAV-SH灭活疫苗对DHAV-1型强毒攻击的保护率为80%以上，而对DHAV-3型病毒的攻击保护率仅为30%；DHAV-FS灭活疫苗对DHAV-3型病毒的攻击保护率为80%以上，而对DHAV-1型病毒的攻击保护率仅为20% (表6)。

本试验所使用的疫苗候选毒株1型DHAV-SH和3型DHAV-FS均为DHAV流行优势株，其ELD₅₀≥10^-6.25、LD₅₀≥10^-2.0。Gough等^[10]报道称鸭胚灭活疫苗诱导的抗体反应优于鸡胚灭活疫苗。因此，DHAV-SH和DHAV-FS经鸭胚传代15次后，挑选ELD₅₀≥10^-7.1的F₅代鸭胚胚体研磨液作为疫苗毒种候选株。疫苗配制时将非离子型乳化剂吐温-80和司本-80制

备成二价灭活疫苗，这两种乳化剂是单油酸酯，可以增加疫苗的安全性。在安全性检测中，被免疫的实验动物均无局部反应和鸭病毒性肝炎的临床症状，说明该疫苗实验室制品的安全性较好。研制的疫苗实验室制品以0.4 mL剂量免疫雏鸭，攻毒后第7‒21天雏鸭保护率为90%‒100%，雏鸭免疫持续期可达5 d以上。

随着疫苗中的抗原变得越来越单一，佐剂对疫苗效率起着重要的作用。为了应用到动物疫苗领域，佐剂应具备增强疫苗对病原的特异性免疫应答、提高保护力、使用方便、减少免疫剂量、降低疫苗成本等特点^[20]。随着养鸭业对疫苗需求量的增加，乳剂符合动物疫苗佐剂的标准成为常用佐剂类型^[21]。根据分散状态不同，乳剂分为油包水 (W/O) 型乳剂和水包油 (O/W) 型乳剂。白油佐剂质量对于疫苗安全性及其免疫效力有着重大影响。常规矿物油佐剂黏度较高、吸收不完全^[22]且产生抗体速度较慢。本试验使用的Montanide_ISA206，属于水包油包水(W/O/W) 型复合乳剂，与传统油佐剂相比，粘度低，易与毒株混合，同时产生抗体快便于灭活疫苗尽早发挥作用，同时稳定性较好^[23]。另外，与O/W型乳剂相比，Montanide_ISA206通过缓慢释放抗原增加免疫持续时间实现长期保护，这点与W/O型乳剂作用机理相同，但是注射部分的安全性又优于W/O型乳剂^[20]。

田间试验是疫苗研制非常重要的环节。本试验研制的DHAV二价灭活疫苗目前为实验室阶段产品，目前正在向农业部审核批准临床试验申请，批复后将进行田间试验。

针对目前我国DHAV-1和DHAV-3两种血清型同时流行的现状^[24]，目前已经批复了弱毒疫苗对其进行防控^[13]，但存在毒力返强的风险^[15]。弱毒疫苗若减毒不足，则无法保证疫苗的安全性，但减毒过度会降低病毒的毒力，也有可能降低疫苗的免疫原性^{[25, 26]}。同时，弱毒疫苗在普通的冻干剂中不稳定，储存和运输过程中需要特殊的冷藏设备，使得成本升高^[27]。本试验利用鸭病毒性肝炎的南、北方流行毒株研制成二价灭活疫苗实验室制品。我们可以把该疫苗应用到鸭养殖场，针对雏鸭进行免疫来预防DHAV-1和DHAV-3的流行。{Kang,2010 #7}因此本试验研制的DHAV二价灭活疫苗实验室制品安全、可控、稳定、高效，为我国鸭病毒性肝炎的预防和控制提供了一种新方法和新产品。