γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate, GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸，它在抑制脑神经传导方面起着重要作用，是人体大脑皮层主要的抑制神经递质。摄入γ-氨基丁酸有助于维持大脑的神经传递稳定性，从而帮助高血压患者降低血压。此外，由于其具有降低血压、减轻焦虑和抑制糖尿病等功能，因此被用作食品添加剂或膳食补充剂^[1]。γ-氨基丁酸在大脑皮层神经元间是一种抑制性氨基酸的神经递质^[2-4]。在疾病治疗方面，它和5-羟色胺对肝病及由此产生的神经系统损伤有治疗作用^[5-9]。γ-氨基丁酸还可促进人的胰岛β细胞上升^[10-12]，从而降低血糖、减轻糖尿病症状，并为治愈由缺乏胰岛β细胞引发的I型糖尿病提供可能。γ-氨基丁酸还能为多种化工产品的生产提供一种不依赖石油资源、安全环保和节能高效的底物，具有重要的经济价值。如γ-氨基丁酸可以通过简单的化学反应转化为对环境友好的塑料溶剂N-毗咯烷酮和生物可降解材料聚酰胺-4^[13]。因此，γ-氨基丁酸的制备已成为当前国内外研究的热点之一。

目前γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、植物富集法和微生物合成法。化学合成法反应条件苛刻，对环境污染大，制备的γ-氨基丁酸不能用于食品领域。植物富集法产量低，无法大规模生产。利用微生物法制备γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点，展现出广阔的应用前景。该方法以L-谷氨酸(L-glutamate)作为前体物质，在微生物细胞的内源性谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化下发生特异性的脱羧反应合成γ-氨基丁酸。与植物富集提取法和化学合成法相比，微生物发酵法具有反应条件温和、副产物少和对环境友好等优点。目前，通过微生物发酵法制备γ-氨基丁酸的主要菌株是乳酸菌，主要包括短乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌等^[14-15]。然而来源于野生型的菌株的内源性L-谷氨酸脱羧酶的活力均较低，成为其催化L-谷氨酸高效制备γ-氨基丁酸主要限制因素。近年来，随着基因工程和代谢工程的发展，通过在大肠杆菌、酵母菌和谷氨酸棒状杆菌中过量表达L-谷氨酸脱羧酶基因，实现γ-氨基丁酸的高效制备，已成为其生产的主要方法。

L-谷氨酸脱羧酶在生物界中分布非常广泛，无论是单细胞生物，还是哺乳动物体内都存在^[16]。它能催化谷氨酸进行新陈代谢，不同细菌中的L-谷氨酸脱羧酶的性质具有相同点^[17]，同时也有区别。乳酸乳球菌中的L-谷氨酸脱羧酶，其亚基的相对分子质量为65 kDa，且具有高度的专一性^[18]。在18种氨基酸中，L-谷氨酸是唯一的作用底物。当pH值超过6.0时，L-谷氨酸脱羧酶会失去活力。L-谷氨酸脱羧酶包含2个亚基单位GadA和GadB。GadB催化L-谷氨酸脱羧是生物体合成γ-氨基丁酸的重要途径之一。绝大多数生物合成γ-氨基丁酸的研究都基于该途径^[19-20]。除了L-谷氨酸外，L-谷氨酸钠(l-monosodium glutamate, l-MSG)也可作为L-谷氨酸脱羧酶GadB的底物。L-谷氨酸和L-谷氨酸钠都没有毒性，经济上L-谷氨酸钠价格更便宜，且L-谷氨酸脱羧酶GadB对Na⁺具有一定的耐受性，因此不少研究将L-谷氨酸钠作为发酵底物，直接添加以促进γ-氨基丁酸生物合成^[21-22]。

磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)是L-谷氨酸脱羧酶的辅基^[23]。在生物体内，磷酸吡哆醛与脱辅基酶蛋白能够发生解离和聚合作用，从而调节L-谷氨酸脱羧酶的活性。磷酸吡哆醛合酶基因SNO1和SNZ1来源于酿酒酵母，具有催化3-磷酸甘油醛和l-谷氨酰胺转化为磷酸吡哆醛的能力。当2个基因SNO1和SNZ1在大肠杆菌中同时异源表达时，2种蛋白产物能够形成复合物，并能够提高L-谷氨酸脱羧酶的活性，单独表达时不能形成相应的复合物。

在大肠杆菌(E. coli)中^[24]，gab操纵子是γ-氨基丁酸分解代谢支路的重要组成部分。gab操纵子的结构基因主要包括gabT和gabP，gabT编码的酶GABA-T的同工酶为PuuE (由基因puuE编码)。GABA-T能够催化γ-氨基丁酸生成琥珀酸半醛。gabP编码的γ-氨基丁酸通透酶能够使γ-氨基丁酸进入细胞内，因此gabT、gabP和puuE三个基因在大肠杆菌中的敲除可使γ-氨基丁酸积累。在前期研究中，本实验室已成功构建这3个基因敲除的重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE^[25]。

鉴于此，本研究通过加强L-谷氨酸脱羧酶GadB的过量表达和引入辅酶因子磷酸吡哆醛高效再生的2个关键基因SNO1和SNZ1，实现γ-氨基丁酸的高效生产。为此，首先构建了pTrc99a-gadB和pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1两个重组质粒，然后将它们分别导入基因敲除菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE中，并利用不同底物浓度的L-谷氨酸钠对重组菌株进行发酵培养，再通过高效液相色谱法检测γ-氨基丁酸的产量，以期得到重组菌产γ-氨基丁酸的最佳发酵条件。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

Escherichia coli K12 (MG1655)和E. coli DH5α均购自杭州宝赛生物工程有限公司，E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE由本实验室自行构建^[25]，酿酒酵母菌株S288C购自生工生物工程(上海)股份有限公司，质粒pTrc99a购自Novagen有限公司。

1.1.2 培养基和试剂

LB液体培养基：0.5%酵母提取物，1.0%蛋白胨和1.0%氯化钠。用1 mol/L的氢氧化钠调节pH至7.0，然后于121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基：1.5%的琼脂粉加入至LB液体培养基中，121 ℃灭菌20 min，灭菌后冷却至合适温度，然后倒入平板中。

氨苄青霉素溶液：称取1.0 g氨苄青霉素，用无菌水配制成10 mL溶液，然后用0.22 μm的滤膜过滤，−20 ℃保存。

发酵培养基：0.5%酵母提取物，1.0%蛋白胨和1.0%氯化钠，适量浓度的L-谷氨酸钠(5、10、20、30、40 g/L)。用1 mol/L的氢氧化钠调节pH至7.0，然后于121 ℃灭菌20 min。

磷酸缓冲液(pH 7.4)：称取KH₂PO₄ 0.27 g，Na₂HPO₄ 1.42 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，定容到1 L，然后用浓盐酸调节pH值至7.4，灭菌后4 ℃冰箱放置。

异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-galactothioglycoside, IPTG)母液配制：称取1.19 g异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，加入至5 mL灭菌的双蒸水中，溶解均匀后，置于−80 ℃的冰箱中保存。

甘氨酸、考马斯亮蓝R-250、L-谷氨酸钠、核酸染料4S Red Plus染色剂(10 000×水溶液)、琼脂糖M、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉和氨苄青霉素均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。γ-氨基丁酸标准品购自Sigma公司。

细菌基因组提取试剂盒、细菌感受态制备试剂盒、酵母细胞提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、割胶回收试剂盒、高保真rTaq酶、限制性内切酶Nco I、Kpn I、BamH I和Xba I均购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.3 仪器

恒温金属浴，上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机，Sigma公司；Mastercycler梯度PCR仪，Eppendorf公司；紫外分光光度计，Mapada公司；生化培养箱，上海一恒科技有限公司；岛津高效液相色谱仪，岛津公司；恒温摇床，上海苏坤实业有限公司；恒温水槽，杭州博日科技有限公司；酶标仪，Tecan公司。

1.2 gadB、SNO1和SNZ1基因的克隆

从NCBI上分别找出大肠杆菌K12和酿酒酵母中gadB (GenBank登录号：NC-000913，1 401 bp)、SNO1 (GenBank登录号：NC-001145，675 bp)和SNZ1 (GenBank登录号：NC-001145，3 894 bp)的基因序列，并设计相应的引物来扩增这3个基因序列。设计的引物序列如表 1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增目的基因片段gadB、SNO1和SNZ1，反应体系：上下游引物各1 μL，模板1 μL，Primer STAR Premix 25 μL，补水至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；72 ℃进一步延伸10 min。取2.0 μL的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。采用大连宝生物工程有限公司的凝胶回收试剂盒进行纯化回收，得到单一条带的目的片段。

1.3 双酶切与连接

将纯化后的gadB和pTrc99a质粒分别用限制性内切酶Nco I和Kpn I进行双酶切，温度37 ℃，时间6 h。将酶切好的片段用纯化试剂盒进行纯化回收，回收产物按照片段: 载体=7:1的比例混合，混合后使用T₄ DNA连接酶于16 ℃连接12 h。使用细菌感受态制备试剂盒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的抗性平板上，培养得到阳性转化菌落。挑取克隆菌落，采用质粒提取试剂盒提取转化菌株质粒，进行双酶切验证得到重组质粒pTrc99a-gadB。在此基础上，对重组质粒pTrc99a-gadB和SNO1分别用Kpn I和BamH I在37 ℃条件下进行双酶切，然后用T₄ DNA连接酶于16 ℃连接12 h后，转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1。提取重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1，再按照同样的步骤克隆得到质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1。

1.4 重组质粒的转化与表达

将得到的2个重组质粒分别转化至E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE中。再将E. coli K12、E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE、E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB和E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1分别于37 ℃、180 r/min条件下培养12 h，然后按1.0% (体积比)的接种量转接至装有50 mL/250 mL的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养至OD₆₀₀值为0.6时，向培养基中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为1 mol/L，然后调温至30 ℃进行诱导培养12 h。取菌液50 mL离心去上清，加入10 mL pH 7.4的磷酸缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎仪破碎菌体。

1.5 四个菌株产γ-氨基丁酸能力的比较

将上述4个菌株分别接种于含10 g/L L-谷氨酸钠的发酵培养基中，于30 ℃诱导3 h后，用盐酸调节发酵液的pH至4.2，继续发酵18 h。取1 mL发酵液，采用高效液相色谱法测定生成的γ-氨基丁酸的含量。

1.6 γ-氨基丁酸摇瓶水平发酵优化

将重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB和E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1分别接种于含5、10、20、30和40 g/L L-谷氨酸钠的发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下培养48 h。取1 mL发酵液，采用高效液相色谱法测定生成的γ-氨基丁酸的含量。

1.7 1 L摇瓶体系扩大发酵培养

将重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB接种于含20 g/L L-谷氨酸钠的1 L发酵培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下培养，每隔6 h进行取样，采用高效液相色谱法测定生成的γ-氨基丁酸的含量。

1.8 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE

琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE参照参考文献[26]的方法。

1.9 发酵液中L-谷氨酸钠和γ-氨基丁酸含量的测定

发酵液样品首先进行衍生化处理：将发酵液12 000 r/min离心5 min，然后取100 μL上清液加入到离心管中，分别加入200 μL pH为10.0的1 mol/L的碳酸氢钠缓冲液、100 μL 40 g/L的丹磺酰氯的丙酮溶液以及600 μL双蒸水，制成1 mL反应混合物。将混合物在80 ℃下避光反应40 min，随后加入100 μL 10%乙酸终止反应。将混合物12 000 r/min离心5 min后，将上清液通过0.22 μm Millipore过滤器过滤，然后通过高效液相色谱法检测样品中的L-谷氨酸钠和γ-氨基丁酸含量。高效液相色谱法检测条件如下：洗脱液A为甲醇，洗脱液B为四氢呋喃/甲醇/50 mmol/L乙酸钠(pH为6.2，体积比为5:75:420)。柱温设定为30 ℃，洗脱条件如下：平衡(6 min, 20% A)，梯度(20 min, 20%−80% B)和清洗(3 min, 100% A)。流速为1 mL/min，检测波长为254 nm^[27]。

1.10 数据处理和统计分析

试验结果以平均值±标准偏差表示。数据分析采用SPSS 17.0软件，数据绘图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析 2.1 重组质粒的构建及鉴定

重组质粒的构建过程如图 1所示。分别以大肠杆菌K12和酿酒酵母的基因组为模板，采用PCR技术克隆出编码L-谷氨酸脱羧酶的基因gadB和编码磷酸吡哆醛合酶的基因SNO1和SNZ1，将这3个基因分别克隆至质粒pTrc99a中，构建2个重组质粒pTrc99a-gadB和pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1。

构建的重组质粒pTrc99a-gadB和pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1通过双酶切鉴定，结果如图 2所示。图 2A中泳道1、2和3分别是用限制性内切酶Kpn I酶切质粒pTrc99a、pTrc99a-gadB和pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的结果，可以看出三者的酶切条带大小分别为4 176、5 576和7 320 bp，与预期大小符合，可以初步判断为阳性质粒。图 2B中泳道1的条带大小约为4 176 bp，是限制性内切酶Kpn I单酶切质粒pTrc99a所得。泳道2获得了大小分别为4 176 bp和1 401 bp的2条带，是用限制性内切酶Nco I和Kpn I双酶切重组质粒pTrc99a-gadB所得。酶切获得的2个条带的大小与线性质粒pTrc99a和gadB基因大小相符，说明载体pTrc99a整合了外源基因片段gadB。泳道3为限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的结果，泳道4为限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的结果。泳道3和4的第2条带大小分别为894 bp和675 bp，说明载体pTrc99a整合了外源基因片段SNZ1和SNO1，因此可以确定重组质粒pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1构建成功。

2.2 重组蛋白电泳分析

重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果如图 3所示。泳道1、2、3和4分别表示E. coliK12、E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE、E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB和E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1诱导表达后产生的蛋白条带。L-谷氨酸脱羧酶GadB包含466个氨基酸，分子量为52.6 kDa。磷酸吡哆醛合酶SNO1包含224个氨基酸，分子量为24.9 kDa；磷酸吡哆醛合酶SNZ1包含297个氨基酸，分子量为31.8 kDa。从电泳图可以看出，重组菌株表达的3个蛋白分子量与预期分子量大小一致，说明3个蛋白在重组菌株中均表达成功。

2.3 L-谷氨酸钠和γ-氨基丁酸标准曲线

底物L-谷氨酸钠的线性回归方程为y= 1 925 820x+93 191，相关系数R²为0.999 1。产物γ-氨基丁酸的线性回归方程为y=4 687 190x+ 386 944，相关系数R²为0.999 3。2个回归方程的线性相关系数均超过0.99，表明线性关系良好，可用作标准曲线。

2.4 四个菌株发酵产γ-氨基丁酸能力的比较

通过高效液相色谱法检测4个重组菌发酵液中γ-氨基丁酸含量，结果如图 4所示。从图 4可以看出，重组菌E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB (R3)发酵液中的γ-氨基丁酸浓度达到4.6 g/L，是4个菌株中产γ-氨基丁酸能力最强的一个菌株。出发菌株E. coli K12 (R1)发酵液中γ-氨基丁酸浓度为0.05 g/L，相对较低。基因敲除菌E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE (R2)的发酵液中γ-氨基丁酸的含量为0.21 g/L。相对于原始菌株，提高了4.2倍。该结果表明，基因敲除之后代谢流朝着有利于γ-氨基丁酸的方向生成。在基因敲除菌株的基础上，构建了2个重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB (R3)和E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1 (R4)。从图 4可知，重组菌株E. coli K12 ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的发酵液中γ-氨基丁酸的含量为4.2 g/L (R4)，低于重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB (R3)，可能的原因是虽然2个基因SNO1和SNZ1的表达能够提高辅酶因子磷酸吡哆醛的含量，进而提高L-谷氨酸脱羧酶GadB的活性，但却消耗了大量的能量，从而使菌体的代谢负担加重，最终导致γ-氨基丁酸的生产能力下降。

2.5 菌株Escherichia coli K12ΔgabTΔgabP ΔpuuE/pTrc99a-gadB的发酵特性

菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB在含5 g/L底物L-谷氨酸钠的发酵培养基中的发酵特性如图 5A所示。由图 5可以看出，该菌株的OD₆₀₀在初始的6 h内达到4.0，这时调整发酵液的pH至4.2，随着培养时间的增加，菌体的光密度值有微量的增长。底物L-谷氨酸钠在18 h内就消耗殆尽，相应的发酵液中γ-氨基丁酸的含量快速积累，也是在18 h达到了峰值，为2.6 g/L，之后略有下降。可能的原因是发酵培养基中菌体所需的营养物质不多，且18 h底物已消耗完全。在γ-氨基丁酸合成之后，后续的菌体可能部分利用了γ-氨基丁酸作为一种能源物质，以供菌体后续的生长。由图 5B可以看出，10 g/L的底物L-谷氨酸钠在24 h时基本耗尽，γ-氨基丁酸含量在6–24 h内有显著的提高，峰值达到了4.6 g/L，之后的12 h内，其含量变化较小。由图 5C可知，OD₆₀₀在开始之后的12 h已经达到最大值，之后变化平稳。底物L-谷氨酸钠在6–18 h快速消耗，之后保持平稳，最终底物并没有完全被菌体消耗。产物γ-氨基丁酸的浓度在30 h时达到最大值，为8.4 g/L。由图 5D可知，30 g/L的底物L-谷氨酸钠在培养基中并没有消耗完全。在摇瓶发酵过程中，菌体的光密度值OD₆₀₀也比较低，说明由于底物浓度增大，菌体的代谢受到了一定的影响，进而影响到菌体的光密度值。产物γ-氨基丁酸的最高浓度为10.6 g/L。由图 5E可知，随着底物L-谷氨酸钠浓度的进一步增大，菌体的光密度值OD₆₀₀进一步减小，且发酵液中还残留较高浓度的L-谷氨酸钠。产物γ-氨基丁酸的产量在36 h达到最大值，之后变化平稳。

2.6 菌株Escherichia coli K12ΔgabTΔgabP ΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的发酵特性

从重组菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/ pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1的蛋白电泳图可以看出，L-谷氨酸脱羧酶基因gadB和磷酸吡哆醛合酶基因SNO1和SNZ1均得到了表达。每隔6 h对该菌株发酵液中的光密度值OD₆₀₀以及γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠的含量进行测定，结果如图 6所示。由图 6A可知，5 g/L的底物L-谷氨酸钠在发酵24 h就被基本耗尽，菌株的OD₆₀₀值在发酵24 h达到最高值，此时产物γ-氨基丁酸的浓度达到2.0 g/L。由图 6B可以看出，10 g/L的底物L-谷氨酸钠在发酵24 h后被完全耗尽，此时γ-氨基丁酸的产量达到4.1 g/L。从图 6C可以看出，20 g/L的底物L-谷氨酸钠在发酵前20 h内逐渐被消耗，之后变化较小，而产物γ-氨基丁酸的产量达到了6.8 g/L。

2.7 菌株Escherichia coli K12ΔgabTΔgabP ΔpuuE/pTrc99a-gadB在1 L摇瓶体系中的发酵特性

菌株E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB在含有20 g/L底物L-谷氨酸钠的1 L发酵培养基(300 mL/1 000 mL)中进行扩大培养，每隔6 h对发酵液的光密度值OD₆₀₀、L-谷氨酸钠浓度和γ-氨基丁酸的浓度进行测定，结果如图 7所示。从图 7可以看出，菌体的光密度值OD₆₀₀在初始的6 h增长较快，在第6小时达到最大值3.9。随着培养时间的增加，菌体的光密度值基本保持稳定。底物L-谷氨酸钠的浓度在培养的前24 h迅速下降，在第36小时基本耗尽。发酵液中γ-氨基丁酸的含量在培养的第24小时达到了峰值，为9.4 g/L。之后，随着培养时间的增加，γ-氨基丁酸的含量略有下降。

3 讨论与结论

本研究通过构建重组大肠杆菌来提高其合成γ-氨基丁酸的能力。将编码L-谷氨酸脱羧酶的基因gadB和磷酸吡哆醛合酶的基因SNO1和SNZ1引入大肠杆菌，得到重组菌E. coli K12ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB和E. coli K12ΔgabTΔgabP ΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1。前者发酵生产γ-氨基丁酸的最高含量为9.4 g/L。与原始菌(0.429 g/L)相比，提高了21.9倍。当SNO1和SNZ1同时引入时，由于能量的过度消耗，重组菌合成γ-氨基丁酸的能力略有下降。

鉴于γ-氨基丁酸具有重要的生理功能，许多研究组也开展了相关研究工作。将来自植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因引入清酒乳杆菌后，重组菌合成γ-氨基丁酸的能力提高了1.35倍，产量最高达265.3 mmol/L^[28]。将来自水稻的谷氨酸脱羧酶基因引入长双歧杆菌，重组菌在含30 g/L L-谷氨酸钠的培养基中发酵生产了0.1 g/L的γ-氨基丁酸^[29]。当大肠杆菌XL1的谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌XB中表达时，重组菌发酵生产了5.09 g/L的γ-氨基丁酸^[30]。当大肠杆菌Xl-1的谷氨酸脱羧酶B和C的基因同时在大肠杆菌XBT中表达时，重组菌发酵生产γ-氨基丁酸的产量为5.46 g/L^[31]。将谷氨酸脱羧酶A和C的基因同时引入大肠杆菌，重组菌发酵生产了5.65 g/L的γ-氨基丁酸^[32]。与这些研究相比，本研究构建的重组菌在1 L摇瓶中产生了9.4 g/L γ-氨基丁酸。该研究结果为γ-氨基丁酸的产业化生产和应用奠定了良好基础。