中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
文章信息
- 刘超楠, 王金铭, 南韦肖, 司华哲, 张新宇, 蔡熙姮, 刘晗璐. 2021
- Chaonan Liu, Jinming Wang, Weixiao Nan, Huazhe Si, Xinyu Zhang, Xiheng Cai, Hanlu Liu. 2021
- 不同来源植物乳杆菌基因组结构和功能差异的比较研究
- Comparative study on the structure and function of Lactobacillus plantarum from different ecology
- 微生物学报, 61(9): 2934-2948
- Acta Microbiologica Sinica, 61(9): 2934-2948
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文章历史
- 收稿日期:2020-12-28
- 修回日期:2021-02-08
- 网络出版日期:2021-08-04
2. 吉林农业大学动物科学技术学院, 吉林 长春 130118
2. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin Province, China
L. plantarum是一种兼性厌氧乳杆菌,形态呈圆端短杆状,无芽孢,革兰氏染色呈阳性,触酶阴性,能够在10–45 ℃、pH 4.5–9.5范围内生长,最适生长条件为30–35 ℃、pH 6.5左右,属兼性异型乳酸发酵[1]。L. plantarum来源安全,拥有广泛的代谢多样性,被用作各种发酵食品中的功能性发酵剂,如奶酪、植物性食品、肉制品、葡萄酒和啤酒等[2]。大量研究表明,健康成人摄取L. plantarum后可增强个体的获得性免疫[3],L. plantarum可通过NF-κB和P38 MAPK代谢信号通路调控促炎性细胞因子,进而发挥正向的免疫调节作用[4]。L. plantarum还能够使过敏原原肌球蛋白免疫活性减弱,从而为研究食物过敏原的活性控制及低致敏性水产加工制品的开发提供理论参考[5]。另外L. plantarum EPS-YW11在加工乳制品中具有用作功能性试剂的潜力,这种乳制品能够增强结构稳定性和生物活性,例如降低胆固醇、抗氧化剂和抗生物膜[6]。因此,L. plantarum对食品工业和人体健康有着多重有益的功效,具有很高的应用价值。
比较基因组分析是生物信息学中的一种常见工具,能够识别菌株及其来源之间的联系,并评估特定物种的基因分布[7],对不同生境L. plantarum进行基因组学分析,不仅可揭示菌株本身的遗传特性,对深入了解并挖掘其生物学功能也具有重要意义。同种菌的比较基因组学研究可以更深入地了解基因的改变、缺失或获得,这些变化会促使菌株在不同生态位中进化及增强环境适应性。本研究通过进行全基因组测序获得L. plantarum A8和P9详细和准确的基因组遗传信息,对2株细菌差异性进行比较,并与其他不同分离生境的同种菌株进行比较分析,一方面可以丰富L. plantarum基因组信息,另一方面为判断L. plantarum A8和P9是否具有工业应用益生菌的潜力提供参考。
1 材料和方法 1.1 实验用菌株及序列信息本实验室自主分离保藏的L. plantarum A8、P9分别分离自中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地水貂肠道和内蒙古正蓝旗育草站披碱草植株。参与比较基因组的信息均从GenBank数据库中获取,包括其他不同来源的8株L. plantarum序列以及12株乳杆菌的基因组信息,具体信息见表 1。
Strain | Size/Mb | Origin | Proteins | Level | BioSample |
Lactobacillus salsicarnum TMW 1.2098 | 2.42824 | Sausage | 5194 | Scaffold | SAMN11864207 |
Lactobacillus halodurans TMW 1.2172 | 2.84476 | Sausage | 3253 | Contig | SAMN11864209 |
Lactobacillus plantarum WLPL04 | 3.141 59 | Breast milk | 2881 | Complete genome | SAMN04092618 |
Lactobacillus plantarum -plantarum | 3.24663 | Intestine | 2865 | Complete genome | SAMN02603936 |
Lactobacillus murinus CR147 | 2.29045 | Mouse gut | 38225 | Complete genome | SAMN07690924 |
Lactobacillus quenuiae HV_6 | 1.57521 | Bee | 1509 | Contig | SAMN08331817 |
Lactobacillus plantarum LZ95 | 3.32246 | Human feces | 3026 | Complete genome | SAMN03854682 |
Lactobacillus plantarum A8 | 3.03756 | Mink Gut | 2864 | Complete genome | CP058733–CP058739 |
Lactobacillus plantarum WCFS1 | 3.34862 | Human saliva | 3 063 | Complete genome | SAMEA3138345 |
Lactobacillus plantarum DF | 3.69731 | Drosophila | 3430 | Complete genome | SAMN04346870 |
Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ | 3.30794 | Pickle | 3020 | Complete genome | SAMN02603896 |
Lactobacillus plantarum ATCC 8014 | 3.30947 | Corn silage | 3030 | Complete genome | SAMN07837328 |
Lactobacillus paraplantarumDSM10667 | 3.39575 | Beer | 6217 | Scaffold | SAMN02369508 |
Lactobacillus musae NBRC 112868 | 2.35779 | Banana | 2291 | Contig | SAMD00154527 |
Lactobacillus plantarum 5-2 | 3.23765 | Fermented soybeans | 2991 | Complete genome | SAMN02953961 |
Lactobacillus pontis LP475 | 1.71477 | Rye sourdough | 8112 | Complete genome | SAMN12784819 |
Lactobacillus pentosiphilus IWT25 | 2.72391 | Silage | 9162 | Scaffold | SAMD00042398 |
Lactobacillus curieae CCTCC M2011381 | 2.09586 | Brine of stinky tofu | 8029 | Complete genome | SAMN03175170 |
Lactobacillus kefiriDH5 | 2.48903 | Yogurt | 17317 | Complete genome | SAMN09381536 |
Lactobacillus mali LM596 | 2.61195 | Eenvironment | 2341 | Complete genome | SAMN12784790 |
Lactobacillus harbinensis M1 | 3.59219 | Naturally fermented tofu whey | 3082 | Complete genome | SAMN09915110 |
Lactobacillus plantarum P9 | 3.18547 | Grass | 2950 | Complete genome | CP058675–CP058681 |
1.2 基因组测序和草图组装
利用第二代测序技术,基于Illumina NovaSeq测序平台进行测序[8]。再进行第三代单分子测序数据拼装:将Pacbio获得的下机数据使用HGAP v4、CANU v1.7.1软件进行拼装,得到contig序列[9]。将二代的高质量数据(high quality reads,HQ reads)使用pilon v1.18软件对三代contig结果进行校正,最终拼接得到完整序列[10]。
1.3 基因组特征预测采用GeneMarkS v4.32软件对全基因序列进行基因预测[11],采用tRNAscan-SE v1.3.1、Barrnap v0.9预测全基因组中的tRNA和rRNA基因[12]。再利用CRISPR finder v20170509[13]和IslandViewer 4[14]预测全基因组中的移动原件DRs (正向重复序列)、Spacers(间隔区)和基因岛。使用COG[15]、KEGG[16]、GO[17]对细菌基因组进行快速注释,并得到相应的注释信息。最后采用CGView v1.1.0.50绘制该基因组的圈图,用Photoshop CS v8.0对该图进行编辑[18]。
1.4 比较基因组学分析 1.4.1 系统发育比较:基于16S rRNA利用MEGA 7.0软件构建邻接树(Neighbor-joining tree, NJ),参数Bootstrap值设为1000。
1.4.2 泛基因和核心基因组分析:首先,下载参考基因组的蛋白质序列,根据蛋白质序列长度进行筛选,去除序列长度低于50个氨基酸的序列。将所有待分析的蛋白质序列合并成一个文件,以该数据集为基础构建数据库,同时以该数据集作为查询,进行all-VS-all blastp分析,系列比对的阈值设置为1e-10。将序列比对的结果采用orthomcl (version 2.0.8)软件进行处理,其中序列比对的长度设置为70%,采用MCL对基因家族进行聚类,聚类所采用的Ⅰ (Inflation)设置为1.5[19]。最后,采用自制的Perl脚本对聚类得到的结果进行整理和统计。
1.4.3 全基因组序列比对:下载参考基因组序列,为了使所有基因组的起始位点能对齐,首先以其中一个基因组为参考,对其他所有基因组的起点序列进行调整。然后采用Mauve (version 2.3.1)构建获得该基因组和参考基因组的序列比对结果[20]。
下载参考基因组序列,采用MUMmer (version 3.22)软件构建两株菌的全基因组序列进行比对[21]。
2 结果和分析 2.1 基因组测序和草图组装L. plantarum A8和L. plantarum P9经二代测序获得高质量reads数目分别为7894222个和7412316个。三代测序获得总序列数量分别为173702个和197466个,基因组长度分别为1428045177 bp和1617664031 bp,具体信息如表 2。
Sample | HQ reads | Total sequence number | Total sequence length/bp |
A8 | 7894222 | 173702 | 1428045177 |
P9 | 7412316 | 197466 | 1617664031 |
2.2 基因组特征预测 2.2.1 基因组基本信息:
根据L. plantarum研究进展可知全基因组大小为2.91–3.70 Mb,GC百分含量大约为44.2%–45.1%,基因数目从2860到3599不等,通过测序的组装信息可以看出A8和P9符合L. plantarum基因组特征。同时本试验发现两者之间存在差异,即L. plantarum P9的基因组较L. plantarum A8大并且其编码的基因数量较A8多86个,而L. plantarum A8的GC含量和tRNA数量均比L. plantarum P9多,统计详情见表 3。
Sort | Origin | Gene length | Sequence type | G+C content | Open reading frame | rRNA | tRNA | ncRNA | Plasmid |
A8 | Animal | 3037561 bp | circular | 44.81% | 2864 | 16 | 71 | 0 | 6 |
P9 | Plant | 3185467 bp | circular | 44.65% | 2950 | 16 | 67 | 155 | 6 |
2.2.2 短回文重复序列分析:
短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)重复片段的间隔区可以整合到宿主基因组中,同时也可作为一种记忆元件[22]。本次在样品A8中共预测到2条存疑的CRISPRs结构,总长度为215 bp,而在样品P9中共预测到1条置信的CRISPRs结构,长度为1517 bp,详细信息见表 4。
CRISPRs | A8 | P9 |
Number of CRISPRs | 2 | 1 |
Seq ID | chr | chr |
CRISPRs type | Questionable | Confirmed |
Length/bp | 215 | 1517 |
Genome/% | 0.0071 | 0.0476 |
2.2.3 基因岛分析:
利用IslandViewer 4软件对2株L. plantarum基因岛进行分析,基因岛通常与基因的获得和丢失有关,一些获得的基因聚集在一起形成一个原本不属于自己的短区域,在这些区域中通常发现适应性功能[23]。由图 1可知,A8中含有15个基因岛,P9中含有18个基因岛。并且2株试验菌基因岛所在位置稍有不同,但主要参与复制和修复、氨基酸代谢、翻译等基本功能。如图 1所示A为A8基因岛圈图,B为P9基因岛圈图。
2.3 比较基因组学分析 2.3.1 进化树分析:
为了探究2株菌与其他12株乳杆菌之间的进化关系,将本实验室所得的2株菌与其他不同来源的L. plantarum,以及其他乳杆菌的16S rRNA构建系统发育树(图 2)。发现2株菌与其他L. plantarum在同一分支水平上,其中菌株A8、P9与菌株WLPL04和菌株DSM10667有最接近的亲缘关系。
2.3.2 不同来源L. plantarum韦恩图分析:
泛基因组主要由核心基因、辅助基因和特异基因组成[24]。将本实验室分离所得的2株L. plantarum与GenBank中所选择的8株L. plantarum进行分析,10株菌平均基因数为3178个,GC百分含量为44.1%–44.8%。10株菌共有的基因为2250个,A8独特的基因有167个,P9独特的基因190个(图 3)。十菌株各自的独特基因以参与复制、重组和修复功能的基因为主,但A8还含有参与转录过程的抗阻蛋白,以及ABC超家族ATP结合盒转运蛋白膜蛋白。P9则含有自己独特的PTS系统组成成分,用于碳水化合物的运输。
2.3.3 不同来源L. plantarum COG注释分析:
十株L. plantarum基因组大部分基因参与转录(10%)、氨基酸转运和代谢(8%)、碳水化合物运输和代谢(8%)途径,其余基因多参与复制、重组与修复(5%)、细胞壁/膜/包膜生物发生(6%)、核苷酸转运和代谢(5%)等过程。结果表明核心基因所参与的功能大多与细胞生长增殖密切相关,推测这些基因可能是在细菌长期进化过程中,在环境的作用下获得了稳定遗传(图 4)。
2.3.4 菌株A8、P9共线性分析:
Mauve分析区块的上、下代表正义链和反义链,相近颜色区块代表推测的同源区块。分析发现内部无基因组重排,仅有少量的易位,表明菌株在进化过程中发生过小范围的基因重组和转移。共线性主要反应了基因组间的结构性变异,反映出基因组之间的编码顺序和结构的同源性[25]。通过上述共线性分析,可以发现这两株菌基因的序列和顺序非常相似,具有很好的同源性和共线性(图 5)。
2.3.5 菌株A8、P9基因家族分析:
两株菌总共预测到6020个基因,其中A8有2964个基因,P9菌株有3056个基因。它们共有的基因有2643个,菌株A8、P9各自独特基因分别为321和413个(图 6)。
2.3.6 菌株A8、P9基因组COG注释:
如图 7-A所示,菌株A8、P9的核心基因除占比最大的功能未知基因外,其中9.8%基因参与转录(K)、8.9%参与碳水化合物的运输和代谢(G)、氨基酸转运和代谢(E)占比为7.8%。由此可知已知功能的核心基因主要参与物种的基本生物学功能和主要表型特征。核心基因还包括一些抗应激蛋白,比如热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)和冷休克蛋白(cold shock protein,Csp),它是连续合成并表达以克服冷休克期间冷休克的有害作用的蛋白质[26] (表 5)。并且在两株菌的质粒中发现具有相同功能的核心基因,比如参与DNA修复和重组的基因umuC,以及锰离子转运蛋白MntH。
Gene name | Type of gene | Gene copy number |
HSPs | Heat shock proteins | 1 |
cspA | Cold shock protein | 3 |
umuC | DNA polymerase V | 1 |
MntH | Manganese transport protein | 1 |
A8基因组的321个独特基因注释到COG的16个功能类别中,除未知功能基因外,参与复制、重组和修复的基因占22.7%,另参与转录和防御机制的分别占8.8%和6.4%,如图 7-B所示。再通过KEGG数据库注释后发现其独特基因主要参与DNA复制、ABC转运系统、PTS系统、磺酸盐转运系统、氨基酸生物合成等代谢通路,其中包括博来霉素水解酶(表 6)。并且通过KEGG注释到功能的基因包括以antB、ssbL为代表的27个特有基因(表 7)。
KEGG | Number of genes | |
A8 | P9 | |
Transporter | 5 | 4 |
Sulfur metabolism | 10 | 6 |
DNA replication | 3 | 4 |
Replication and repair | 2 | 5 |
Carbohydrate metabolism | 6 | 21 |
A8 | Number of genes | P9 | Number of genes |
bdh | 1 | cbi | 2 |
ssuA | 1 | cob | 1 |
NitT | 1 | hem | 2 |
antB | 2 | cys | 1 |
ssb | 2 | rpiA | 1 |
yxeP | 1 | lacZ | 1 |
coiA | 1 | sgaA | 1 |
xtmB | 1 | FruA | 1 |
recT | 1 | iolG | 3 |
mscL | 1 | iolT | 1 |
P9独特基因注释到COG数据库中的基因有336个,除未知功能基因外,其中以参与碳水化合物的运输和代谢的基因居多,有62个,占基因总数的18.4% (表 6)。而参与复制、重组和修复的基因有56个,占16.7%,参与转录的有37个基因,占比11%,如图 7-C所示。将其在KEGG数据库注释后发现这些基因主要参与磷酸肌醇代谢、磷酸戊糖途径、PTS系统、蛋白运输等代谢通路。通过KEGG注释到功能的基因包括以iolG、cbi为代表的32个特有基因(表 7)。
3 讨论L. plantarum是一种在自然界广泛存在的典型的革兰氏阳性细菌,已被广泛应用于生产和科学研究。L. plantarum A8和P9全基因组序列的获得不仅有助于丰富基因组数据库,还将为探索不同生境的同种细菌的应用提供理论依据。CRISPRs是一类独特的DNA正向重复序列家族,广泛存在于原核生物基因组中,目前的研究认为它能够给宿主提供某种获得性免疫[27]。CRISPRs序列及其相关基因构成抵御外来入侵者重要的防御系统,在抵抗外源DNA感染中发挥作用[28]。本试验通过全基因组测序发现L. plantarum A8和P9均含有CRISPR序列,这可能说明以上2株菌在应对噬菌体感染及质粒接合转移时可以发挥积极作用[29]。基因水平转移是细菌进化的重要表现,是细菌获得外源性功能基因、应对选择压力的另一种方式[30]。菌株A8和P9分别存在15和18个基因岛,并且在两者基因岛区域中均存在寡肽OPP转运蛋白(oligopeptide ABC transport)基因簇,而这种基因簇广泛分布于细菌、真菌和真核生物体内,可以穿过细胞膜转运物质,从而帮助机体更好地适应外界环境生活[31]。L. plantarum基因组移动原件不同,表明其基因组信息存在差别,推断其差别的原因可能与生存环境有关。
本试验基于16S rRNA进行系统进化分析发现,同种/不同来源的L. plantarum被聚类在一个分支,而其他不同物种乳杆菌则聚类在其他分支。与P9距离最近是来源于母乳中的菌株WLPL04,该菌株也具有肠道生存能力(酸和胆汁盐耐受性以及在模拟胃肠道中的生存能力)和益生菌特性(病原体的抑制,病原体的抗粘附性,以及对Caco-2细胞的SDS有害作用和炎性应激的防护)[32]。将与2株菌距离较近的同种不同来源的其他10株L. plantarum进行比较发现,其基因组大小、G+C百分含量表明不同来源的L. plantarum具有广泛的基因多样性。基因家族分析中核心基因主要负责物种的基本生物学功能和主要表型特征,非必需基因和特异基因主要参与次级代谢途径[33]。本试验中菌株A8和P9的独特基因有超过一半存在于它们各自的质粒中,考虑到生存环境和营养物质的特殊性等情况,推测这些特有基因非常有可能来自基因的水平转移,或者被噬菌体侵染而获得一些特殊的基因。而COG注释核心基因表明,L. plantarum可以利用或产生更多种类的碳水化合物,在恶劣环境中有更好的适应性、细胞定殖和生存能力[34]。
比较2株L. plantarum的基因组特征,泛基因集和核心基因集分别包含6020、2643个基因,其中以9.8%参与转录的基因占比最大,表明这些基因在基因组中处于不可或缺的位置,在菌株生长和繁殖过程中发挥重要作用。另外,生物调控、信号传导、生物膜形成的基因也被注释到,该类基因有利于触发菌体的群体感应,在培养基中菌体形成了很明显的生物膜,膜的形成加速了生物体间的物质和信息交流,有利于细菌适应复杂的环境[35]。
两个基因组序列都包含编码热休克蛋白和冷休克蛋白的基因,这些冷休克蛋白可能是L. plantarum菌株对胁迫条件适应的一种体现,并且在罗伊氏乳杆菌、大肠杆菌等许多细菌基因组中均有发现[36]。此外,2个基因组中还涉及辅助因子和维生素代谢的基因。这些注释基因主要参与钴胺素(维生素B12)的生物合成,还有叶酸生物合成的代谢以及硫胺素生物合成。在这些基因中,有一个由2个cbi基因(cbiM和cbiO)、1个cob基因(cobC)、2个hem基因(hemH、hemK)和1个cys基因(cysE、cysK、cysS、cysC、cys)组成的与钴胺素生物合成相关的基因群,这表明L. plantarum A8、P9能够产生钴胺素,为2株菌作为潜在的益生菌提供了理论依据[37]。另外研究表明质粒可以携带多种功能基因,比如赋予抗生素抗性和有毒重金属抗性的基因、毒力决定因子以及增强修复DNA损伤功能的基因[38]。而我们在两株菌的质粒中发现了参与DNA修复和重组的基因umuC,其具有DNA聚合酶功能,从而可以修复细胞DNA损伤。还发现了锰离子转运蛋白(MntH),它可以利用细胞内外的质子梯度作为驱动力,摄取环境中的锰离子进入细胞,并且Fe2+、Mn2+等金属离子可作为辅酶参与各种氧化还原过程,影响细菌的毒性和致病性[39]。这些结果表明抗应激蛋白和质粒中存在的损伤修复以及离子转运蛋白作为核心基因,在细菌应对外界不良环境时发挥重要作用。
氨基酸是乳酸菌生长发育过程中必需的营养因素之一,乳酸菌既具有从头合成氨基酸的能力,也会从环境中摄取蛋白质后分解用以自身蛋白质的合成、代谢能的储藏和产生以及辅助因子的循环使用。而相比于其他乳杆菌菌株,L. plantarum似乎不包含编码胞外蛋白酶Prt的基因[40],而我们的2株L. plantarum的基因组也不含有编码胞外蛋白酶基因Prt。但A8基因组中的独特基因通过KEGG数据库注释后发现,其独特基因含有多条参与氨基酸生物合成代谢的通路,其中含有一种博来霉素水解酶。博来霉素水解酶是一种进化高度保守的胞质半胱氨酸肽酶,根据作用特点,半胱氨酸水解酶分为3大类:半胱天冬酶、钙蛋白水解酶和木瓜蛋白酶,而博来霉素水解酶为木瓜蛋白酶家族的重要成员[41],并且该酶已知的活性是使糖肽博来霉素代谢失活。除此之外,作为细胞内的水解酶类,还参与免疫系统的抗原呈递和水解老年痴呆Aβ致病蛋白[42]。因为食草性动物主要采食树叶、牧草或者其他植物,只能利用非蛋白氮合成氨基酸、肽和蛋白质,因此为了满足食草动物的营养需求,推测L. plantarum A8可能参与食草性动物肠道内氨基酸的生物合成。
碳水化合物是生命细胞结构的主要成分及主要供能物质,并且有调节细胞活动的重要功能。L. plantarum P9基因组中超过18.4%的注释基因(62个基因)涉及碳水化合物代谢。注释的基因涉及利用各种碳源,例如,编码核糖5-磷酸异构酶A的rpiA基因涉及戊糖磷酸途径,编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因负责将乳糖分解为单糖涉及半乳糖代谢,编码磷酸转移酶系统的果糖特异性通透性的FruA基因涉及果糖转运、果糖和甘露糖代谢,从而可以使用不同的碳源如戊糖、半乳糖、果糖和蔗糖。L. plantarum P9含有丰富的碳水化合物利用基因可能与菌株所处环境有关,表明具有较强的糖合成能力。
采用高通量测序技术对L. plantarum A8和P9进行全基因组测序,菌株A8、P9进行比较基因分析,这两株菌基因的序列和顺序非常相似,具有很好的同源性和共线性。独特基因功能注释发现L. plantarum A8在氨基酸代谢方面具有明显优势,而L. plantarum P9则在碳水化合物利用方面表现突出。本试验结果提供了关于在该物种中观察到的遗传多样性信息,两株菌独特基因的不同显示了菌株基因组对于外界环境的适应性变化,并且两株菌具有蛋白水解和氨基酸代谢能力,为筛选具有优质应用型益生菌添加剂菌株提供理论基础。
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