电活性微生物是一类能够在固态电子供体或受体表面“吸入”或“呼出”胞外电子，从而获取能量并代谢繁殖的微生物^[1–2]。电活性生物膜则是它们附着于矿物表面形成的聚集体，它们可将电子传递给固态矿物，致使矿物还原溶解，驱动矿物表面有毒金属元素的释放、迁移、转化和再固定，是地球表层元素循环和污染物转化的关键参与者^[3–7]。而富集培养的电活性生物膜，则可应用于生物能源^[8–9]、生物传感器^[10–11]、生物催化^[12–13]以及污染修复^[14–16]等领域，具备广阔的应用前景。

最早发现的2株典型的电活性微生物分别是Shewanella oneidensis MR-1^[17]和Geobacter metallireducens GS-15^[18]。其中，S. oneidensis MR-1由于其兼性厌氧、培养条件简单，在湖泊、海洋、沉积物中分布广泛等特征，而被人们所重视^[19–21]。作为一株模式微生物，S. oneidensis MR-1的电子传递机制、胞外电子传递能力、生理生化性质等已有相对系统的报道，但对其生物膜及细胞形貌的变化研究较少。阐述其形貌变化的规律不仅是全面理解该菌的前提，且有利于解释其在自然环境中参与反应时的微观机制；作为电活性微生物，生物膜形貌的变化将直接或间接影响生物电化学反应系统的性能，理解该过程可为调控S. oneidensis MR-1电子传递性能以及微生物燃料电池反应体系的设计提供指导依据。

S. oneidensis MR-1是典型的杆菌，呈棒状，长约2 μm。但如果对比不同研究则会发现，它的形貌并不是一成不变的。例如，在Xu等的研究中，观察到的S. oneidensis MR-1细胞呈现出非常规则的直型棒状^[22]，但Liu的研究中，细胞却变成了卷曲的形式^[23]。形貌的变化可能与微生物的生存环境有关，当环境中存在有毒物质刺激时，如在含有Cr(Ⅵ)的环境中暴露，S. oneidensis MR-1逐渐由长约2 μm变长达10–15 μm^[24]；利用特定的化学物质(如氯氨铂)对S. oneidensis MR-1进行诱导，也观察到了10–40 μm首尾相连的长条形细胞^[25]；而在Okamoto和Wu使用的组分不同的培养基中，S. oneidensis MR-1的生物膜则分别呈现出致密与蓬松两种完全不同的状态^[26]，上述研究充分说明该菌的形貌并不固定，而是可调可控的。形貌的变化可进一步改变其电化学活性，由氯氨铂处理过的细胞，其电化学活性显著增强，电流密度由11 μA/cm²提高至64 μA/cm²，证实了形貌之于电化学活性的重要性^[25]。但直至目前，并没有研究系统地归纳S. oneidensis MR-1形貌变化的规律，尤其是常见培养条件的改变如何影响其生物膜的状态，目前仍然未知，亟需相应工作填补此空白。

因此，本文选取S. oneidensis MR-1生物膜作为研究对象，以培养基类型、缓冲液浓度、维生素、微量元素、无机盐、电子穿梭体、电子供体、电子受体等培养条件作为变量，归纳了本实验室长期以来观测到的S. oneidensis MR-1生物膜形貌变化方式，详细讨论了引起其形貌变化的可能原因。本研究可进一步理解S. oneidensis MR-1生物膜的生理特性，为支持其作为模式电活性微生物提供有力的基础数据，并为今后的电活性生物膜培养提供指导依据。

1 材料与方法 1.1 菌种和化学试剂

S. oneidensis MR-1购自海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，用于LB培养基配制的胰蛋白胨、酵母提取液购自Oxoid公司，电子穿梭体黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)购自TCI公司，2-蒽醌磺酸(anthraquinone-2-sulfonic acid，AQS)购自Aldrich公司，叔丁醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乳酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司，其余化学试剂均购自广州化学试剂厂。

1.2 生物电化学体系的构建

生物电化学体系的构建包括如下几个关键步骤，(1) 获得微生物菌悬液。将S. oneidensis MR-1接种至LB液体培养基，在30 ℃摇床中以180 r/min转速进行有氧培养，14 h时取出培养液，无菌离心、洗涤3次，获得不含LB培养基的菌悬液；(2) 将菌悬液加入至100 mL西林瓶，加入厌氧培养液，配制成OD₆₀₀=1.0的菌悬液；(3) 通氮气40 min，置入碳布电极(2 cm×2 cm)作为工作电极，钛丝圈电极作为辅助电极，甘汞电极作为参比电极；(4) 热熔胶密封，连接恒电位仪，在外加0.441 V vs.标准氢电极(standard hydrogen electrode，SHE)条件下进行恒电位培养。

1.3 培养基配方设置

本研究探讨了不同培养条件对生物膜形貌的影响，具体培养条件如下。在不同培养环境的实验中，使用了2种典型的培养基，其一为Wu等使用的培养基^[27]，其二为类似Okamoto等使用的培养基，本研究使用的缓冲液为哌嗪-1, 4-二乙磺酸(PIPES)而非该研究中的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)^[28–29]，培养基中添加了50 μmol/L的FMN，具体配方见上述已报道的研究工作。其余实验则均是在Wu等使用的培养液基础上做进一步处理，包括改变磷酸缓冲液(PBS)浓度的处理、添加50 μmol/L AQS的处理、不含外源穿梭体的处理、完整培养基配方的处理、去除所有维生素、微量元素、无机盐的贫瘠培养基处理、开路断电去除电子受体的处理、以及去除乳酸钠电子供体的处理等。

1.4 生物膜分析

本研究涉及的扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)实验均使用飞纳公司的设备完成(ProX，Phenom)，生物样品的具体前处理方法如下。(1) 固定：拆开电化学反应器，用剪刀剪取0.5 cm×0.5 cm碳布电极，转移至2 mL 2.5%的戊二醛当中，浸泡3 h；(2) 洗涤：用100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)浸泡4次，每次20 min；(3) 脱水：随后进行乙醇梯度脱水，分别用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液浸泡电极，每次15 min，再将电极样品转移至无水乙醇中，浸泡3次，每次15 min；最后，使用叔丁醇浸泡3次，每次15 min；(4) 冻干：将最后一次加入的叔丁醇进行冷冻，并置于冷冻干燥仪中进行冻干；(5) 喷金：将干燥的样品喷金；(6) 上机测试。相关方法在本团队前期报道中已得到验证和应用^[30]。荧光显微镜为蔡司正置荧光显微镜(Scope A1，Carl Zeiss)，生物膜样品使用死活菌染料进行染色(L13152 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit，Molecular probes)，随后进行荧光观察，其中红色为死菌，绿色为活菌。生物膜采用总蛋白提取法进行定量，将已形成生物膜的碳布电极放置于50 mL离心管中，加入10 mL浓度为0.2 mol/L的NaOH，100 ℃水浴振荡30 min^[31]。随后，利用试剂盒针对获得的上清液进行考马斯亮蓝(C503041-1000 Modified Bradford Protein Assay Kit，Sangon Biotech)显色，所得定量结果即生物膜总蛋白含量。

2 结果与讨论 2.1 不同培养环境对生物膜形貌的影响

由于S. oneidensis MR-1易于培养，在该菌已报道的电化学研究中，不同研究者使用的培养基略有不同，但培养条件如何影响其生物膜形貌，目前尚不清楚。例如，多名日本学者，包括Okamoto和Nakamura等，其多项研究均使用了30 mmol/L HEPES作为缓冲液，并在添加无机盐的基础上，引入了0.5 g/L的酵母提取液作为营养物进行厌氧培养^[28–29]；而本团队由于发现S. oneidensis MR-1在Geobacter培养基中也可正常生长，因而前期发表的系列S. oneidensis MR-1工作使用了与之类似的培养基，具体为200 mmol/L磷酸缓冲液控制pH，添加无机盐、维生素与微量元素进行培养^{[23, 27, 30, 32]}。图 1A–B是上述两种培养条件下的生物膜形貌，虽然微生物均能正常生长，但两种培养条件下的生物膜形貌存在显著差异。在Okamoto等的培养条件下(medium A)，电极表面的生物膜呈现出紧贴电极的致密状，细胞围绕碳纤维电极紧密、均匀排布，但在本团队使用的培养条件下(medium B)，细胞出现卷曲，呈现出蓬松状，细胞脱离电极向外延伸扩张。可见，培养条件可显著改变生物膜的结构特征。由于两种培养基差异较大、变量较多，Lin等针对上述两种培养条件的影响因素做了细致分析，发现缓冲液浓度是影响其形貌的关键因素。在Lin等的研究中发现，缓冲液浓度从30 mmol/L提高至200 mmol/L时，S. oneidensis MR-1生物膜的最大电流密度从165 μA/cm²提升至327 μA/cm²，微生物则由短直型变为长卷曲型^[26]。将本研究中培养基的PBS缓冲液从30 mmol/L逐步提升至300 mmol/L，也发现细胞形貌产生了显著变化，低浓度条件下微生物细胞为直型(图 1C和D)，而高浓度则转变为卷曲状(图 1E和F)。与此同时，生物膜的生物量也增加了大约一倍(图 1G)，说明缓冲液对生物膜生长影响显著。高缓冲液浓度条件下形成了卷曲型蓬松生物膜，其生物电流从30 mmol/L的176 μA/cm²提高至300 mmol/L的443 μA/cm² (图S1)，意味着高浓度条件下阴极和阳极之间的电子转移更快。在Okamoto等的培养基中，缓冲液浓度发生改变后表现出了类似的浓度效应^[26]，但将本团队培养基的缓冲液替换为PIPES，结果发现PIPES浓度变化对生物膜形貌的改变影响不如PBS明显(图S2)，说明生物膜的形貌调控与培养条件密不可分。

上述发现意味着，研究人员可通过培养条件的控制将生物膜从疏松状转变为致密状。生物膜结构的变化极有可能改变膜内传质速率和电子传递阻力，进而调控生物电流的大小。因此，生物膜结构的简易调控在电化学反应器中可能具有独特的应用前景。

2.2 同一培养环境中不同位置的形貌

在多数研究中，研究者附上一至两张SEM图片展示生物膜呈现出的形貌状态。但实际上，SEM所拍摄的形貌仅仅是微生物的局部特征，但电极表面微生物的生长状态可能是非均一的。本研究发现，即使是在同一培养条件下，电极不同部位的生物膜形貌也可能存在显著差异。图 2是使用Okamoto报道的培养基进行培养时，S. oneidensis MR-1在同一电极上不同位置的形貌。多数情况下，生物膜的形貌如图 2A所示，第一层微生物致密地附着在电极上，外层微生物则紧贴在首层表面。但在同一电极的不同位置，却发现S. oneidensis MR-1的外层细胞能够以长线状存在(图 2B)，长度超过100 μm。从图 2C可见，细胞与细胞之间首尾相连，一部分是两个细胞直接贴合，一部分则是以类似纳米线的方式首尾相连。这种状态在形貌上与近期报道的电缆细菌(cable bacteria)有一定相似之处，但电缆细菌主要是通过周质空间的纳米导线进行电子传递^[33–35]，而此处却是以导线的形式将两者相连接。已有报道表明，Geobacter可通过纳米导线在菌与菌之间传递电子，而近期发现长线状革兰氏阳性菌可形成导电的类似菌毛的附属物，实现远距离的电子传输^[35]，从本研究的结果可知，S. oneidensis MR-1能够首尾相连，在距离电极较远的位置生存，这是否意味着它具有百微米级远距离电子传递的能力，值得进一步探讨。这种形貌存在的位置很随机，它的形成或许与生物膜所处的空间位置有关，如电极纤维与周边电极纤维的远近不同等，可能会诱发相应的生长方式，但具体原因尚不清晰。关于希瓦氏菌生物膜已存在较多报道^[36–38]，氯氨铂处理过的S. oneidensis MR-1生物膜中曾观察到了类似的长线状细胞，其生物膜电子传递速率提高了5.8倍^[25]，而在具有水分散性的两亲表面改性量子点存在时，也观察到了数十微米的长线状S. oneidensis MR-1细胞^[39]，但长度超过100 μm的长线状希瓦氏菌则较为少见。在沉积物中，长线状的电缆微生物由于其导电迅速、电子传递距离长，可介导氧气与硫化物的反应，显著影响沉积物表层的硫氧化过程^[40–41]。S. oneidensis MR-1生物膜中连接相邻细胞的纳米线具体组成及是否具有导电特性需要进一步研究。相比于S. oneidensis MR-1常报道的电子穿梭方式，菌与菌直接接触的方式可使电子传递距离更长、更快，在自然环境中，S. oneidensis MR-1与铁、硫作用时是否也存在类似行为？值得进一步探究。

2.3 电子穿梭体、维生素、微量元素的存在与缺失

电子穿梭体是胞外电子传递过程中的重要参与者，因此，本研究继续探索了穿梭体对S. oneidensis MR-1生物膜形貌的影响(图 3)。结果表明，缺乏外源穿梭体的条件下，电极表面的生物量非常少(图 3A–C)，图 3A视野中仅存12个细胞，且细胞呈现出破碎、干瘪等状态；当典型醌类穿梭体AQS存在时，生物膜在电极表面可大量生长(图 3D–F)。而进一步研究发现，在贫营养的环境中，穿梭体的重要性更为突出。在图 3G–L中，使用200 mmol/L PBS+30 mmol/L乳酸钠作为培养液，不添加任何维生素、微量元素以及无机盐，如果无外源穿梭存在，其生物膜几乎不再生长(图 3G–I)，而外源添加50 μmol/L的AQS则使得生物膜大量繁殖(图 3J–L)。生物膜定量结果显示，含穿梭体处理的蛋白总量远高于不含穿梭体的处理(图 3M和N)，最大电流密度增加47–60倍(图S3)。这说明穿梭体对生物膜的繁殖起着重要的调控作用，从而佐证了近年来研究者提出的观点：电子穿梭体对于S. oneidensis MR-1的胞外电子传递极其关键。该观点的提出主要依赖如下几项标志性的研究结果：早期研究表明，去除S. oneidensis MR-1分泌的黄素类穿梭体，其生物膜的电子传递速率下降70%^[42]；而敲除S. oneidensis MR-1的核黄素分泌基因(bfe基因)，其电流密度下降75%^[43]；当外源添加50 μmol/L穿梭体时，其电子传递速率则提升15–36倍，若此时去除外源穿梭体，电流密度下降超过90%^[27]。结合本研究图 3G–I的发现，在贫营养条件下S. oneidensis MR-1生物膜的生长非常依赖穿梭体，足以证实穿梭过程之于S. oneidensis MR-1的重要程度。本研究的结果进一步确证了穿梭体对于促进S. oneidensis MR-1生物膜形成的重要性，由于穿梭体可方便地通过置换培养液的方式进行去除，对于需要短期获得成熟生物膜的工程体系，穿梭体可作为快速成膜、缩短反应时间的重要技术手段。

上述结果中也发现，在含有外源穿梭体的处理中(图 3D和J)，无机盐、微生物素与微量元素的缺失改变了生物膜的状态。缺失上述营养物质使得生物膜开始贴壁生长(图 3J)，胞外分泌物增多，其形貌与图 3D中蓬松的生物膜差异明显。而荧光结果显示，缺失营养物质时死菌含量也略有增加(图 3F和L)。已有报道显示，S. oneidensis MR-1在营养缺乏的环境中有可能死亡裂解，这可能是导致电极表面生物膜的形貌发生变化的原因。同时，悬液中死亡裂解的微生物可能会释放出蛋白、糖类、无机盐等生源要素，因此，生物膜之所以在贫营养条件下仍然能够大量生长，可能与裂解的微生物为其提供了一定的营养物质有关^[44]。该结果在揭示维生素、微量元素、无机盐等因子对于生物膜形貌产生关键影响的同时，发现了营养元素的缺失可以作为调控生物膜形貌的一种手段，在微生物电化学系统中，可通过调控该类物质的有无，选择性地培育贴壁或蓬松的生物膜。

2.4 电子供体和受体的充足与缺乏

在生物电化学反应当中，S. oneidensis MR-1的电子供体大多是有机碳源，如乳酸钠、甲酸钠、葡萄糖等，而电极则充当电子受体的角色。已有研究表明，在电子受体受限的条件下，即电子受体浓度非常低的条件下(溶解氧小于0.08%)，S. oneidensis MR-1的细胞形貌会发生改变，其细胞外膜向外延伸，形成纳米线状(nanowire)结构^{[17, 45]}。随后的研究证实，S. oneidensis MR-1纳米线的结构更接近于此前报道的纳米管(nanotube)^[46]，而显著区别于Geobacter菌属的纤毛型纳米导线^[47]。于是，本研究进一步探究了电子供体与受体完全缺失对S. oneidensis MR-1生物膜形貌的影响，试图阐明极端条件下微生物形貌的变化特征。

培养成熟的生物膜如图 4A所示，进行开路断电操作，阻断电子的传递。结果显示，电子受体缺失后细胞开始裂解破碎，24 h之后多数微生物已无完整的细胞形态(图 4B)，荧光显微镜结果显示，生物膜绿色变浅，活菌减少(图 4D和E)，这说明受体缺失引发了S. oneidensis MR-1的死亡。在前期电子供体受限而形成纳米导线的研究中，作者认为该纳米导线的形成是S. oneidensis MR-1向外寻找电子受体的一种策略^[48]。但本研究发现，电子受体的长时间缺失造成了细胞的裂解，说明这种向外延伸的策略可能对细胞造成了不可逆的破坏性影响，缺失受体时的细胞膜延伸可能是微生物受胁迫条件下的应对策略，其极端情况会造成自身的死亡。这与纳米管最新研究进展中的观点较为一致，虽然此前研究一直认为纳米管是细胞进行物质传递(包括DNA、蛋白、营养物质传递)的主动行为，但该研究认为，Bacillus subtilis NTs细胞膜向外延伸而形成纳米管属于被迫的应对机制，该过程意味着细胞死亡的开始^[49]。这进一步支撑了本研究的观点，S. oneidensis MR-1在电子受体缺失条件下细胞膜向外产生的延伸，可能也是其细胞膜发生裂解的开始。

而图 4C则是生物膜缺失电子供体之后的形貌表现，将培养基更换为不含电子供体的新培养基，继续培养24 h，结果发现电极上的微生物也出现了部分裂解(图 4C)。虽然与缺失电子受体的条件相比，裂解程度相对较低，但也间接说明了S. oneidensis MR-1对极端环境的抵抗能力有限。荧光结果也显示其绿色较暗，活菌较少(图 4F)。此外，从生物膜定量结果可知，碳布上的生物量下降，缺失电子供体24 h之后生物量减少了大约1倍(图 4G)，这可能是由于电子供体缺失而产生了细胞脱落的现象。

上述发现预示着以S. oneidensis MR-1为菌种构建的生物电化学体系中，不能长期缺失电子受体，否则会对生物膜造成不可逆的损伤。根据以往研究可知，微生物死亡的诱因包括直接导致细胞失活或裂解的物理、化学和生物因素，包括温度、抗生素和噬菌体侵染等^[50–51]、以及特定信号诱发的程序性死亡，包括毒素-抗毒素系统、细胞凋亡等^[52]，电子受体缺失导致细胞膜裂解的机制有待进一步阐明，这也正是S. oneidensis MR-1作为模式微生物亟待完善的基础认识。

3 讨论与结论

本研究发现，培养条件可控制微生物细胞的长短、调节生物膜的致密与疏松。低浓度缓冲液中(30 mmol/L和100 mmol/L)，其细胞多为短杆状，高浓度缓冲液中(200 mmol/L和300 mmol/L)细胞卷曲伸长；缺乏维生素、微量元素、无机盐则可使生物膜变得致密；而穿梭体和电子受体对于S. oneidensis MR-1极为关键，前者可显著促进生物膜的形成，后者的缺失可迫使生物膜细胞裂解；此外，通过形貌研究，发现了S. oneidensis MR-1可首尾相连形成超过100 μm的长线状结构。本研究从微观世界的形貌特征入手，完善了S. oneidensis MR-1生物膜形貌特性的理解，可为支持其作为模式电活性微生物提供有力的基础数据，并为今后的研究提出了可能的方向。