戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是一种造成全球急性病毒性肝炎的人兽共患病病原^[1]。戊型肝炎属自限性感染疾病，轻症感染者会出现轻度发烧、恶心、皮疹等症状，一般2−6周内会自愈^[2]；重症戊型肝炎患者可能发展成急性戊型肝炎，造成急性肝衰竭，甚至导致死亡^[3]。HEV是世界范围内最常见的急性病毒性肝炎病毒，全球每年约有2 000万患者感染，约330万病例有临床症状^[4]。

1955年，第一次回顾性确定的戊型肝炎疫情在印度暴发，统计病例数达2.9万例^[5]。1983年，Balayan等通过免疫电镜技术首次在阿富汗的苏联士兵中发现戊型肝炎的病原体颗粒^[6]。我国法定传染病报告显示，近十年来，戊型肝炎报告发病数超过甲肝发病数，并且其报告死亡率已升至五大病毒性肝炎首位^[7]。

后疫情时代，HEV引起了特别的关注。许多研究表明猪并不是HEV的唯一宿主，蝙蝠很可能也是这些高致病性病毒的天然宿主^[8]。此外，全球首例鼠传人戊型肝炎的出现也给人们敲响了警钟，证实HEV正在不断进化，拥有跨物种传播能力^[9]。HEV作为食源性病毒之一，以粪-口传播为主，如食用受HEV感染的猪肉或猪肉制品、饮用受污染的水等，其危害已成为我国食品安全的主要问题^[10-11]。因此，本文对HEV的遗传多样性和进化机制进行综述，以期为发现和监测新毒株的流行以及毒株之间的联系，预报流行趋势和提出新的防治策略提供参考。

1 基因组结构

1990年，HEV缅甸株的全长基因组被首次克隆测序^[12]，其基因组长度约为7.2 kb，由单股正链RNA编码^[13]，包含3个或4个开放阅读框(open reading frames, ORFs) (图 1)^[14]。

以Sar55株(GenBank登录号：AF444002)为例，ORF1是HEV基因组中最大的ORF，共有5 081个核苷酸，其编码的非结构蛋白由多个结构域组成，即甲基转移酶(methyltransferase, Met)、Y结构域(Y-domain, Y)、蛋白酶(putative papain-like cysteine protease, PCP)、高变区(hypervariable region, HVR)、X结构域(macro- domain, X)、解旋酶(helicase, Hel)和RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)^[15]。ORF1编码的非结构蛋白是HEV基因组复制所必需的，但目前尚不清楚ORF1产物是作为具有多个结构域的单个蛋白质起作用，还是被加工成单独的功能单位。

ORF2由1 982个核苷酸组成，包含壳(shell, S)、中间(middle, M)和突出(protruding, P)结构域，主要编码两种形式蛋白：分泌形式(secreted form of ORF2, ORF2^S)和衣壳蛋白(capsid- associated ORF2, ORF2^C)；ORF2^S由一直被认为是HEV衣壳蛋白的起始密码子(第一个AUG密码子)翻译而来，ORF2^C在高度保守的内部AUG密码子(第一个AUG下游的15个密码子)处翻译；与ORF2^C不同，ORF2^S以糖基化二聚体形式存在，不会阻断HEV进入细胞，但会抑制抗体介导的中和作用^[16]。作为主要的病毒粒子成分，HEV ORF2最初被认为只用于编码衣壳蛋白^[17]。然而，近年来研究发现，除了形成衣壳外，ORF2在病毒复制、发病机制和诊断中都起着重要作用^[18-19]。

ORF3是所有HEV ORF中最小的ORF，与ORF2的N端部分重叠，存在2个疏水结构域和2个富含脯氨酸的结构域，编码分子量约为13 kDa的磷酸蛋白^[20]。最初，HEV ORF3蛋白未引起过多关注。因为在细胞培养中，即使没有合成ORF3蛋白，也会产生明显真实的病毒粒子，因此ORF3蛋白似乎只是一种病毒调节蛋白，而不是病毒粒子的结构成分，不参与体内病毒粒子的产生^[21]。然而，随后的研究表明ORF3是HEV生命周期中所必需的，ORF3的缺失显著降低了HEV复制和从顶端表面释放的病毒粒子，尽管ORF3缺失的突变HEV能够在肝脏中短暂复制，但未能维持感染并最终被清除^[22]。

ORF4共有476个核苷酸，仅由HEV-1在内质网应激条件下编码合成ORF4蛋白；ORF4蛋白是一种中度无序蛋白，其多肽链中无序残基(VLXT、VSL2、VL3)少于30%，且在N末端有一段无序结构域^[23]。核苷酸组成分析表明，ORF4蛋白编码序列中C核苷酸含量最高，A核苷酸含量最低，G和T(U)核苷酸含量相近；这种核苷酸组成限制影响HEV同义密码子使用模式，从而影响病毒的进化^[24]。

2 分类和区域流行特点

根据2022年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)的最新报告，HEV被归类为戊型肝炎病毒科(Hepeviridae)，其中包含正戊型肝炎病毒属(Orthohepevirus)和鱼戊型肝炎病毒属(Piscihepevirus) 2个不同的属，Orthohepevirus分为Orthohepevirus A−D 4个种，具有不同的宿主范围^[25]。Orthohepevirus A细分为8个基因型(HEV-1−HEV-8)，其中HEV-1和HEV-2仅感染人类，主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的热带和亚热带地区；HEV-3和HEV-4属于人兽共患病病原，在全球范围内均有流行；HEV-5和HEV-6仅在野猪中发现；HEV-7和HEV-8分别在单峰骆驼和双峰骆驼中发现^[26]。目前研究重点主要集中在能感染人类的HEV-1−HEV-4，这4种基因型进一步划分为多个基因亚型，包括HEV-1的7个亚型(1a−1g)、HEV-2的2个亚型(2a和2b)、HEV-3的14个亚型(3a−3m和3ra)和HEV-4的9个亚型(4a−4i)^[27]。依据GenBank中现有的HEV全基因组核苷酸序列数据绘制系统发育树(图 2)，结果证实HEV具有丰富的遗传多样性。

HEV的基因型和亚型流行不仅具有明显的地域性，并且会随着时间的推移而发生变化^[28]，如我国20世纪90年代的戊型肝炎处于以HEV-1引起的频繁暴发的高流行模式，而目前则处于以HEV-4感染的散发病例的低流行模式，其中以4a、4b、4d和4h这4种亚型为主^[29]。同时，HEV的流行也与宿主物种有着密切关系，如从葡萄牙野猪中分离出的HEV毒株主要为基因3e和3m亚型^[30]；从日本梅花鹿中检测出基因3b亚型毒株^[31]；而从我国西北地区养殖猪中分离出基因4a、4d和4h亚型毒株^[32]。

在欧洲，大多数急性HEV患者是流行地区的旅行者或接受过输血的患者，流行基因型为HEV-3^[33]。在过去十年中，欧洲国家HEV抗体的血清阳性率一直在增加，并且在不同地理区域之间显示出显著差异^[34]。一项研究分析了德国2010−2019年936份人源HEV RNA阳性样本，结果显示以3c亚型为主(67.3%)，其次为3f、3e和3i亚型，分别为14.3%、9.7%和4.0%，其他亚型为1.1%^[34]。

美洲的HEV抗体血清阳性率很高，但临床重要病理报告却不常见，可能反映了无症状的高比例和对HEV认知的局限性，与欧洲相同的是，美洲检出最多的同样是HEV-3，过去17年报告的病例中，在阿根廷检测到3a和3b亚型，在巴西检测到3b和3i亚型，HEV-1仅在委内瑞拉和乌拉圭检出^[35]。

在亚洲，主要流行HEV-3和HEV-4，不同国家显示出不同的流行差异。在一项对日本人群HEV感染的流行情况研究中，以2002−2007年30个县的22 027人为研究对象收集血清样本，通过巢式RT-PCR检测出HEV RNA均为HEV-3^[36]。对1997−2022年中国HEV流行率的Meta分析表明，我国HEV优势基因型为HEV-4，包括4a、4d、4f和4h亚型^[37]。

HEV在全球各地流行，但不同时间以及地区HEV基因型和亚型的分布和流行具有差异。因此加强对HEV的分子流行病学研究可以有效掌握其流行情况以及分布特点，为制定准确有效的HEV防控策略提供帮助。

3 进化机制

对HEV分离株的基因组序列的比较分析揭示了它们之间存在广泛的遗传多样性，这些遗传差异可能是受到宿主免疫和选择压力(如疫苗免疫和抗病毒药物治疗)的影响。为了更好地适应生存环境和从宿主免疫系统逃逸，HEV在这些压力下不断进化。尽管HEV毒株具有高度多样性和异质性，但仅存在一种血清型的HEV，这可能与衣壳蛋白氨基酸序列的高度保守有关。目前的研究表明，HEV进化的影响因素主要是同义密码子使用模式、突变和重组。

3.1 同义密码子使用模式

除色氨酸和蛋氨酸具有单个密码子外，其他氨基酸都具有多个编码密码子，这些密码子被定义为同义密码子。同义密码子使用模式中的突变偏差或自然选择是决定病毒进化变化的重要因素，这些变化使它们能够增强病毒存活率和病毒对宿主的适应性。研究发现，通过进化选择(包括自然选择)对HEV-1进行密码子选择的偏好通常强于来自人类或猪的HEV-3和HEV-4，因此由同义突变引起中性进化的HEV-1能够通过强大的自然选择维持其稳定的遗传特征，而HEV-3和HEV-4的多种同义密码子使用模式是进化的标志，使其能够更好地适应不同宿主^[38]。深入研究表明，HEV ORF1中具有稳定使用模式的密码子有助于维持感染，而在ORF3中具有不同使用模式的密码子有助于跨物种感染并扩大宿主范围^[39]。对于ORF4的同义密码子使用模式分析也表明，ORF4中的同义密码子使用是一个进化过程，反映了突变和选择力的动态过程以调整其密码子的使用从而适应不同的宿主和条件^[24]。对同义密码子的使用模式研究证实了HEV基因组进化主要基于突变压力，而不是由地理或宿主因素驱动的。

3.2 氨基酸突变

病毒基因组的突变是进化的重要方式之一，准确发现病毒突变位点及影响对于了解病毒的进化十分重要。一方面，宿主免疫应答压力下HEV发生突变从而有助于逃避宿主免疫反应。病毒衣壳蛋白具有免疫原性，其序列发生少许变化也可能导致病毒抗原中和表位发生突变，从而影响病毒的免疫反应性。Zhang等研究发现HEV ORF2编码蛋白中的Leu477和Leu613在HEV抗原中和表位的形成中至关重要，使其发生突变导致HEV免疫反应性降低^[40]。然而，衣壳蛋白中的F51L、T59A和S390L突变却导致HEV毒力衰减，可能是由于F51L和T59A突变影响病毒基因组RNA包装，而S390L突变改变抗原中和表位的结构从而阻止病毒与宿主细胞受体之间的相互作用^[41]。

另一方面，抗病毒药物治疗的选择压力也会导致HEV发生突变，使其获得耐药性。利巴韦林可用于治疗慢性戊型肝炎，然而研究表明利巴韦林治疗可能导致HEV突变，导致病毒对利巴韦林敏感性改变，产生耐药性；利巴韦林耐药性与HEV RdRp中的Y1320H、K1383N和G1634R突变有关，Y1320H和G1634R突变以及高变区插入使HEV的复制增加，而K1383N突变抑制了病毒复制，增加了对利巴韦林的敏感性^[42]。

3.3 基因重组

重组是一般病毒进化的重要驱动力，但在HEV中重组现象却鲜有报道，最早报道的HEV毒株重组是在2005年，研究鉴定了中国D和尼泊尔TK15两种重组HEV毒株^[43]。随后在HEV重组的深入研究中，研究人员使用重组检测程序分析发现，HEV存在双重重组和四重重组事件^[44-45]，其中重组猪源分离株swCH31发生了两次重组，第一处重组的主要亲本株(CHN-XJ-SW13)和次要亲本株(E067-SIJ05C)分别为从中国新疆的猪中分离和中国上海的日本患者中分离出来的HEV-4毒株，为基因型内重组；第二处重组为基因型间重组，发生在以毒株E067-SIJ05C为主要亲本，以日本急性肝炎患者分离的HEV-3毒株JJT-Kan为次要亲本之间^[44]。来自英国的HEV-3毒株(HEV_32_Manchester_ 301214)经历了4次重组事件，主要亲本株(HEPAC-44)是从患者血液中分离出来的法国HEV-3毒株，而次要亲本株(HE-JA15-1335)是从本土人血清中分离出来的日本HEV-1毒株^[45]。HEV的重组可能导致其毒力以及宿主发生变化，也可能导致现有的防控效果失效。

4 疫苗

由于缺乏HEV体外培养技术，HEV灭活疫苗尚未成功研制^[46]。因此目前对于疫苗的研究主要集中于利用基因工程表达不同长度ORF2截短蛋白，例如以HEV-3 179截短的ORF517编码蛋白在大肠杆菌中表达^[47]；由昆虫细胞表达的53 kDa截短HEV衣壳蛋白^[48]；在毕赤酵母中表达HEV-1 ORF2的112−608氨基酸残基区域^[49]。这些蛋白可以自组装成HEV病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，并且动物免疫实验结果显示出高水平抗体滴度，具有良好的免疫原性，可用于未来HEV疫苗的开发。目前唯一上市的HEV疫苗为我国的HEV疫苗(益可宁)，由厦门大学和万泰生物共同研发制造，于2012年在中国上市。益可宁第Ⅲ期临床试验显示，接受益可宁的参与者在第三剂后12个月内均未发生戊型肝炎感染，而对照组中发现了15例病例，表明疫苗效力为100%^[50]。另一项研究证明益可宁不仅在16−65岁的健康成年人中是安全且高效的，在65岁以上的老年人中同样耐受性良好^[51]。目前，益可宁在预防HEV方面十分有效，但是随着HEV的不断进化，需要加强对戊型肝炎疫苗的研究以及进一步评估HEV疫苗在控制戊型肝炎中的作用。

5 展望

民以食为天，食以安为先，食品安全关乎每个人的生命健康。病毒污染引起的食品安全问题不可忽视，需对食品中病毒的污染监测、结构功能以及遗传进化进行深入研究，为食源性病毒的有效防控以及疫苗的制备提供理论基础。综上所述，虽然目前的疫苗预防能有效干预HEV的传播，抗病毒药物治疗也能有效抑制病毒的复制，但是HEV在宿主免疫应答和抗病毒药物的选择压力下也在不断进化以提升生存能力，产生耐药性或导致严重疾病的发生。未来需要积累更多病毒序列，了解HEV的自发突变率和进化机制，并且加强对病毒体外培养体系的研究，开发出更多抗病毒治疗药物和疫苗，从而拥有更多、更有效的手段对抗HEV的入侵。