2024, Vol. 64中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 席飞, 汤静, 吕凤霞, 孙佩馨, 张国华, 肖红梅. 2024
- XI Fei, TANG Jing, LÜ Fengxia, SUN Peixin, ZHANG Guohua, XIAO Hongmei.
- 青皮核桃采后病害生防菌贝莱斯芽胞杆菌XRD006全基因组分析及防治效果研究
- Bacillus velezensis XRD006: genomic characteristics and biocontrol effects on diseases of postharvest green walnuts
- 微生物学报, 64(1): 303-322
- Acta Microbiologica Sinica, 64(1): 303-322
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文章历史
- 收稿日期：2023-06-21
- 网络出版日期：2023-08-21
引用本文 |
2. 山东五康轩现代农林发展有限公司, 山东 邹城 273519
2. Shandong Wukangxuan Modern Agriculture and Forestry Development Co., Ltd., Zoucheng 273519, Shandong, China
核桃(Juglans regia L.)是胡桃科胡桃属植物，是中国重要的经济林种。核桃含有丰富的不饱和脂肪酸、维生素、蛋白质、矿物质和多酚等营养物质，具备抗炎、抗氧化、延缓记忆衰退的功能[1-2]。青皮核桃因其清脆香甜的口感成为核桃产业新的经济增长点，但青皮核桃果实采后病害导致的腐烂霉变严重影响果实贮藏期和食用安全，制约了青皮核桃产业的快速发展。传统果实采后病害的防治仍以化学杀菌剂为主，但长期化学药剂的施用会导致环境污染、农药残留及病原菌耐药性等问题[3]。随着人们健康环保意识的提高和我国农业绿色发展规划的实施，使用绿色安全的生物农药防治核桃等采后病害成为极具潜力的防控手段。
芽胞杆菌类生防菌是目前生物农药的研究热点和产业化开发的主要来源。其中属于解淀粉芽胞杆菌群(Bacillus amyloliquefaciens group)的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)来源广泛，已分别从土壤[4]、植物内生环境[5]、天然食物[6]等各类环境中筛选出对扩展青霉(Penicillium expansum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和链格孢菌(Alternaria alternata)具有广谱抑菌活性的菌株。目前，多种组学技术被应用于探究生防菌的抑菌机制，全基因组技术可以准确预测生防菌的抗菌次级代谢产物[7]、比较基因组技术可以分析各生防菌的特点[8]。贝莱斯芽胞杆菌具备产生丰原素(fengycins)、伊枯草菌素(iturins)、表面活性肽(surfactins)等脂肽抑制病原菌生长与侵染的能力，且脂肽作用机制多样。研究表明，fengycins可以侵入禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)细胞膜内，与病原菌DNA结合，造成DNA碎片化，丧失功能[9]。Iturins则可以破坏尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)细胞壁、细胞膜，引起细胞内容物泄漏，造成细胞死亡[10]。
本研究以一株来自海洋生境的贝莱斯芽胞杆菌XRD006为主要研究对象，探究其对青皮核桃采后病原菌的抑制能力，并通过活体抑菌试验及贮藏试验探究XRD006对青皮核桃采后病原菌的拮抗能力及其对青皮核桃贮藏品质的影响；利用全基因组测序、比较基因组学分析，挖掘XRD006潜在的抗病基因和抗菌产物，分析其可能的抗菌机制；使用层析、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)和质谱手段分离鉴定XRD006的次级代谢产物。这些研究充分表明菌株XRD006是一株能显著抑制青皮核桃采后病害的生防菌株。
1 材料与方法 1.1 试供材料青皮核桃，品种“辽宁一号”，2022年8月14日采摘自山东省邹城市五康轩郭里庄园，成熟度为八九成。采样后以汽车运输形式运送至实验室，选取无病虫侵染、无机械损伤、大小一致和色泽相同的青皮核桃为试材。
贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis) XRD006，前期于黄海海泥中分离获得，溶菌肉汤(lysogeny broth, LB)培养基、细菌常规培养温度37 ℃培养。保藏于南京农业大学食品科技学院农产品贮藏与加工试验室。
青皮核桃病原菌隐秘刺盘孢(Colletotrichum aenigma) HT11、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense) HT12、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea) JNHT01、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi) JNHT04，前期从山东省采后青皮核桃中分离获得，马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基、真菌常规培养温度28 ℃培养。保藏于南京农业大学食品科技学院农产品贮藏与加工试验室。
1.2 XRD006对核桃采后病原菌拮抗能力测定用灭菌打孔器在病原菌平板边缘取直径6 mm的菌碟接种至新的PDA培养基平板中央，随后立即在其四边(距中央菌碟2.50 cm)，接种2 μL 1×108菌落形成单位(colony-forming units, CFU)/mL的XRD006菌液，以接种LB液体培养基的PDA平板为对照，28 ℃培养6 d。测量各组菌落直径，计算抑菌率(公式1)，每个试验设置3个重复。
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公式(1) |
选择青皮核桃采后主要病原菌暹罗炭疽菌(C. siamense) HT12作为以下抑菌试验指示菌[11]。
青皮核桃果实经75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，室温中晾干备用。用无菌打孔器在青皮核桃赤道处制造直径为0.60 cm圆形伤口，在伤口中注入20 μL发酵上清液，接无菌水作为对照；2 h后伤口中再接入20 μL 1×105 spores/mL HT12孢子悬浮液，室温晾干后装于塑料果盒中，25 ℃、相对湿度85%恒温恒湿放置。每组处理设置3个平行，每个平行8个果实，在第5天和第7天时采用十字交叉法测量病斑直径。
1.4 生防菌XRD006发酵上清液对青皮核桃贮藏品质的影响青皮核桃随机分为2组，每组约540个果实，设为3个平行。处理组(treatment, T)为发酵上清液处理，对照组(control check, CK)采用无菌水处理。将果实在2种处理液中浸泡1 min (果实与处理液的料液比为3:7)，自然风干后套上塑料袋放入塑料筐中，置于4 ℃、相对湿度90%−95%冷库中贮藏56 d，每日观察，每隔14 d取样测定相关指标。
1.4.1 果实失重率称量果实样品贮藏前与贮藏后的质量，根据公式(2)计算其失重率。
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公式(2) |
使用色差仪在青皮核桃赤道处选取固定3个点测量L*、a*、b*值，计算核桃表皮色差变化。
1.4.3 核仁粗脂肪含量测定参照国标GB/T 14488.1—2008测定。取10 g新鲜核仁样品碾碎，于恒温鼓风干燥箱中105 ℃杀青2 h，随后85 ℃烘干至恒重，称量纸包装起来称其质量为F1。将包装好的核仁放置于索氏提取器中，在40−60 ℃水浴提取8 h，用恒温鼓风干燥箱去除残留的石油醚，称其质量为F2，计算粗脂肪含量(公式3)。
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公式(3) |
参考曹建康等方法略作修改[12]。称取2 g核仁，加入5 mL蒸馏水研磨成匀浆，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，吸取1 mL提取液与5 mL考马斯亮蓝G-250溶液充分混合，以蒸馏水为参比，放置2 min后测量OD595，计算可溶性蛋白含量(公式4)。
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公式(4) |
式中M1：从标准曲线查得的蛋白质的质量，μg；V1：样品提取液总体积，mL；V2：测定时所取样品提取液体积，mL；M2：样品质量，g。
1.4.5 核仁水分含量测定采用差重法进行测定，先称出核仁首重M1，然后将核仁放置到恒温鼓风干燥箱中，105 ℃烘干至恒重(约6 h)，记为M2，计算含水率(公式5)。
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公式(5) |
称量0.50 g核仁混合9 mL 70%乙醇，70 ℃水浴提取20 min。取出后用流动水快速冷却，8 000 r/min离心10 min。取0.50 mL上清液和2.50 mL稀释10倍的福林酚在黑暗中静置反应5 min。加入2 mL 7.50% Na2CO3，5 mL蒸馏水反应1 h，于760 nm处测定吸光值。总酚含量由没食子酸标准曲线计算得出(公式6)。
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公式(6) |
式中C：从标准曲线查得的没食子酸浓度，mg/g；V：提取液总体积，mL；n：稀释倍数；m：样品质量，g。
1.4.7 青皮过氧化物酶(peroxidase, POD)酶活测定参照曹建康等方法略作修改[12]。称取青皮组织1 g置于预冷的研钵中，加入5 mL pH 7.80、50 mmol/L磷酸钠缓冲液：1% 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP)和1.33 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，冰浴研磨，将匀浆于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液即为酶提取液。取0.50 mL酶提取液，分别混合3 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液及0.20 mL 0.50 mol/L H2O2溶液启动反应。以蒸馏水为参比调零，在反应15 s时开始记录反应体系在470 nm处吸光值，记为初始值，每隔1 min记录一次连续测定获取6个点的数据，计算过氧化物酶(公式7)。
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公式(7) |
式中V1：样品提取液总体积，mL；∆OD470：每分钟吸光度变化值；V2：测定时所取样品提取液体积，mL；m：样品质量，g。
1.4.8 青皮多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)酶活测定参照曹建康等方法略作修改[12]，酶提取液同POD测定。取0.1 mL酶提取液，分别混合4 mL 50 mmol/L pH 5.50乙酸-乙酸钠缓冲液和1 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液。以蒸馏水为参比调零，在反应15 s时开始记录反应体系在420 nm处吸光值，记为初始值，然后每隔1 min记录一次连续测定6个点的数据，计算方法同1.4.7。
1.4.9 菌落总数测定取青皮核桃约250 g加入500 mL无菌生理盐水漩涡振荡30 min制成样品液，梯度稀释10、102、103倍，分别取1 mL 102、103样液与20 mL LB培养基混合倒平板。28 ℃，培养3 d计数，结果以lg (CFU/g)表示。
1.4.10 霉菌、酵母数测定使用平板计数琼脂(plate count agar, PCA)培养基，其余处理方法同1.4.9。
1.5 XRD006全基因组测序与分析 1.5.1 XRD006全基因组测序挑取XRD006单菌落转接至LB液体培养基37 ℃培养16 h，5 000 r/min离心5 min取沉淀。用1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗沉淀，相同离心条件获得沉淀菌体，此操作重复2次。液氮速冻菌体−80 ℃保存，送南京擎科生物科技有限公司进行全基因组测序。
1.5.2 比较基因组分析美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)下载贝莱斯芽胞杆菌标准株FZB42和SQR9的序列信息与菌株XRD006进行比较基因组分析；运用antiSMASH网站预测3株菌的次级代谢产物基因簇并比较分析差异；利用mauve软件对3株菌进行共线性分析；利用BPGA v1.3软件对3株菌进行核心基因组、泛基因组分析。
1.6 XRD006次级代谢产物分离鉴定与抑菌性能测定 1.6.1 粗提物制备取发酵3 d的发酵液，8 000 r/min离心15 min收集上清液，用6 mol/L的盐酸调节上清液pH为2，置于4 ℃酸沉过夜，10 000 r/min离心10 min收集沉淀物，加入100 mL色谱级甲醇溶解沉淀，NaOH调节pH至7，于20 ℃环境中磁力搅拌5 h抽提，10 000 r/min离心10 min获得次级代谢产物粗提物溶液，于40 ℃条件下减压旋蒸浓缩至10 mL。
1.6.2 HPLC分离将1.6.1中获得的粗提物经葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析过滤并冻干。用600 μL 50%乙腈溶解30 mg样品，12 000 r/min离心3 min，上清液过0.22 μm滤膜去除杂质，取20 μL手动上样，采用C18反相分析柱，流速1.20 mL/min，柱温25 ℃，检测波长214 nm，具体分析液相程序如表 1所示。
| t/min | Speed (mL/min) | Acetonitrile (%) | Water (%) |
| 0 | 1.2 | 0 | 100 |
| 2 | 1.2 | 0 | 100 |
| 47 | 1.2 | 90 | 10 |
| 48 | 1.2 | 95 | 5 |
| 55 | 1.2 | 95 | 5 |
| 56 | 0.01 | 95 | 5 |
1.6.3 质谱鉴定
取分析液相信号峰样品，采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。质谱条件为：上样量50 μL，采集范围200−2 000 m/z，毛细管电压35 V，毛细管温度275 ℃，喷雾电压4 500 V，脱溶剂气速800 L/h。
1.6.4 抑菌代谢产物制备样品处理方法同1.6.2。取600 μL样品手动上样，采用C18反相制备柱，流速15 mL/min，柱温25 ℃，检测波长214 nm，收集目标代谢产物流动相，并于1 MPa、−40 ℃条件下冻干获得样品纯品。分别稀释所有样品，浓度均为420 μg/mL，用于抑菌活性的测定。具体制备液相程序如表 2所示。
| t/min | Speed (mL/min) | Acetonitrile (%) | Water (%) |
| 0 | 5 | 20 | 80 |
| 1 | 5 | 20 | 80 |
| 2 | 15 | 20 | 80 |
| 7 | 15 | 35 | 65 |
| 12 | 15 | 45 | 55 |
| 17 | 15 | 50 | 50 |
| 27 | 15 | 55 | 45 |
| 42 | 15 | 60 | 40 |
| 62 | 15 | 65 | 35 |
| 66 | 15 | 95 | 5 |
| 72 | 15 | 95 | 5 |
| 73 | 0.1 | 95 | 5 |
1.6.5 抑菌活性测定
取Φ6 mm的暹罗炭疽菌(C. siamense) HT12菌碟接种在PDA培养基平板中央。在距离菌碟2 cm处对称放置2个牛津杯，一个加入200 μL制备样品溶液，一个加入200 μL 50%乙腈作为对照。28 ℃培养，每日观察菌落生长情况，记录抑菌圈大小。每个处理设置3个平行，试验重复2次。
1.7 数据统计及分析除特殊说明外，所有试验处理均设3个平行；试验数据统计分析采用SPSS软件进行方差分析和最小显著性差异法(least significant difference, LSD)多重比较(P < 0.05)，采用Excel和Origin2018软件进行作图。
2 结果与分析 2.1 XRD006抑制核桃采后病原菌能力分析抑菌结果如图 1所示，XRD006对青皮核桃采后病害隐秘刺盘孢(C. aenigma) HT11、暹罗炭疽菌(C. siamense) HT12、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea) JNHT01和藤仓镰刀菌(F. fujikuroi) JNHT04皆具有抑制效果，对峙6 d时抑菌率分别为49.22%±0.03%、50.61%±0.01%、53.83%± 0.05%和58.71%±0.05%。这说明XRD006具备成为青皮核桃采后病害生防菌的潜力。
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| 图 1 XRD006对青皮核桃采后病原菌的拮抗作用(6 d) Figure 1 The antagonistic activity of XRD006 against postharvest pathogens of green walnut (6 d). A: Colletotrichum aenigma HT11. B: Colletotrichum siamense HT12. C: Botryosphaeria dothidea JNHT01. D: Fusarium fujikuroi JNHT04. |
2.2 生防菌XRD006发酵上清液对青皮核桃炭疽病的影响
抑菌结果如图 2所示，在贮藏5 d时，处理组个别果实开始发病，病斑直径为(2.01±0.34) cm，对照组没有出现发病现象。贮藏7 d时，对照组果实全部发病，而处理组仅部分果实发病，对照组病斑直径为(4.53±0.26) cm显著大于处理组的(1.81±0.46) cm (表 3，P < 0.05)。试验表明，XRD006发酵上清液对青皮核桃炭疽病有较好的防治效果。
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| 图 2 XRD006发酵上清液处理对炭疽病防治效果的影响 Figure 2 Effect of XRD006 fermentation supernatant treatment on the prevention and treatment effect of anthracnose. |
| Storage time (d) |
Disease diameter (cm) | |
| CK | T | |
| 5 | 2.01±0.34a | 1.62±0.19b |
| 7 | 4.53±0.26a | 1.81±0.46b |
| Different lowercase letters in the table indicate significant differences between different groups (P < 0.05). | ||
2.3 生防菌XRD006发酵上清液对青皮核桃贮藏品质的影响 2.3.1 整果失重率
如图 3所示，随着时间延长，2组果实的失重率都呈上升趋势，在贮藏第42天和56天两组出现显著性差异，处理组失重率显著低于对照组(P < 0.05)，贮藏时间越长，差异越大。说明发酵上清液处理可以显著降低青皮核桃的失重率。
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| 图 3 XRD006发酵上清液对青皮核桃失重率影响 Figure 3 Effect of XRD006 fermentation supernatant on the weight loss rate of green walnuts. Different lowercase letters in the table indicate significant differences between different groups (P < 0.05). |
2.3.2 核仁品质
如图 4A所示，处理组与对照组粗脂肪含量在贮藏期间均呈现下降趋势，处理组粗脂肪含量始终高于对照组，但两者之间没有显著差异(P > 0.05)；贮藏期间对照组和处理组可溶性蛋白含量均出现先增加后降低趋势(图 4B)，42 d时，处理组的青皮核桃核仁可溶性蛋白含量最高为5.82 μg/g，显著高于对照组的4.11 μg/g (P < 0.05)，这表明发酵液可以减缓核仁可溶性蛋白含量下降；水分含量试验(图 4C)显示，处理组与对照组水分含量均不断下降，两者之间差异不显著(P > 0.05)；总酚含量如图 4D所示，两组总酚含量变化趋势相同，28 d时，处理组总酚含量为22.98 mg/g，显著高于对照组的19.92 mg/g (P < 0.05)。以上试验说明，发酵上清液可以有效减少果实可溶性蛋白和总酚的消耗，保持果实的贮藏品质。
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| 图 4 XRD006发酵上清液对青皮核桃核仁品质的影响 Figure 4 Effect of XRD006 fermentation supernatant on walnut kernel quality. A: Crude fat content. B: Soluble protein content. C: Moisture content. D: Total phenols content. Different lowercase letters in the table indicate significant differences between different groups (P < 0.05). |
2.3.3 POD及PPO酶活
结果如图 5A所示，POD酶活随着贮藏时间的增加，总体呈现下降趋势，但是处理组POD酶活始终显著高于对照组(P < 0.05)。PPO酶活如图 5B所示呈现波动趋势，56 d时，处理组酶活4.29 U/(min·g)显著低于对照组的5.61 U/(min·g) (P < 0.05)。以上结果说明，发酵上清液可以显著影响POD及PPO的酶活。
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| 图 5 XRD006发酵上清液对青皮核桃POD和PPO酶活影响 Figure 5 Effect of XRD006 fermentation supernatant on POD and PPO enzyme activities of green walnut. A: POD. B: PPO. Different lowercase letters in the table indicate significant differences between different groups (P < 0.05). |
2.3.4 微生物
如图 6所示，随着贮藏时间的增加，处理组与对照组的菌落总数、霉菌、酵母数量均不断上升，但处理组微生物数量始终少于对照组，56 d时处理组菌落总数和霉菌、酵母数显著低于对照组(P < 0.05)，说明发酵上清液能有效抑制果实表明微生物的繁殖生长。
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| 图 6 XRD006发酵上清液对青皮核桃菌落总数和霉菌、酵母数的影响 Figure 6 Effect of XRD006 fermentation supernatant on the total number of colonies and the number of molds and yeasts. A: Total number of colonies. B: Mold/Yeast number. Different lowercase letters in the table indicate significant differences between different groups (P < 0.05). |
2.4 XRD006全基因组分析 2.4.1 全基因组分析
序列已上传NCBI (accession No: CP118911)。菌株XRD006基因组长4 371 975 bp，GC占比46.07%，含有4 362个蛋白质编码基因，27个rRNA和87个tRNA (图 7A)。Nr (non-redundant protein database)显示33.23%的基因注释为贝莱斯芽胞杆菌，29.46%的基因注释为芽胞杆菌属，证明XRD006为贝莱斯芽胞杆菌(图 7B)。CAZy数据库(carbohydrate-active enzymes database) (图 7C)注释到XRD006含有53个糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)、44个糖基转移酶(glycosyl transferases, GTs)、3个多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)、28个碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)、6个辅助氧化还原酶(auxiliary activities, AAs)和39个非催化的结合碳水化合物的功能域(carbohydrate-binding modules, CBMs)。进一步分析显示XRD006含有几种关键的糖苷水解酶(GHs)：内切-β-1, 4-葡聚糖酶(GH5)、麦芽糖-6-磷酸葡萄糖苷酶(GH4)、β-葡萄糖苷酶(GH1)、β-木糖苷酶(GH43)、内切-β-1, 4-半乳糖糖苷酶(GH53)，这些酶可以催化水解病原菌细胞壁成分多糖，说明XRD006能降解病原菌细胞壁，抑制病原菌生长。基因本体论(gene ontology, GO)富集显示催化活性(catalytic activity)富集到的基因最多有1 757个，其次为代谢过程(metabolic process) 1 477个基因，再次为结合类功能分类(binding) (图 7D)。GO注释分析发现菌株含有可以分解病原菌细胞壁主要成分几丁质、多糖等成分的水解酶基因：几丁质酶(GO: 0004568)、纤维素酶(GO: 0008810)和葡聚糖酶(GO: 0052861、GO: 0052862)[13-14]；以及与定殖促生相关的基因：群体感应(GO: 0009372)、生物膜形成(GO: 0032022、GO: 1900192)、亚精胺合成(GO: 0008792、GO: 0008783)，这说明XRD006可能具有抑菌、定殖能力[15-16]。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)数据库共注释到48个代谢通路，其中ABC转运蛋白(ABC transporters)注释到的基因最多127个，其次为氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)有121个基因，再次为双组分代谢(two-component system)注释到113个基因(图 7E)，分析显示在KEGG途径中存在一些与植物促生物质合成相关的基因，如参与吲哚-3-乙酸的合成途径的trpC (K01609)和参与植酸酶的生物合成的phy (K01083)，这说明XRD006可能具有促生能力。
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| 图 7 全基因组分析 Figure 7 Diagram of whole genome analysis. A: Circular genome map of strain XRD006. The circular distribution from outside to inside indicates genome size, positive chain gene, negative chain gene, repeat sequence, tRNA (blue) and rRNA (purple), GC content and GC-skew. B: Non-redundant (Nr) protein database of XRD006, FZB42 and SQR9. C: Carbohydrate enzyme activity (CAZy) of XRD006. D: Gene ontology (GO) annotation of XRD006. E: Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) annotation of XRD006. |
2.4.2 比较基因组学分析
菌株XRD006、FZB42和SQR9基因组特征比较见表 4。3株菌的共线性分析结果如图 8A所示，XRD006与FZB42、SQR9之间存在局部共线块排列顺序颠倒、翻转和缺失的现象，这可能是XRD006为适应海洋环境压力而发生的改变。同源性分析显示3株菌共有3 280个相同的核心基因，占XRD006总基因数78.67%，证明XRD006与FZB42和SQR9之间存在很高的相似性(图 8B)。泛基因组分析如图 8C所示，3株菌的核心基因组趋势明显比泛基因组趋势更平稳，这说明核心基因组更保守[17]。直系同源蛋白质组簇(clusters of orthologous groups of proteins, COGs)聚类显示最多有13.35%的核心基因与一般功能预测有关，值得注意的是还有9%的核心基因功能未知，这表明3株菌可能具有未知的抗菌机制(图 8D)。
| Features | XRD006 | FZB42 | SQR9 |
| Genome size (bp) | 4 371 975 | 3 918 589 | 4 117 023 |
| G+C ratio (%) | 46.07 | 46.4 | 46 |
| Protein-coding genes | 4 362 | 3 734 | 3 912 |
| rRNA | 27 | 29 | 21 |
| tRNA | 87 | 88 | 72 |
| Genomic islands | 16 | 12 | 11 |
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| 图 8 菌株XRD006、FZB42和SQR9比较基因组分析 Figure 8 Comparative genomic analysis among strain XRD006, FZB42 and SQR9. A: Collinearity analysis. B: Venn diagram of core genes, unique genes and accessory genes of strain XRD006, FZB42 and SQR9. C: Core-pan-genome plot of strain XRD006, FZB42 and SQR9. D: Comparison of the COG annotation of strain XRD006, FZB42 and SQR9. E: Comparison of the locations and products of the secondary metabolite gene clusters of XRD006, FZB42 and SQR9. |
通过antiSMASH预测XRD006的次级代谢产物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)。结果显示(图 8E)，XRD006含有14个BGCs，包括9种已知BGCs：表面活性肽(surfactin)、丰原素(fengycin)、嗜铁素(bacillibactin)、聚酮类(difficidin)、多烯类(bacillaene)、大环内酯(macrolactin)、杆菌溶素(bacilysin)、细菌素(plantazolicin)和丁酰苷菌素(butirosin A & B)。比对XRD006、FZB42和SQR9 BGCs的位置和产物显示，FZB42和SQR9之间除cluster 2不同外，其他BGCs均是直接的线性对应，但是XRD006与两者比对，BGCs更多的是异位对应，这与共线性分析吻合。有研究发现从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到的fengycin和surfactin对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)具有抑制作用[18]，这可能是XRD006对暹罗炭疽菌(C. siamense)的抑制机理之一。此外，surfactin与群体感应、生物膜形成和根定殖有关[19]，这表明XRD006可能也有成为植物促生菌的潜力。值得注意的是，相比SQR9、XRD006和FZB42含有plantazolicin的合成基因簇，有试验证明plantazolicin具有杀线虫能力[20]，这扩大了XRD006的应用前景和范围。
对XRD006、FZB42和SQR9的BGCs合成基因比对显示(图 9)，虽然三者plantazolicin的合成基因一致，但antiSMASH预测显示XRD006的plantazolicin与已知BGCs比对相似性为7%，这表明产物可能具备全新的结构。与XRD006和SQR9相比，在FZB42 bacillibactin基因簇中dhbA和dnbC是其他生物合成基因，但是在XRD006和SQR9中这两者是核心生物合成基因，说明XRD006和SQR9产生的bacillibactin可能具有更强的抑菌活性。Surfactin基因簇基因比对显示，相比FZB42和SQR9，XRD006在核心基因SrfAB和SrfAA之间多出了一个额外合成基因，这可能产生新结构的，具备更强抑菌活性的surfactin。
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| 图 9 菌株XRD006、FZB42和SQR9中次级代谢产物基因簇的比较 Figure 9 Comparison of secondary metabolite gene clusters of strain XRD006, FZB42 and SQR9. The red, pink, blue and gray represent core biosynthetic genes, additional biosynthetic genes, transport-related genes and other genes, respectively. |
2.5 XRD006次级代谢产物分离及鉴定 2.5.1 HPLC分离及质谱鉴定分析
结果如图 10所示，对分析液相可能的抗菌产物信号峰进行收集并通过质谱确定分子量，共收集到5个脂肽类次级代谢产物，查阅文献发现质荷比1 030.4 m/z的为C13-iturin，1 044.5 m/z的为C14-iturin，1 058.4 m/z的为C15-iturin，1 463.4 m/z的为C16-fengycin B，1 476.8 m/z的为C17-fengycin C[21-22]。
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| 图 10 HPLC与质谱图 Figure 10 HPLC and mass spectrometry. A: C13-iturin. B: C14-iturin. C: C15-iturin. D: C16-fengycin B. E: C17-fengycin C. |
2.5.2 代谢产物抑菌活性测定
制备液相制备得到C13-iturin、C14-iturin、C15-iturin、C16-fengycin B和C17-fengycin C的纯品，抑菌试验结果如图 11所示，C13-iturin、C15-iturin对暹罗炭疽菌(C. siamense) HT12抑菌活性较弱，抑菌率为3.71%±0.07%和4.21%±0.04%；C14-iturin抑菌活性较强，抑菌率为17.94%±0.1%；C16-fengycin B、C17-fengycin C抑菌率最强，分别为34.63%±0.09%和33.32%±0.04%。
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| 图 11 抑菌产物活性测定(4 d) Figure 11 Determination of activity of antifungal products (4 d). |
3 讨论
目前已有多种生防菌展现出了对青皮核桃采后病害的抑菌潜力。例如，利诺霉素链霉菌(Streptomyces lienomycini)可以有效抑制由黄单胞菌引起的核桃黑斑病，这主要是利诺霉素链霉菌产生的化合物1H-吡咯-2-羧酸和1H-吡咯-2-甲酰胺起作用[23]。核桃内生菌暹罗芽胞杆菌(B. siamensis) WB1通过产生脂肽、胞外水解酶和激活植物系统抗性抑制尖孢炭疽菌(C. acutatum)的生长与侵染，同时WB1产生铁载体和吲哚-3-乙酸，溶解无机磷酸盐促进植物的生长[24]。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) SDF-005处理胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides) TS-09R，造成TS-09R菌丝增大、畸变、扭曲和细胞壁的破裂[25]。虽然生防菌种类多样，但对青皮核桃采后病原菌具备抑制作用的贝莱斯芽胞杆菌报道较少，本文确定了海洋源菌株贝莱斯芽胞杆菌XRD006能有效抑制青皮核桃采后病害，这丰富了青皮核桃生防菌的微生物资源。
贮藏试验表明，发酵上清液处理显著降低了青皮核桃的失重，且处理组微生物含量显著低于对照组，这可能是因为发酵上清液抑制了微生物的生长，并因此减少了因病原菌侵染导致的果实腐烂失水。诱导抗性是生物防治技术抑制果蔬采后病害的机制之一[26]。POD在木质素合成的催化作用中起着关键作用，木质素可以形成交织的网络，使细胞壁变硬，从而提高抗病性[27]。本研究中，处理组的POD酶活显著高于对照组(P < 0.05)，说明发酵上清液可以提高果实的抗性。PPO是果蔬褐变中主要的酶类，酚类化合物在多酚氧化酶的催化下，极易氧化成醌并发生羟基化，生成羟基醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应形成黑褐色聚合物，发生褐变[28]。本研究发现，处理组PPO酶活显著低于对照组(P < 0.05)，表明发酵上清液处理可能可以抑制青皮核桃褐变。核仁粗脂肪含量、可溶性蛋白含量、水分含量、总酚含量在贮藏结束时，处理组与对照组差异并不显著，这表明发酵上清液处理在显著抑制病原菌侵染的情况下，并不会导致果实品质的劣变，说明XRD006具有良好的应用前景。
生防菌生境的差异会赋予菌株独特的性状与功能。XRD006与贝莱斯芽胞杆菌标准菌株(B. velezensis) FZB42和SQR9基因组特征比较显示，XRD006的环状染色体最长为4 371 975 bp，拥有最多蛋白编码基因4 362个，这可能是由于分离生境不同，XRD006分离自黄海海泥，FZB42分离自西班牙维河含盐水样，SQR9分离自中国植物根际土壤，XRD006在海洋高盐、高压和低温等不利环境下可能扩充新基因添加新功能以更好扩展生存空间和能力，XRD006可能因此具备更强的抗逆性。泛基因组分析则显示，XRD006拥有最多的特有基因547个，这共同表明XRD006可能具备特定表型或能力。以上说明XRD006是一株新的、独特的生防菌。
贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis)可以通过产抗菌次级代谢产物、胞外溶酶，诱导系统抗性等手段抑制病原菌生长及侵染。iturins可以有效抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的生长[29]。Surfactin[30]和fengycin[31]对胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)皆具备拮抗作用，前者同时能引发植物的诱导系统抗性，提升植物的抗病能力。Macrolactin被发现在防治由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病中起主要作用[32]。最新研究显示，bacilysin不仅对细菌病原菌具有拮抗作用，对大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)这种真菌病害也具备拮抗作用[33]。此外，试验证明贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis)产生的几丁质酶、蛋白酶和β-l, 3-葡聚糖酶可以抑制胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)孢子萌发和芽管生长，破坏菌丝细胞壁造成胞质分布不均[34]。以上研究表明，贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis)产生的多种次级代谢产物和胞外溶酶可以抑制多样的病原菌，甚至引发植物的诱导系统抗性。本研究中全基因组研究显示，XRD006具备产生胞外溶酶和生物膜的基因，HPLC与质谱结果也表明，XRD006可以产生iturin和fengycin这2种脂肽类抗菌物质，且fengycin家族对青皮核桃病原菌HT12具有较高的抑菌活性。
4 结论本研究首先通过抑菌试验确定了菌株XRD006对青皮核桃采后病原菌具有抑菌活性，随后通过活体抑菌试验和贮藏试验，表明XRD006具备良好的活体抑菌能力及保持青皮核桃贮藏品质的能力；利用组学技术挖掘了XRD006的抗病基因和抗菌产物，揭示了XRD006和FZB42、SQR9之间的亲缘关系；利用凝胶层析、HPLC和质谱证明了XRD006能够产生具有抑菌能力的次级代谢产物脂肽。本研究表明XRD006对青皮核桃采后病害具有良好的抑制作用，可以较好地保持青皮核桃果实品质，且XRD006具有多种潜在抗菌产物，其中fengycin家族脂肽抑菌潜力最强。本研究最终为青皮核桃采后病害生物防治研究提供了理论基础，并丰富了生防菌资源。
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