少根根霉(Rhizopus arrhizus A. Fisch. 1892)，在世界范围内广泛使用的另外一个名称是米根霉(R. oryzae Went & Prins. Geerl. 1895)。该物种是传统接合菌的核心类群，隶属于毛霉目根霉科的根霉属^[1]，存在于土壤、空气、食物等多种基物和人体内，能够导致毛霉病^[2–3]。此外，作为美国食品药品管理局(FDA)认证的公认安全(generally regarded as safe，GRAS)生物，少根根霉环境适应能力强，生长迅速，能高效转化多种碳氮源底物，是重要的食品和饮品发酵菌^[4–6]。

少根根霉能够产生多种淀粉酶，可使淀粉转化为可发酵性糖，比如，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。发酵过程中也能产生酒精，在酿酒业广泛应用^{[5, 7]}；发酵过程中还能产生乳酸、富马酸和苹果酸等有机酸^[8–10]，使酿造的酒具有独特的风味。此外，少根根霉是脂肪酶的重要生产菌，能够水解脂肪酸链产生醛、酯、酮和萜等多种芳香性化合物，用于含油脂食品的增香等^[11]。目前已有许多研究通过优化发酵工艺、选育或者基因工程改造菌株来提高少根根霉的发酵产能^[12–14]。通过发酵工艺的优化，少根根霉发酵的糖化酶活力达197 U/mL^[15]，乳酸产量达69 g/L^[16]，富马酸产量达31 g/L或者47 g/L^{[10, 17]}。为了选育具有生产潜力的菌株，常常模拟发酵条件进行筛选^[18]。发酵工程菌株的构建方面，代表性的出发菌株为ATCC 20344^[19]，其突变体FM19在葡萄糖培养基中富马酸产量提高到49 g/L^[20]，其突变体G80在粗甘油培养基中富马酸产量仍然高达26 g/L^[13]。

少根根霉在世界广泛分布，具有丰富的物种内多样性^[21–22]，多样性的潜在出发菌株亟待发掘。除初始分离的地理位置和生态上的多样性以外，少根根霉具有多样化的表型和基因型。该物种在分类学上包含3个变种，即原变种(R. arrhizus var. arrhizus A. Fisch. 1892)、东京变种(R. arrhizus var. tonkinensis (Vuill.) R.Y. Zheng & X.Y. Liu 2007)和德氏变种(R. arrhizus var. delemar (Boidin ex Wehmer & Hanzawa) J.J. Ellis 1984)^[23–25]。长期适应发酵环境的少根根霉沿着两个方向演化：有的在形态上退化，不再产生无性孢子囊，称为鲁氏形态型(Rouxii type)，一些学者将这类少根根霉称为鲁氏淀粉霉^[26–27]；有的在生化上特化，产生大量的乳酸，而很少产生富马酸和苹果酸，称为产乳酸生化组(LA group)，一些学者将这类少根根霉称为德氏根霉^{[21, 28–29]}。在Zheng等^[23]的根霉属专著中，鲁氏淀粉霉是少根根霉原变种的异名，德氏根霉是少根根霉德氏变种的异名。

本研究选取具有不同的产孢能力，不同的生态环境，形态上属于不同的变种，来自不同的地理区域的少根根霉68株，涵盖了鲁氏形态型和产乳酸生化组。通过对其发酵糯米产生的多种产物进行分析，了解菌株间的差异，揭示种内发酵性能多样性和相关性，为优质工业生产出发菌株的筛选奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株

供试68株菌(表 1)分离自全球22个国家，涵盖亚洲、欧洲、北美洲、南美洲、非洲和大洋洲等6个大洲，来源于土壤、空气、酒曲和人体等多种基物，根据起始生态环境，少根根霉分为驯化型、致病型和野生型等3个生态群体。所有菌株均保藏并活化自中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室菌种库。

1.2 形态学与分子生物学鉴定

结合形态学与分子生物学的方法进行菌种鉴定和变种划分。形态上，观察假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊、囊托、囊轴和孢囊孢子等结构，根据Zheng等^[23]的分类标准进行形态学鉴定。从分子水平上，提取细胞总DNA，对ITS和IGS rDNA进行PCR扩增与测序，构建最简约(maximum parsimony)分子系统发育树确定分类学变种的分类地位，详细方法参考鞠笑等的文献^[30]。

1.3 产孢能力测定

对鉴定为少根根霉的菌株在毛霉合成液体培养基(synthetic mucor，SM：葡萄糖20 g/L、天门冬素2 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、七水硫酸镁0.25 g/L和维生素B₁ 0.5 mg/L)中进行产孢能力测定。将保存的菌种首先接种到麦芽提取物琼脂培养基(malt extract agar，MEA：麦芽提取物20 g/L、蛋白胨1 g/L、葡萄糖20 g/L和琼脂20 g/L)平板上，30 ℃恒温培养2 d。刮掉气生菌丝后，用200 μL移液器吸头敞口切入，获得相同直径(5 mm)含菌培养基，接种到含有20 mL毛霉合成液体培养基(SM)的250 mL三角瓶中，30 ℃恒温箱中静置培养8 d。小心去除三角瓶中的液体培养基，加入50 mL无菌水，用玻璃棒剧烈搅拌帮助孢子囊破裂释放孢囊孢子，用8层纱布过滤菌丝，获得孢囊孢子悬浮液，4 ℃保藏备用。对于在毛霉合成液体培养基(SM)中不产孢的菌株，则转接至麦芽提取物琼脂培养基(MEA)以收集孢子。用血球计数板在蔡司IMAGER A2-M2显微镜下统计孢子浓度。

1.4 糯米发酵

将前面获得的孢子悬浮液用于糯米发酵，选取代表不同产孢能力、不同变种、不同生态类群和不同地理位置的5株菌(XY00012、XY00077、XY00406、XY00438和XY03795)进行发酵预实验。在250 mL三角瓶中装入50 g糯米(安徽省合肥市安徽燕之坊食品有限公司，碳水化合物、蛋白质和脂肪含量分别为76.0%、7.3%和1.5%)，加入80 mL蒸馏水，封口后在高压灭菌锅中1×10⁵ Pa，121 ℃灭菌20 min。将适当体积的孢子悬浮液接种到灭菌的糯米培养基中，补充无菌水至总体积100 mL，使接种后孢子终浓度为6.25×10⁴个/mL，封口膜密封后置于30 ℃恒温摇床140 r/min连续培养，每天测定发酵产物浓度，绘制发酵曲线确定发酵稳定期。正式实验时，所有实验菌株发酵至稳定期(8 d)后，抽取2 mL发酵液，12 000 r/min离心10 min，重复离心1次，用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，装入高效液相层析(high- performance liquid chromatography，HPLC)样品瓶中，4 ℃保存备用。每株菌设置3个技术重复；2个对照：对照1为无菌水加糯米，对照2为无菌水加孢子悬浮液。

1.5 HPLC测定

对糖类、有机酸类和醇类物质的测定采用高效液相色谱法(HPLC)，选用LC-20A液相色谱仪(Shimadzu，Japan，https://www.shimadzu.com/)、Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm液相色谱柱(Bio-Rad，USA，https://www.bio-rad.com/)、RID-20A示差折光检测器(Shimadzu)，流动相为减压除气的5 mmol/L硫酸，流速0.6 mL/min，进样量20 μL，柱温60 ℃，检测时间30 min。

1.6 发酵产物浓度分析

色谱纯糖类标准品精确称量前于40 ℃烘箱中干燥24 h，其他标准品直接称量。用流动相5 mmol/L硫酸配制母液(乙醇160 g/L、甘油20 g/L、麦芽糖6 g/L、葡萄糖6 g/L、乳酸3 g/L、富马酸3 g/L和苹果酸3 g/L)，取母液和流动相5 mmol/L硫酸各20 mL于50 mL离心管混匀，得到第1个梯度稀释液，依次2倍稀释至第6个梯度。HPLC测定母液和各梯度稀释液的出峰时间和峰面积，并用Microsoft Excel 2016绘制峰面积对浓度的标准曲线(r² > 0.99)。计算标准曲线公式，将HPLC测定得到的原始峰面积换算为浓度，计算每株菌3个技术重复的平均值、标准差和标准误，采用平均值绘制发酵产物浓度条形图、百分含量饼图和箱形图。

1.7 多样性分析

在Excel 2010软件中以每株菌第8天发酵产物浓度平均值来分析少根根霉种内发酵产物的丰度和多度。发酵产物种类数记为丰度，而多度等级参照Drude 7级制并加以修改，当多度 > 75%时认为极多，50%–75%很多，25%–50%多，5%–25%尚多，2.5%–5.0%不多，1.0%–2.5%稀少，< 1.0%极少^[31]。统计多度为尚多及以上等级的发酵产物浓度分布情况，利用Excel 2010筛查出极端离群菌株并将其剔出后续的相关性分析。

1.8 相关性分析

利用软件SPSS Statistics 19^[32]计算各种发酵产物浓度之间的Pearson相关性系数矩阵，并采用95%和99%的置信区间进行显著性双侧检验。利用软件Cytoscape 3.8.2^[33]进行数据可视化，将7种发酵产物及两两相关系数导入，用不同颜色表示不同种类的发酵产物，不同线型表示不同的相关性关系，绘制相关性网络图。Pearson相关系数|r| < 0.33、0.33≤|r| < 0.66和|r|≥0.66分别处理为弱、中等和强相关。

利用SPSS对各发酵产物及发酵产物均值(表示总发酵能力)分别与产孢能力、生态群体、变种和地理位置进行多因素方差分析，当P < 0.05时认为具有显著性差异，P < 0.01时认为具有极显著差异。各分组间差异显著或极显著的发酵产物用于主成分分析和热图绘制。采用SDV法(singular value decomposition)计算主成分，利用多元数据的可视化聚类网站ClustVis (https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)作图^[34]，并以95%置信度绘制预测椭圆。并利用发酵产物浓度在ClustVis网站上绘制热图，采用相关距离(correlation distance)和平均连锁(average linkage)进行聚类，适当调整颜色数值范围，选用红蓝两个颜色的渐变表示发酵产物浓度的相对高低。

2 结果与分析 2.1 菌株类群

供试68株菌经形态学与分子生物学鉴定确定为原变种25株，德氏变种31株，东京变种12株；毛霉合成液体培养基(SM)上产孢菌种60株，SM无孢菌种8株(表 2)。

2.2 发酵产物多样性

发酵预实验结果表明，发酵1 d后开始糖化，5株菌的7种发酵产物浓度在第1–7天整体呈上升趋势，个别菌株的个别产物如XY00012发酵产葡萄糖的浓度稍有波动，而第8–10天各菌株的各发酵产物浓度基本不再变化，浓度曲线趋于平缓(图 1)，表明第8天已经完全液化，故在正式实验中，发酵8 d后取样进行浓度测定。本研究中少根根霉糯米培养基发酵的产物丰度为7，检测到葡萄糖、麦芽糖、苹果酸、富马酸、乳酸、乙醇和甘油(图 2)。发酵产物多度方面(图 2B)，葡萄糖产量很多，占发酵产物总量的70.96%；乙醇(17.87%)和乳酸(6.63%)产量尚多；麦芽糖(1.80%)和富马酸(1.46%)产量稀少；甘油(0.92%)和苹果酸(0.36%)产量极少。菌株XY01957发酵产物总量最高，达到171.47 g/L (图 2A中第1位)；菌株XY03822、XY00012、XY01737、XY01736、XY00507和XY03829等6个菌株各自的发酵产物总量较高，分别为140.10、128.23、127.11、125.43、106.09和99.01 g/L (图 2A中第2–7位)；接下来是发酵产物总量中等且呈连续分布的60个菌株(88.03–33.89 g/L，图 2A中第8–67位)；菌株XY03797发酵产物总量最低(23.26 g/L，图 2A中最后一位)，发酵产物种类最少，不产生乳酸、富马酸、苹果酸、甘油和葡萄糖，仅产生乙醇和麦芽糖，其乙醇产量没有特别之处，但其麦芽糖产量在所有菌株中位列第一(18.42 g/L)，只有1株菌XY00507较为接近(10.25 g/L，图 2A中第6位)，其余菌株与其差异较大，在0.40–3.51 g/L范围内呈连续分布。统计乙醇和乳酸的含量分布情况，没有发现极端离群菌株；统计葡萄糖含量发现XY01957属于极端离群菌株(138.30 g/L，图 2C中葡萄糖最右边的离群点)，在后续相关性分析中将其所有数据予以删除，麦芽糖、甘油、富马酸和苹果酸含量整体偏低，其极端离群值不予处理。

2.3 发酵产物相关性

麦芽糖和其他发酵产物之间的相关性均较弱(|r| < 0.33)，基本属于独立代谢(图 3A)。其余6种发酵产物之间存在明显的相关性，共有9对中等或强相关(图 3B)：正相关6对，分别是富马酸与苹果酸(r=0.78)，甘油与乳酸(r=0.76)，甘油与葡萄糖(r=0.68)，乳酸与葡萄糖(r=0.46)，乙醇与苹果酸(r=0.43)，乙醇与富马酸(r=0.35)，其中前3对为强相关；负相关3对，分别是乳酸与苹果酸(r=–0.43)，乳酸与富马酸(r=–0.42)，甘油与苹果酸(r=–0.37)。因此，这6种产物可以分为2组：第一组为葡萄糖、乳酸和甘油，相互间存在正相关(r范围为0.46–0.76)；第二组为乙醇、苹果酸和富马酸，相互间也存在正相关(r范围为0.35–0.78)；两组之间则存在明显的负相关(r范围为–0.43– –0.37)。

2.4 菌株类群与发酵特性的相关性 2.4.1 产孢能力与发酵特性的相关性

多因素方差分析结果(表 3)表明，发酵总能力以及发酵产葡萄糖、乙醇、乳酸、麦芽糖和甘油的能力在SM不同产孢能力的菌株之间差异极显著(P < 0.01)，SM无孢菌株显著高于SM产孢菌株，除XY03794之外，发酵产物总浓度分别为106.09–171.47 g/L和23.26–99.01 g/L。然而，苹果酸和富马酸在SM不同产孢能力的菌株之间无显著差异(P > 0.05)。对67株菌的上述6组显著相关的数据进行主成分分析(principal components analysis，PCA)提取出2个主成分，贡献率分别为51.9%和18.8%，累计贡献率达到70.7%。第一主成分(PC1)中葡萄糖(r=–0.50)、乳酸(r=–0.44)、甘油(r=–0.51)和平均值(r=–0.53)的相关系数较大，是对第一主成分影响最大的特征向量，说明PC1可能是由它们几个组成的一个综合指标。而PC2主要代表乙醇(r=–0.84)和麦芽糖(r=–0.46)。从图 4A可以看出SM不同产孢能力菌株的95%置信椭圆基本可以分开，相较于SM产孢菌株，SM无孢菌株在PC1得分较高，而在PC2得分较低。热图 5A同样显示了SM不同产孢能力菌株间发酵特性的差异。

2.4.2 生态群体与发酵特性的相关性

多因素方差分析(表 3)表明，乳酸和麦芽糖在不同生态群体间差异极显著，乙醇和甘油在不同生态群体间差异显著，其热图如图 5B。对以上4种发酵产物进行PCA分析共提取出2个主成分，贡献率分别为44.8%和25.7%，累计贡献率达到70.5%。第一主成分(PC1)主要为乳酸(r=–0.68)和甘油(r=–0.70)，第二主成分(PC2)主要代表乙醇(r=–0.72)和麦芽糖(r=–0.66)。不同生态类型菌株的95%置信椭圆无法分开，野生型在PC1上的得分范围较大，驯化型在PC2上的得分范围较大(图 4B)。这样的得分范围也反映出个别菌株的特异性，比如XY03822、XY00012和XY01736等3个野生型菌株发酵产乳酸和甘油显著高于其他菌株，而驯化型菌株XY00507发酵产乙醇和麦芽糖显著高于其他菌株(图 5B)。

2.4.3 分类学变种与发酵特性的相关性

多因素方差分析结果(表 3)表明，不同变种间乳酸和富马酸产量差异极显著，甘油和苹果酸在不同变种间差异显著。对上述4种发酵产物进行PCA分析共提取出2个主成分，PC1代表富马酸、苹果酸、乳酸和甘油，相关系数分别为0.49、0.52、–0.52和–0.47，PC2也代表富马酸、苹果酸、乳酸和甘油，相关系数分别为–0.54、–0.44、–0.42和–0.58，PC1和PC2的贡献率分别为62.4%和26.4%，累计贡献率达到88.8%。原变种与东京变种在第一主成分上的得分明显高于德氏变种(图 4C)。其热图(图 5C)表明少根根霉变种与上述4种发酵产物之间有较为明显的聚类对应关系。少根根霉的3个变种可以聚为两个分支，除了菌株XY03795和XY03788，少根根霉原变种与东京变种聚在一起；而除菌株XY03802和XY03822以外的德氏变种聚为另一类。由图中可知，德氏变种分支的富马酸和苹果酸产量较高，而乳酸和甘油产量较低，原变种与东京变种分支则恰好相反。

2.4.4 菌株初始分离时的地理位置与菌株发酵特性的相关性

多因素方差分析结果(表 3)表明不同地理来源的菌株乳酸、麦芽糖和甘油产量差异极显著，葡萄糖产量和发酵能力差异显著，进行PCA分析时提取出2个主成分，贡献率分别达到62.2%和20.2%，累计贡献率为82.4%，PC1主要代表乳酸(r=–0.44)、葡萄糖(r=–0.50)、均值(r=–0.52)和甘油(r=–0.51)，PC2主要代表麦芽糖(r=–0.95)。不同来源菌株的95%置信椭圆无法分开(图 4D)，相同地理位置的菌株在两个主成分上得分差异均较大，具有菌株特异性，其中XY03822、XY00012和XY01736的总发酵能力和发酵产乳酸、葡萄糖和甘油的能力显著高于其他菌株，XY00507和XY03797的发酵产麦芽糖的能力显著高于其他菌株(图 5D)。

3 讨论与结论 3.1 主要发酵产物及其功能分析

本研究采用同步糖化法，以糯米为底物，利用纯种少根根霉菌株进行液态摇瓶发酵，经过8 d的发酵后，最终检出的主要发酵产物有糖类2种(麦芽糖和葡萄糖)，有机酸3种(乳酸、富马酸和苹果酸)，醇类2种(甘油和乙醇)。比较以上种类的发酵产物含量可知，少根根霉在发酵过程中，最突出的是其发酵产葡萄糖的能力(图 2)，这是由于少根根霉既能产糖化酶也能产α-淀粉酶和β-淀粉酶，但是不同菌株产酶性能不同，所产酶的特性也不同，总体而言根霉产上述3种淀粉酶能力均较强且酶活力高^[35–36]。其中α-淀粉酶和β-淀粉酶水解淀粉最终产物以麦芽糖为主，并产生少量的葡萄糖，而糖化酶几乎可以将淀粉理论值地转为葡萄糖^[35]。XY01957的葡萄糖产量可达到138.30 g/L (27.66 g/100 g糯米)，且本次供试菌株中葡萄糖含量在60 g/L以上的菌株有16株，说明这些少根根霉菌株可能具有较高的糖化酶活力，是米酒发酵的适宜菌株。除XY01921为临床菌株外其余15株菌株均为来自土壤或其他自然环境中的野生菌株。野生型菌株可能由于生长环境更为多样，底物种类丰富，因而具有更高的糖化能力。菌株XY03797较为特别，其发酵产物中含有较高浓度的麦芽糖和乙醇而未检测到葡萄糖，表明该菌株麦芽糖酶或α-葡萄糖苷酶活性较低。工业上常依靠少根根霉的糖化能力进行各种发酵，而根霉发酵能力除了与本身的糖化力有关外还与其生长速度有关，在发酵过程中，根霉边生长、边产酶、边糖化。因此根霉发酵能力不能完全采用酶活力表示，而采用产物量表示。为了提高各个菌株产物量的可比性，尽量避免菌株生长量的差异，本研究严格控制了孢子接种量。

本研究测定的发酵产物中乙醇是产量第二高的物质，最高浓度可达33.40 g/L，这说明少根根霉不仅具有突出的糖化能力，能够将淀粉高效地转化为可发酵性糖，而且具备将可发酵性糖转化为酒精的能力。由此可见，在糯米酒酿造过程中，少根根霉具有纯种发酵的潜力^[18]。相比于传统工艺，纯种根霉曲具有糖化发酵力高、制作周期短和生产成本低等显著优势，单因素实验和响应面实验也证明了纯种米根霉酒曲制造工艺的可靠性和实用性^[37]。同时，少根根霉也是我国传统白酒酿造所需酒曲中的重要功能菌株和优势菌株^[38–39]，除了传统认为的少根根霉的糖化作用外，其产酒作用也不可忽视。Karimi等^[40]以酸预处理后的稻壳为底物，添加纤维素酶，用纯种少根根霉进行发酵，得到乙醇产率为74%，最大乙醇浓度为19.25 g/L；Abedinifar等^[41]报道了少根根霉能够利用预处理的稻草，并以与酿酒酵母(最常用于乙醇发酵的啤酒酵母)相似的产量(0.33–0.41 g/g)生产乙醇；张凤英等^[42]以纯根霉曲2-2酿酒和加了酵母的根霉曲对照进行糖化发酵，结果表明，纯根霉虽然在发酵前期较为迟缓，但发酵结束时其酒精含量与对照无显著差异。本研究结果为少根根霉出色的产酒精能力提供了新的强有力的证明。

乳酸是制药和食品工业中广泛应用的功能产品，而少根根霉由于营养要求粗放，菌丝体大而易于分离，L-乳酸纯度高，易于精制，成为乳酸生产的重要菌株^[43]。目前对于少根根霉产乳酸发酵进程中工艺条件的优化以及菌体形态的控制已经有所研究。Yin等^[44]在气升式发酵罐内利用米根霉发酵玉米淀粉直接生产L-乳酸，发酵3 d后乳酸浓度可达102 g/L。孙小龙和付永前^[45]对高产乳酸的少根根霉突变株进行了碳代谢流分析，发现不同形态菌体的碳代谢流明显发生变化，其中均匀球状菌体碳代谢流更易于L-乳酸合成。乳酸是我国传统酒曲发酵工艺中的重要风味物质，而少根根霉一直在其中发挥着不容忽视的重要作用^{[39, 46]}，本研究结果中少根根霉的乳酸产量最高可达到28.1 g/L，占发酵产物总含量的6.63%，是含量第三高的物质，也充分证明了少根根霉在糯米发酵中对乳酸产量的重要贡献。

3.2 发酵产物相关性与代谢调控

Abe等^[28]发现富马酸和苹果酸之间正相关，两者与乳酸负相关，因此将少根根霉分为产富马酸-苹果酸组(FMA组)和产乳酸组(LA组)。本研究进一步确认了这种关联，并发现了更多的发酵产物相关性(图 3)：7种发酵产物分为3组，第一组为葡萄糖、乳酸和甘油，彼此之间为正相关；第二组为乙醇、富马酸和苹果酸，彼此之间为正相关；第三组为麦芽糖。前两组之间负相关而与第三组麦芽糖无显著相关性。

少根根霉的糖分解代谢过程中，主要包括糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP)和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)。葡萄糖首先经过EMP转换为丙酮酸，基质内的丙酮酸还可独立地继续生成乙醇、乳酸、苹果酸和富马酸；进入线粒体内的丙酮酸可以通过生成乙酰辅酶A进入TCA循环^{[43, 45, 47]}。苹果酸是富马酸代谢过程的前体物质，因而两者为正相关关系。乳酸与细胞基质内的苹果酸-富马酸合成途径为竞争关系，所以乳酸与两者均为负相关关系。少根根霉的甘油合成过程，是以糖酵解的中间产物起始合成的，是糖代谢过程的重要分支途径，葡萄糖作为糖代谢过程的起始物，葡萄糖含量越高，流向甘油代谢通路的中间产物越多，因此葡萄糖与甘油为正相关关系。鉴于甘油和乳酸的正相关关系，已有利用少根根霉转化甘油生产乳酸的研究，成本较低，乳酸产量可达到48 g/L，是指导工业化生产的良好营养来源^[48]。对于发酵产物相关性的研究，可以为少根根霉代谢通路的调控提供新的依据和思路^{[13, 49]}，可以为工业化生产提供新的代谢路径的参考^[50]，与基因组分析相结合，也有助于确定基因位点之间的关联。

3.3 无孢菌株的发酵特性

本研究发现SM无孢菌株大多具有较强的发酵能力，发酵产物总含量最高的7株少根根霉均为SM无孢菌株。如图 2A所示，XY01957、XY03822、XY00012、XY01737、XY01736、XY00507和XY03829等7个菌株的发酵能力较强，且在毛霉合成液体培养基(SM)中均无产孢能力。而本研究涉及的SM无孢菌株总共才8株，除上面7株外，剩下的一株是XY03794，其发酵能力也不低，排在第14位，达到82.20 g/L。Ellis等^[26]和Wang等^[27]将不产孢的少根根霉认为是鲁氏淀粉霉，而且将这一物种限定为发酵环境，本研究发现的这8株SM无孢菌株应该属于这一类群，但是其来源并不限定于发酵环境，只有2株来源于发酵环境，剩余6株全部来自自然环境。

产孢能力弱的菌株，能够利用底物的能力更强，可以将同化底物得到的能量更多地用于产生自身生长必需的多种重要产物，而不是用于细胞复制和有性生殖。产孢能力强的菌株，随着发酵进程的进行，受到营养胁迫时，会消耗同化底物产生的能量用于繁殖，而使得产生的发酵产物浓度降低。由此可见，无孢菌株能更好地应用于发酵工业的环境并高产所需的发酵产物，因此本研究发现的7株发酵能力强的SM无孢菌株具有良好的生产潜力，丰富了目前少根根霉发酵工业的菌株资源并为发酵菌株的筛选提供了指导。

早年，分类学家将在大米和木薯发酵物上生长的菌丝几乎为白色，应用于食品工业的真菌命名为鲁氏淀粉霉^[26–27]，直到Ellis^[51]进行了DNA测定，确认其与少根根霉属于同一个物种，鲁氏淀粉霉只是其中一个异名。这说明无孢菌株可能是由于长期在酒曲环境中并无产孢需求的自然选择下，或是营养丰富的野生环境中并未受到压力胁迫，在少根根霉种内发生了演化。本研究结果也支持这一结论，SM无孢菌株在PCA分析时并没有聚为一个相对独立的类群，而是分散为离群值(图 4A)，所以少根根霉中的不产孢类群尚未演化为独立的变种。

3.4 德氏变种的分类学地位

通过发酵特性的差异对少根根霉进行分类，已经早有研究。根据有机酸产量的不同，可以将少根根霉分为2个类群，产乳酸的德氏根霉类群(R. delemer)和产苹果酸-富马酸的米根霉类群(R. oryzae)^{[21, 28–29]}。Saito等^[21]研究发现，产苹果酸-富马酸的米根霉(R. oryzae)细胞内具有乳酸脱氢酶A (ldhA)和乳酸脱氢酶B (ldhB)，而产乳酸的德氏根霉(R. delemer)则缺失乳酸脱氢酶A (ldhA)。目前对这两个类群的分类，有两种不同的看法。Abe等^[28]基于ITS、Act1、EF-1α和AFLP，结合乳酸和富马酸发酵情况，对13株少根根霉构建系统发育树，并且认为应该将少根根霉划分为独立的两个种。而Chibucos等^[52]对包含米根霉(R. oryzae)和德氏根霉(R. delemer)在内的38株能引起毛霉菌病的真菌进行了基于76个直源基因蛋白的系统发育分析，结果米根霉(R. oryzae)和德氏根霉(R. delemer)在系统进化树上并没有区分开。因此，我们倾向于认为米根霉(R. oryzae)和德氏根霉(R. delemer)并不是两个独立的种，而是少根根霉群体水平上(R. arrhizus)的原变种(var. arrhizus)和德氏变种(var. delemar)两个变种。德氏变种较原变种的糖化能力弱，其在发酵特性上的差异说明少根根霉在演化过程中形成了丰富的种内多样性，是群体遗传和比较基因组学研究的良好材料。本研究结果也支持了德氏变种在发酵特性上的特殊性。表型特征以及菌株基因信息与特定基因片段甚至是全基因组水平遗传信息相结合，是群体遗传学研究的重要思路和手段^[53–54]，有助于帮助我们解决少根根霉在进化过程中的变种形成规律和物种迁移等问题，从而解析少根根霉群体演化机制，为其在发酵工业中更好地应用提供指导。

致谢

感谢中国科学院微生物研究所菌种保藏中心和真菌学次级代谢平台对本研究的支持；感谢微生物研究所陈保送博士在HPLC方面提供的帮助。