2024, Vol. 64中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 龚晋祥, 张仟禧, 杨子银, 王文清, 冯康, 张志榜, 杨涛涛, 李凯, 孙子龙, 张晓燕, 李鹏成. 2024
- GONG Jinxiang, ZHANG Qianxi, YANG Ziyin, WANG Wenqing, FENG Kang, ZHANG Zhibang, YANG Taotao, LI Kai, SUN Zilong, ZHANG Xiaoyan, LI Pengcheng.
- 猪流行性腹泻病毒劫持DNA损伤通路操纵细胞周期促进自身复制
- PEDV hijacks DNA damage pathways and manipulates the cell cycle to promote self-replication
- 微生物学报, 64(12): 4850-4858
- Acta Microbiologica Sinica, 64(12): 4850-4858
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文章历史
- 收稿日期：2024-07-12
- 网络出版日期：2024-09-03
引用本文 |
2. 山西农业大学 动物医学学院, 山西 晋中 030801
2. College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi, China
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种急性高度接触性的肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水为特征。PEDV为冠状病毒科单股正链RNA病毒，主要在小肠(十二指肠、空肠和回肠)的绒毛肠细胞中感染和复制，且传播迅速。各种年龄和不同品种的猪群对PEDV都有易感性，但不同年龄易感猪群的致死率不同，其中以哺乳仔猪的致死率最高；由PED引起的仔猪腹泻已经成为困扰养猪业发展的重要传染病[1-3]。
DNA损伤应答(DNA damage response, DDR)是细胞内一种非常保守的信号转导通路，对维持基因组完整性、稳定性和细胞存活至关重要[4]。DDR信号通路主要是通过2种关键的蛋白激酶启动，分别是共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated, ATM)、共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关蛋白(ataxia telangiectasia and rad3-related protein, ATR)[5-7]。ATM和ATR可共同磷酸化数百种蛋白，以响应DNA损伤调节基因组稳定性[8]。ATM和ATR可分别通过激活下游检查点激酶Chk2和Chk1介导细胞周期调控。研究表明，多种病毒可引发宿主DDR，病毒可能通过操纵相关的DNA损伤通路激酶和细胞周期的策略，以创造有利的细胞环境进行复制。以往研究均集中于DNA病毒，例如：猿猴病毒40型(simian vacuolating virus 40, SV40)、单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1, HSV-1)、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)和疱疹病毒IV型(Epstein-Barr virus, EBV)[9-12]，在感染期间均会激活ATM和下游信号传导，同时ATM和其他修复蛋白会募集到病毒DNA复制位点。然而，研究发现RNA病毒同样可以劫持DDR通路促进自身复制，包括丙型肝炎病毒(hepatitis c virus, HCV)[13]、传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)[14]、新城疫病病毒(newcastle disease virus, NDV)[15]和新型冠状病毒(corona virus disease 2019, COVID-19)[16]。丙型肝炎病毒感染后激活ATM和Chk2，可促进丙型肝炎病毒复制[13]。ATR信号激活介导IBV对宿主细胞S期捕获，从而促进IBV的复制[14]。例如，COVID-19会对细胞DNA造成损害，并靶向DDR通路的特定成分[16]。
最新研究显示，PEDV可激活DDR信号通路促进其自身复制[17-18]，但具体的作用机制尚不明了。本研究首先通过实时彗星试验观察PEDV感染Vero细胞造成DNA损伤的情况；然后应用特异性抑制剂确证DDR通路是否参与PEDV的复制；最后经蛋白质免疫印迹和流式细胞术分别检测PEDV感染Vero细胞DDR通路中蛋白表达和细胞周期的变化，旨在研究DDR通路在PEDV复制中的作用机制，为进一步阐明PEDV感染复制机制及开发新的潜在抗病毒靶点提供重要依据。
1 材料与方法 1.1 材料非洲绿猴肾细胞Vero细胞、猪流行性腹泻病毒CV777和PEDV-N蛋白单克隆抗体均由本研究室制备并保存；DMEM培养基、青链霉素、0.25%胰酶及胎牛血清均购自Gibco公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记山羊抗小鼠IgG (H+L)和HRP标记山羊抗兔IgG (H+L)均购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司；KU55933、AZD6738、VE821抑制剂均购自Selleck公司；蛋白预染Marker [M5 SuperRange Prestained Protein Ladder (10−310 kDa)]购自北京聚合美生物科技有限公司；彗星法DNA损伤分析试剂盒(3孔载玻片)购自亚科因生物技术有限公司；p-ATR (NBP2-43564)、ATR (sc-515173)、ATM (NB100-104)、p-ATM (NB100-306)、γ-H2AX (NB100-384)均购自NOVUS公司；Chk1-296 (2349T)、Chk1-317 (2344T)、p-Chk2 (2661T)、p53 (2527T)、p-p53 (82530S)一抗均购自Cell Signaling Technology公司；GAPDH (PAB45851)一抗购自武汉贝茵莱生物有限公司；0.45 μm PVDF膜购自Cytiva公司。
1.2 细胞培养Vero细胞于含有10%的胎牛血清和1%双抗(青霉素、链霉素浓度均为100 U/mL)的DMEM细胞培养液中培养(37 ℃、5% CO2)。Vero细胞接种于6孔、24孔或96孔培养板，隔天更换培养基，细胞长成单层后使用。
1.3 病毒滴度的测定病毒样品做10倍比稀释，然后将每个稀释度的病毒接种96孔细胞板，每个梯度做6个重复孔。随后放入CO2培养箱中孵育1 h，弃去原液后补加200 µL的维持液(2%胎牛血清的DMEM培养基)，待细胞出现典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)后根据Reed and Mench法判定病毒滴度。
1.4 抑制剂细胞毒性试验用维持液将ATM抑制剂KU55933、ATR抑制剂AZD6738和ATR抑制剂VE821按不同浓度稀释。将细胞铺于96孔培养板中，在37 ℃、5% CO2下培养。待96孔板内细胞75%融合，弃去96孔板内培养液，按相应浓度梯度加入抑制剂200 μL/孔，每种抑制剂作3个重复孔，另设3个空白对照(只加200 μL维持液)以及加入DMSO浓度为Mock组，每种梯度作3个重复。放入37 ℃、5% CO2培养箱再培养36 h。弃去96孔板内培养液，换维持液100 μL/孔，并向每孔加入10 μL CCK-8试剂，在37 ℃、5% CO2下孵育2 h，酶标仪读取OD450值。
1.5 抑制剂对病毒复制影响将细胞铺至24孔细胞培养板，待24孔板内细胞75%融合，弃去24孔板内培养液，加入相应浓度的抑制剂，同时设Mock组，单独PEDV组，每组3个重复，另设6个空白对照。预作用2 h后向抑制剂组、Mock组、PEDV alone组每孔加入等量病毒液(MOI=0.5)，空白组加入维持液，60 h后冻融3次，收获病毒液。按照1.3方法测病毒滴度。
1.6 彗星试验检测PEDV对细胞DNA损伤程度PEDV感染Vero细胞后分别于4、8、12、24、36、48、60、72 h用预冷的PBS洗2遍，收集各组细胞，并单独设置不接毒空白组和4 μL博来霉素阳性对照组，每组收集1.0×104个细胞悬液。将溶解的低熔点琼脂液加到CometSlide载玻片上完全覆盖，以创建基底层，4 ℃冷却15 min。取细胞样品与琼脂糖以1:10的比例混合，再取75 μL混合液转移到CometSlide基底层的上面完全覆盖，自然冷却后4 ℃裂解过夜，用预冷的碱性解旋溶液解旋30 min，将其水平放入水平电泳槽中。使用预冷碱性电泳缓冲液电泳20 V、20 min，使DNA解链。电泳后，将CometSlide水平转移到装有预冷的0.4 mmol的Tris-HCl (pH 7.5)缓冲液(约25 mL/CometSlide)中，4 ℃中和3次，每次10 min。弃去Tris-HCl缓冲液，加入50 μL 1×PI染料，室温避光染色10 min后使用荧光显微镜观察CometSlide并拍取照片，之后使用彗星分析软件分析。
1.7 Western blotting检测蛋白表达水平Vero细胞在6孔细胞板培养至融合，用PEDV感染Vero细胞0、1、6、12、24、36、48、60 h，之后细胞用PBS清洗3次，每孔加入150 μL蛋白裂解液(提前加入PMSF)，冰上作用30 min充分裂解细胞。将细胞样品刮下并收集到1.5 mL离心管中，12 000×g离心10 min后吸取上清液，使用BCA法测定蛋白浓度，调整上样量。使用SDS聚丙烯凝胶进行电泳，用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入不同稀释浓度抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入对应二抗孵育1 h，再次洗膜，用化学发光液进行显影，拍照保存。
1.8 流式细胞术检测PEDV感染Vero细胞周期的变化PEDV感染Vero细胞(MOI=0.5) 48 h后，用预冷的PBS洗2遍，用胰酶消化细胞，小心收集细胞悬液，1 000×g离心3 min沉淀细胞；小心吸除上清，加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移到1.5 mL离心管内；再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50 μL的PBS，以避免吸走细胞；轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团；然后将细胞悬液缓慢加入装有1 mL冰浴预冷70%乙醇的EP管中，轻轻吹打混匀，4 ℃固定30 min，BD FACScanto Ⅱ流式细胞仪[碧迪医疗器械(上海)有限公司]检测分析。
1.9 统计分析OpenComet软件分析彗星试验，比较DNA尾距百分比(tail DNA %)。试验数据应用GraphPad Prism 9.0进行生物学统计分析。
2 结果与分析 2.1 PEDV病毒复制依赖于ATM途径为了证实DDR通路是否参与PEDV复制，本研究选择3种DDR通路顶端激酶抑制剂研究其对PEDV复制的影响。研究发现，ATM抑制剂KU55933可极显著抑制PEDV的复制(P < 0.001)，PEDV病毒滴度从(5.50±0.25) log10 TCID50/mL下降到(3.15±0.15) log10 TCID50/mL，下降约2个滴度，而ATR抑制剂AZD6738和VE821对PEDV的复制则无显著影响(图 1)。
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| 图 1 DDR抑制剂对PEDV复制的影响 Figure 1 Effects of DDR inhibitors on PEDV replication. Mock: DMSO 100 μmol/L; KU55933: ATM kinase inhibitor 20 μmol/L; AZD6738: ATR kinase inhibitor 100 μmol/L; VE821: ATR kinase inhibitor 16 μmol/L. ns: No significance; ***: P < 0.001. |
2.2 PEDV感染显著引起Vero细胞DNA损伤
本研究应用彗星试验证实了PEDV感染可以显著引起Vero细胞DNA损伤。正常细胞的细胞核，未观察到彗星拖尾(图 2A)；PEDV感染48 h后Vero细胞核的形态为典型的DNA损伤细胞产生的彗星拖尾(图 2B)。阳性对照博来霉素极显著造成细胞DNA损伤，DNA尾距占比增加83.90% (图 2C)。PEDV实时感染Vero细胞发现(图 2C)，PEDV感染12 h后DNA尾距占比增加16.05% (P < 0.000 1)，并且随着感染时间的增加而增加，感染60 h Tail DNA占比增加达到了34.08% (P < 0.000 1)，72 h可能由于细胞破裂造成Tail DNA下降。
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| 图 2 PEDV感染Vero细胞彗星试验 Figure 2 PEDV infected Vero cells comet assay. A: Comet with no DNA damage. B: DNA damage comet. C: DNA damage tail distance percentage. ns: No significance; ****: P < 0.000 1. |
2.3 PEDV感染对DDR通路中蛋白分子表达的影响
如图 3所示，感染PEDV后DNA损伤标志物γ-H2AX表达量在36 h之前并未表现出明显差异，36 h之后表达量开始增加，且维持在较高水平。ATM感染PEDV后表达量随时间逐渐降低；p-ATM感染PEDV 36 h开始有表达，48 h表达量最高，60 h表达量降低；Chk2感染PEDV后1 h表达量下降，然后一直保持不变，到60 h表达量继续降低；p-Chk2感染PEDV 24 h后激活到36 h表达量最高，然后降低。ATR感染PEDV 48 h后表达量开始降低；p-ATR感染PEDV 1 h后表达增加，之后不断激活上升；Chk1感染PEDV 24 h表达量开始增加直到60 h；Chk1-296感染PEDV 1 h和6 h表达降低，12 h之后又降低，36 h之后表达量逐渐增加；Chk1-317感染PEDV 24 h后激活36 h表达量最高，然后降低。
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| 图 3 PEDV感染Vero细胞DNA损伤相关蛋白表达 Figure 3 Expression of DNA damage-related proteins in PEDV-infected Vero cells. |
2.4 PEDV影响细胞周期停滞在S期
如图 4所示，48 h时PEDV感染引起G1期细胞百分比的极显著降低(P < 0.000 1)，S期细胞百分比极显著升高(P < 0.001)，G2期细胞占比差异不显著，表明PEDV感染导致细胞周期停滞在S期。细胞周期检查点调控蛋白表达变化发现(图 5)：p53于PEDV感染Vero细胞12 h后表达开始逐渐减少，磷酸化p53 (Ser15)的表达逐渐增加；CDK1随时间表达量变化并不是很明显，仅60 h有所下降；而Cyclin B1在PEDV感染1 h后表达显著减少，直到36 h才有所升高，48 h和60 h表达极显著增多。
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| 图 4 PEDV感染Vero细胞流式细胞检测 Figure 4 Flow cytometry of PEDV infected Vero cells. A: Vero cells were infected with PEDV for 48 h, and cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. B: Statistics of cell cycle results in different periods. ns: No significance; ***: P < 0.001; ****: P < 0.000 1. |
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| 图 5 PEDV感染Vero细胞周期相关蛋白表达变化 Figure 5 Expression of cell cycle-related proteins in PEDV-infected Vero cells. |
3 讨论与结论
DNA病毒基因组在复制过程中往往需要利用细胞DNA复制系统，因此与细胞内的DNA损伤反应(DDR)信号网络发生复杂广泛的相互作用，从而创造出有利于病毒复制的细胞内环境[19-20]。然而，RNA病毒除了少数逆转录病毒，大部分RNA病毒为胞质复制，很少与DNA损伤联系起来。越来越多的最新报道显示，RNA病毒也具有诱导DNA损伤的特质，比如猪繁殖与呼吸综合征病毒[21]、冠状病毒病[16]和人肠道病毒A71[22]，说明RNA病毒也具有诱导DNA损伤的特质。
在真核生物中，组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成具有大约150 bp DNA的核小体。随着DNA损伤，H2AX (一种H2A变体)第139位的丝氨酸被磷酸化，H2AX变成p-H2AX-S139 (γ-H2AX)，γ-H2AX通常作为关键的DNA损伤标志物，介导DSB位点信号转导蛋白的后续积累[23-24]。PEDV在感染后期对γ-H2AX的表达上调，表明PEDV感染导致DNA损伤的激活。ATM、ATR和DNA-PK是参与γ-H2AX激活的3种主要激酶，DNA-PK和ATM主要参与DNA双链断裂，而ATR主要响应DNA单链断裂[25]。本研究发现，ATM和ATR作为DNA损伤的顶端激酶均在PEDV复制后期表达下降，而p-ATM和p-ATR在后期表达量上升，表明PEDV感染激活了DDR途径的两条通路。为了响应受损的DNA或停滞的复制，ATR磷酸化Ser317和Ser345位点Chk1，这种磷酸化被认为可以提高Chk1的催化活性[26-27]，随后是Ser296的自磷酸化。Ser296磷酸化诱导Chk1与14-3-3γ结合，从而促进Cdc25A降解来控制细胞周期停滞[28]。Chk1被上游激酶ATR磷酸化而被激活，Chk1随着时间增加表达量增高，而下游的Chk1-Ser317和Chk1-Ser296的激活又说明DNA修复和细胞周期检查点的启动。Chk2会被ATM磷酸化和激活，诱导DNA损伤后的细胞凋亡[29]。Chk2在后期表达量下降，p-Chk2后期的增加，预示着细胞凋亡的出现。聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)是DNA修复酶，它是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶的切割底物，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用[30]。我们发现，PARP抑制剂AZD2281会降低PEDV的复制(结果未显示)，可能与PARP参与的细胞凋亡有关[18]。本研究中ATR抑制剂不影响PEDV复制，那么ATR通路激活所发挥的具体作用，有待进一步研究。
病毒严格寄生于宿主细胞，已经进化出各种策略来破坏宿主细胞周期，以确保自身的正常复制[31]。p53作为公认的抑癌基因，可被DNA损伤、癌基因和细胞应激激活，可以调节多种细胞过程，包括DNA修复、细胞周期、凋亡、氧化还原稳态、代谢和线粒体功能[32-33]。传染性支气管炎病毒(IBV)感染通过以p53非依赖性方式调节各种细胞周期蛋白和低磷酸化RB的积累，在S期和G2/M期停滞细胞周期[34]。PEDV N蛋白与p53相互作用以激活p53-DREAM通路，并随后诱导S期停滞[35]。ATM、ATR和DNA-PK会诱导p53在Ser15和Ser20位点的磷酸化，可导致细胞周期停滞和DNA修复或细胞凋亡[36-37]。Chk1和Chk2也可以磷酸化p53，影响细胞周期进程和细胞凋亡。本研究中p53 (Ser15)在PEDV感染后期被激活，说明细胞进入细胞周期阻滞和凋亡。周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK1)可以与Cyclin A或B结合来促进细胞周期S/G2或G2/M的转换，在调控细胞周期进程中占重要地位[38]。通常细胞周期阻滞就是对检查点激酶的破坏，从而导致不能正常复制，Cyclin B1作为调节G2/M期检查点激酶，PEDV感染导致CDK1的下调和Cyclin B1的上调表明S期检查点的破坏，导致细胞阻滞在S期。
综上所述，本研究证实PEDV感染Vero细胞后显著引起DNA损伤，并激活ATM-Chk2信号通路，通过p53的活化和极显著增加Cyclin B1的表达来操纵细胞周期促进病毒复制。该结果为进一步阐明PEDV感染复制机制，以及开发新的潜在抗病毒靶点提供了重要依据。
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