钒(vanadium, V)是地壳中普遍存在的元素，在天然土壤中以各种矿物形态存在，包括钒铅矿、赤铁矿、绿硫钒石和钒钾铀矿，其含量分布范围各不相同(3‒10 mg/kg)^[1]。钒被广泛应用于合金钢、钒液流电池和催化剂等诸多领域^[2]。各领域对钒日益增多的需求量，导致钒冶炼活动增加^[3-4]，进而导致环境中的钒含量不断增加^[5]。在中国，钒的土壤背景值约为82 mg/kg^[6-7]，但各类地质环境中普遍存在土壤钒污染现象，据报道湖南部分地区及四川攀枝花钒冶炼厂周围土壤中钒的浓度分别高达4 794 mg/kg和1 538 mg/kg^[8-9]。钒污染土壤修复通过借助物理、化学或生物技术，将土壤中钒的浓度降到安全阈值内，或将高毒性的钒转化为低毒性的钒形态，常用的方法主要有改土法、固化稳定化、化学淋洗、微生物修复和植物修复等方法^[10-13]。此外，由于原油和煤炭中富含钒，燃料燃烧、钒产品的制造等人为活动导致环境中钒含量不断增加，污染生态环境^{[6-7, 14-15]}。长时间接触无机钒化合物会对人体健康产生极大影响，损害中枢神经、肾脏等，可能引发神经毒性损伤或癌症等疾病^{[5, 16-17]}，因此钒污染亟待解决。

淋洗是一种有效去除土壤中钒的方式，从而实现钒污染土壤的修复^[18]。传统化学淋洗技术成本高、二次污染严重^[19-22]。生物淋洗技术主要是利用微生物(如细菌、真菌)的自身代谢能力从固体废物中提取金属^[23-24]，与传统化学淋洗相比，经济、高效、对环境友好^{[22-23, 25-26]}，具有发展前景，被广泛用于固体废物、矿物及粪便中金属的溶解和提取^{[20, 27-29]}。生物淋洗常用的细菌为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)等嗜酸性细菌，其可以淋洗多种固体废物，如燃油灰渣、钢渣、含钒矿物和含钒催化剂等，从而引起了广大研究者的关注^{[4, 18, 28, 30-31]}。氧化亚铁硫杆菌是一种以CO₂为碳源的化学自养型嗜酸性需氧菌^[32-33]，Gómez等^[34]的试验表明，氧化亚铁硫杆菌可以从土壤样品中完全提取重金属。然而，利用氧化亚铁硫杆菌从土壤中移除钒的研究尚未见报道。

本研究采用嗜酸性氧化亚铁硫杆菌对攀枝花钒冶炼厂附近钒污染土壤进行了生物淋洗修复。研究通过探究环境因素(固体浓度、接种量、pH和初始Fe²⁺浓度)的影响规律，确定了氧化亚铁硫杆菌生物淋洗浸出土壤钒的最佳条件。同时对试验前后土壤中钒的形态结构、元素组成等进行了表征，并解析了氧化亚铁硫杆菌在生物淋洗过程中产生的代谢产物和途径。

1 材料与方法 1.1 试验土壤

试验使用的土壤采自中国四川省攀枝花市某钒冶炼厂附近，经自然风干后除去树枝和石头，研磨后过100目筛分备用。另一部分土壤是经过化学淋洗后的土壤，其中残渣态钒的比例在90%以上，这部分土壤同样经过风干研磨后过100目筛分备用。

1.2 细菌的培养

试验使用的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌由东华理工大学水资源与环境工程学院核资源与环境国家重点实验室提供。研究通过采用9K培养基培养氧化亚铁硫杆菌，该培养基由溶液A、B两部分组成，其中A组分含有3 g/L (NH₄)₂SO₄，0.1 g/L KCl，0.5 g/L K₂HPO₄，0.01 g/L Ca(NO₃)₂·4H₂O和0.5 g/L MgSO₄·7H₂O，B组分含有15 g/L FeSO₄·7H₂O。配制溶液经0.22 μm的滤膜过滤后备用^[22]。两种溶液组分的pH值调至1.8后，经高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌20 min，冷却至室温后将两者混合得到9K培养基。

将10 mL细菌菌液接种到一个装有90 mL 9K培养基的250 mL的锥形瓶中，放置在(30±0.5) ℃、150 r/min的立式全温振荡器中培养。细菌的生长曲线如图 1所示，前24 h内细菌处于生长延缓期，合成代谢活动十分明显^[35]。进入到对数生长期后，细菌繁殖速度最快，数量呈指数增加。在48–72 h之间，细菌的生长己经进入稳定阶段，由于24–48 h内细菌活性最强生长繁殖最旺盛，因此本研究在此时期内进行传代培养或进行试验。当Fe²⁺浓度小于0.5 g/L时，该菌株用于继代培养，经过3–5次传代，生长曲线稳定后进行浸出试验。

1.3 微生物淋洗试验

研究分别采用一步法和两步法进行淋洗试验。一步法先对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌进行传代驯化培养，然后将菌液接种到培养基中，加入土壤样品后进行淋洗试验。细菌的驯化是将培养液中加入1 g的土样，当菌液中Fe²⁺浓度小于0.5 g/L时，提取10%菌液接种到加入2 g土样的培养基中，继续进行驯化，当Fe²⁺浓度小于0.5 g/L时，即可用于后续浸出试验。两步法将细菌进行传代驯化培养后，悬浮液经0.22 μm的滤膜过滤，将含有嗜酸性氧化亚铁硫杆菌代谢产物的滤液用于后续浸出试验。

试验反应容器选用250 mL锥形瓶，分别加入2 g土壤样品和100 mL 9K培养基，初始Fe²⁺的浓度为3.0 g/L，其中一步法接种10 mL嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，两步法接种10 mL嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的代谢产物，此外用含有Fe²⁺的培养基作为空白对照组。将反应器放置在(30±0.5) ℃、150 r /min的立式全温振荡器中培养20 d。每隔2 d采用注射器吸取等量样品，经0.22 μm的滤膜过滤后，分别测定pH、Eh、Fe²⁺浓度、Fe³⁺浓度和可溶性钒浓度，并对试验前后的土壤形态、土壤中钒的形态变化以及微生物的代谢产物进行分析。

为了探究最佳的生物浸出条件，研究开展了影响因素试验，探究了不同的固体浓度、接种体积、初始pH和初始Fe²⁺浓度对生物浸出效率的影响，确定了最佳的浸出条件。其中固体浓度分别为1%、2%、3%和4%；接种体积分别为5%、10%、15%和20%；初始pH值分别为1.5、1.8、2.1和2.4；初始Fe²⁺浓度分别为1、3、5和7 g/L。

1.4 分析方法

研究采用紫外分光光度法测定Fe²⁺和总铁浓度^[36]，Fe³⁺浓度为总铁浓度和Fe²⁺浓度的差值。通过多功能仪(SevenExcellenceS400)测定pH。采用改进的BCR分布提取法测定试验前后土壤中钒形态^[37-38]。使用电感耦合等离子体发射光谱仪测定(inductively coupled plasma optical emission spectrometer) (ICP-OES; Thermo Fisher; X series)测定可溶性钒浓度，重金属钒的浸出率采用公式(1)进行计算。

公式(公式(1))

式中：C_i是i时浸出液中钒的浓度(mg/L)；V_i是i时浸出液的体积(mL)；C_i-1是i-1时从反应器中收集样品的钒浓度(mg/L)；V_i-1是i-1时从反应器中收集样品的体积(mL)；m是浸出前样品中钒的重量(g)。

研究采用JEOL JAX-840型扫描电子显微镜(SEM)对试验前后土壤样品的形貌变化进行表征。使用SEM-EDS (X-Act, Oxford)测定试验前后元素组分变化。试验结束后，上清液经6 000 r /min离心10 min后，采用0.22 μm滤膜过滤后冷冻干燥获得上清液粉末，并送至上海美吉生物科技公司进行代谢组学分析。具体步骤为，上清液样品采用液相色谱-质谱联用非靶向代谢组学进行分析，检测后的数据使用Progenesis QI (Water Corporation, Milford)软件进行峰提取、对齐和鉴定等，用于后期处理及生信分析。

2 结果与讨论 2.1 生物淋洗性能

在生物淋洗试验中，Test 1组反应器接种了10 mL嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans)，Test 2组加入了10 mL嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的代谢产物，空白对照为含有Fe²⁺培养基的空白对照组。接种A. ferrooxidans的试验组有效浸出土壤中的钒(图 2)，一个周期后原始土壤中重金属钒的浸出率为(27.4±2.0)%，显著高于空白对照组(P < 0.05)。空白对照组土壤中钒也有一定的浸出效果，说明酸性培养基也能够通过化学作用浸出一部分土壤中的钒，虽然浸出效率低于接种A. ferrooxidans的试验组。加入A. ferrooxidans代谢物的试验组的浸出效果稍强于空白对照组，表明氧化亚铁硫杆菌的次生代谢产物也能够促进土壤中钒的溶出^[39]，因此微生物次生代谢产物可以用于改善土壤环境，具有一定的经济效益^[40]。一方面，生物淋洗的效率受到材料本身性质的影响，研究报道钒钛磁铁矿、钢渣、页岩和燃料灰分中钒的生物浸出效率从12.0%到82.0%^{[22, 28, 30]}；另一方面，对生物淋洗材料的预处理也会影响生物淋洗效率，Guo等^[4]采用乙酸预处理冶炼灰进而浸出了41.5%的钒。虽然Li等^[41]发现加入碳酸钠，并在600–750 ℃焙烧可以将钒的浸出效率提高到90%以上，但是生物浸矿能耗更低、二次污染更少，因此更具有应用前景。

在接种A. ferrooxidans的试验组中钒浸出可能有以下几种途径：(1) 氧化亚铁硫杆菌可通过吸附于土壤中直接催化其氧化反应从而直接浸出土壤中的钒^[42-43]。(2) 氧化亚铁硫杆菌通过代谢作用产生H⁺和Fe³⁺，它们能够作为浸出剂将土壤中的重金属离子溶解出来^[44-45]。同时，Fe³⁺也能够通过氧化作用将土壤中的重金属氧化，从而促进溶出^[46]。

图 3为氧化亚铁硫杆菌在淋洗过程中Fe²⁺和Fe³⁺的变化。如图 3A所示，在前2 d由于氧化亚铁硫杆菌快速繁殖，迅速消耗了大量的Fe²⁺，接种A. ferrooxidans的试验组中Fe²⁺的浓度在第2天降低到了接近零。而加入A. ferrooxidans代谢产物试验组中Fe²⁺的浓度下降速度较为缓慢，试验周期结束时，Fe²⁺降至0.4 g/L。虽然空白对照组中发生了部分化学反应，但是Fe²⁺的浓度较为稳定，试验周期结束时Fe²⁺降至2.3 g/L。

如方程式(2)所示，在生物淋洗的过程中，氧化亚铁硫杆菌会将Fe²⁺氧化成Fe^3+[47]。接种A. ferrooxidans的试验组中Fe³⁺的浓度在前2 d迅速增加，之后又缓慢降低。出现这种现象是由于溶液中Fe³⁺浓度的增加，部分Fe³⁺会发生水解反应生成Fe(OH)₃沉淀(方程式3)，同时随着pH的升高，部分Fe³⁺可能生成黄钾铁矾沉淀(方程式4)，黏附在锥形瓶的内壁上，从而导致Fe³⁺浓度的下降^[48]。生物淋洗过程中产生的黄钾铁矾沉淀对溶液吸光度的影响非常大，因此未监测淋洗过程中的溶液OD₆₀₀。由于试验是在好氧条件下进行的，溶液中的部分Fe²⁺会被空气氧化成Fe³⁺，从而导致空白对照组和接种A. ferrooxidans的试验组(Test 1)中的Fe³⁺浓度逐渐升高。

公式(方程式(2))

公式(方程式(3))

公式(方程式(4))

图 3B显示了生物淋洗过程中pH的变化情况，在48 h内pH逐渐升高，随后又逐渐下降。出现这种现象的原因可能是：(1) 溶液中的Fe²⁺被细菌氧化成Fe³⁺，部分Fe³⁺会水解生成Fe(OH)₃沉淀，消耗了OH^‒，产生H⁺，导致溶液中pH降低。(2) 生物浸出过程中会产生一定量的硫酸。(3) 随着重金属的溶出，土壤中的酸性物质也会被溶解，从而增强了溶液的酸性。基于此，浸出过程中接种A. ferrooxidans的试验组pH下降速度最快，加入A. ferrooxidans代谢物的试验组pH下降速度次之，而空白对照体系中pH有轻微的波动。

2.2 影响因素分析

生物淋洗过程受到多种因素的影响，其中固体浓度、接种物体积、pH和初始二价铁浓度等是主要影响因素^[18]。如图 4A所示，不同固体浓度下氧化亚铁硫杆菌对土壤中重金属钒的去除率有较大的差别。在3%的固体浓度下，钒的去除率最高，20 d后能达到27.4%，去除率显著高于在1%和4%的固体浓度下的样本(P < 0.05)。在2%的固体浓度下去除效率次之，为27.0%，而固体浓度为1%时去除效率为12.2%。当固体浓度为4%时，钒的去除效率最低仅为9.8%。这是由于较高的土壤质量导致溶出的物质较多，增强了污染土壤对微生物的毒性作用，从而抑制了氧化亚铁硫杆菌的正常生长，降低了浸出效率^[49]。因此3%的固体浓度是浸出的最适浓度。

研究探索了不同接种体积的氧化亚铁硫杆菌对生物淋洗的影响。如图 4B所示，当接种体积为5%时，钒的浸出率较低，仅为14.8%，而当接种体积为15%时钒的浸出效率最高为31.3%。随着接种体积的增加，钒的去除率也逐渐增加。但当接种体积为20%时，钒的去除率却低于在接种体积为15%时的去除率。这是由于接种体积较高时，在细菌生长的过程中产生种内竞争作用，从而抑制细菌的生长，导致去除率下降。因为接种体积过多时经济效益低，而接种体积过少时钒浸出率低^[50]，接种体积为10%、15%和20%时钒的浸出率较相近，所以研究确定了10%作为最佳接种条件。

在不同pH时，钒的浸出效率如图 4C所示。在pH值为1.8时，钒的去除率最高，达到27.3%，显著高于pH值为2.4时的样本(P < 0.05)，而pH值为1.5时土壤钒的去除效果稍差一些。虽然较低的pH能够提供更多的H⁺，有利于土壤中重金属钒的浸出，但pH值为1.8时的去除率高于pH值为1.5，表明过低的pH可能不利于氧化亚铁硫杆菌的生长，减弱其氧化Fe²⁺的能力^[42]。pH值为2.1和2.4时，钒的去除率较低，这可能是由于pH较高时，溶液中可能会形成黄钾铁矾沉淀包裹住土壤，抑制土壤中钒的溶出，从而导致钒的去除率较低。因此，pH值为1.8时既能为氧化亚铁硫杆菌的生长够提供良好的生存条件，又能够减少黄钾铁矾的产生，提高浸出效率。

图 4D显示了在不同初始Fe²⁺浓度下土壤中钒的去除情况，当初始Fe²⁺浓度为3 g/L时浸出效率最高，20 d后浸出率达到27.5%，显著高于Fe²⁺浓度为1 g/L时的样本(P < 0.05)。当初始Fe²⁺浓度为1 g/L时，浸出效果最差，这可能是由于在生物淋洗的过程中氧化亚铁硫杆菌的能源物质Fe²⁺浓度较低，无法满足其代谢需求，抑制了细菌的生长和代谢^[51]。当初始Fe²⁺浓度为5 g/L和7 g/L时，氧化亚铁硫杆菌的浸出效率低于初始Fe²⁺浓度为3 g/L时的浸出效率，这可能是由于初始Fe²⁺浓度太高，导致溶液中ORP过低，溶液呈现还原态，不利于土壤中重金属钒的溶出^[52]。

2.3 淋洗前后土壤物化特征变化

土壤淋洗试验前后的形貌特征如图 5所示，原始土壤相对致密(图 5A)，浸出试验后土壤表面形成大量结构松软的絮状物(图 5B)。虽然氧化亚铁硫杆菌本身已被证实不直接参与土壤中钒的浸出过程^[53]，但是生物淋洗可以通过氧化亚铁硫杆菌的氧化还原过程实现，微生物的生长期间产生的细胞外多聚体和某些代谢物对土壤产生影响。氧化亚铁硫杆菌在浸出过程中将Fe²⁺氧化为Fe^3+[47]，通过提高Fe³⁺/Fe²⁺比值为整个环境营造氧化环境。氧化后的Fe³⁺能够作为浸出剂，促进土壤中重金属的浸出。土壤浸出前后元素组成发生显著变化，原始土壤中的元素主要包括O、Fe、Al、Si和V (图 5C)，生物淋洗后钒的浓度有所降低(图 5D)，说明生物淋洗能将土壤中的钒有效去除。

研究采用改进BCR分步提取法分析了试验前后土样中钒元素的形态变化。如图 6所示，浸出前原始土壤中的钒主要为残渣态和可还原态，经氧化亚铁硫杆菌生物浸出后，土壤中残渣态比例明显升高，而另外3种形态比例都有所减少，说明生物淋洗主要浸出了土壤中非残渣态钒。

2.4 生物淋洗过程的代谢产物变化

研究开展了代谢组学分析，通过LC-MS测定了接种A. ferrooxidans的试验组、加入A. ferrooxidans代谢物的试验组和空白对照组(CK)中上清液的代谢产物，代谢产物的单因素方差分析如图 7所示。1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-基-4-二磷酸[(E)-C-HDMAPP]、鞘氨醇(C17 sphinganine)、(2-羟基乙氧基)磺酸[(2-hydroxyethoxy) sulfonicacid]、5-氨基戊醛(5-aminopentanal)和对氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine)在空白对照组中相对丰度较低，而在接种A. ferrooxidans的试验组和加入A. ferrooxidans代谢物的试验组中相对丰度较高，表明在钒的胁迫下氧化亚铁硫杆菌产生了差异性代谢。此外，主成分分析法(principal component analysis, PCA)结果显示(图 8)接种A. ferrooxidans的试验组和加入A. ferrooxidans代谢物的试验组上清液中阳离子和阴离子的代谢物表达较为相似，而与空白对照组相比差异显著(P < 0.05)。

接种A. ferrooxidans的试验组、加入A. ferrooxidans代谢物的试验组和空白对照组两两比较的火山图如图 9所示。接种A. ferrooxidans的试验组和空白对照组相比，差异代谢产物共有55个，其中有34个上调、21个下调、103个无显著变化。加入A. ferrooxidans代谢物的试验组和CK相比，差异代谢产物共有56个，其中有37个上调、19个下调、104个无显著变化。加入A. ferrooxidans代谢物的试验组和接种A. ferrooxidans的试验组相比，差异代谢物共有12个，其中有10个上调、2个下调、92个无显著变化。以上结果说明接种A. ferrooxidans的试验组和加入A. ferrooxidans代谢物的试验组上清液中存在更多的代谢产物，且两者间代谢产物相当。

研究进一步解析了代谢途径，并用表达的代谢物表示，结果如图 10所示。在图 10A中，接种A. ferrooxidans的试验组经氧化亚铁硫杆菌生物淋洗20 d后变化明显的代谢途径包括：甘油磷酸酯代谢、类固醇降解、醚脂质代谢、糖酵解/糖质新生、α-亚麻酸代谢、丙酸代谢、果糖和甘露糖代谢、嘧啶代谢、色氨酸代谢，以及氨基苯甲酸酯降解等10条代谢途径。在图 10B中，加入A. ferrooxidans代谢物的试验

组中次生代谢产物的代谢途径主要包括：甘油磷酸酯代谢、氨基苯甲酸酯降解、类固醇降解、醚脂质代谢、双酚a降解、糖酵解/糖质新生、α-亚麻酸代谢、甲苯降解、丙酸代谢、果糖和甘露糖代谢、叶酸生物合成、嘧啶代谢、苯甲酸降解、色氨酸代谢、泛素酮和其他萜类醌的生物合成。在图 10C中，加入A. ferrooxidans代谢物的试验组与接种A. ferrooxidans的试验组相比主要代谢途径包括：双酚a降解、糖酵解/糖质新生、甲苯降解、甘油磷酸酯代谢、药物代谢酶类、叶酸生物合成、苯甲酸降解、氨基苯甲酸酯降解、泛素酮和其他萜类醌的生物合成。

某些化合物，如糖和亚麻酸、丙酸、色氨酸等氨基酸的代谢是氧化亚铁硫杆菌摄取、消耗和排泄的结果^[54]。Fischer等^[55]认为，甘油磷酸酯和醚脂质等脂质的代谢可能会阻止细菌生物膜中有毒金属离子的吸收。因此一方面，氧化亚铁硫杆菌通过自身代谢产生的各种产物来应对高浓度重金属环境，以维持正常繁殖和发育；另一方面，氧化亚铁硫杆菌产生的各种代谢产物也可以促进土壤中重金属钒的浸出。

3 结论

本研究主要应用嗜酸性氧化亚铁硫杆菌淋洗土壤中的重金属钒，结果表明氧化亚铁硫杆菌可有效浸出土壤中的钒，20 d后钒浸出率达(27.4±2)%，显著高于空白对照组(P < 0.05)。影响因素试验研究显示，3%的固体浓度，10%的接种体积、1.8的初始pH值和3 g/L的初始Fe²⁺浓度为生物淋洗的最佳条件。SEM-EDS分析表明生物淋洗后土壤中的钒含量减少，土壤中以非残渣态形式存在的钒被浸出。代谢组学分析表明，氧化亚铁硫杆菌在生物淋洗过程中产生了鞘氨醇、(2-羟基乙氧基)磺酸、5-氨基戊醛和对氯苯丙氨酸等代谢物来应对高浓度的重金属环境。此过程中，氧化亚铁硫杆菌主要代谢途径为甘油磷酸酯代谢、类固醇降解、醚脂质代谢等氨基酸和脂质的代谢。基于此，本研究利用嗜酸性氧化亚铁硫杆菌对钒污染土壤进行了生物淋洗，为微生物法治理修复钒污染土壤提供了新的见解。