枯草芽孢杆菌是广泛存在的益生菌，具有较强的抗逆性^[1-2]，口服进入机体肠道后能拮抗病原菌粘附^[2]、促进黏膜淋巴组织发育和诱导黏膜IgA抗体反应，因此是良好的黏膜免疫增强剂^[3-4]，但目前对其调节黏膜免疫的机制尚不明确。

树突状细胞(dendritic cell，DC)作为天然免疫系统的“哨兵”，不仅能在黏膜组织捕获抗原，而且活化后能向淋巴结迁移，刺激T、B淋巴细胞免疫应答^[5-7]。尽管肠道DC能利用其树突摄取肠黏膜的枯草芽孢杆菌，迁移至引流淋巴组织激发免疫反应^[8]，但口服枯草芽孢杆菌进入肠道后接触的主要是肠上皮细胞，如何有效活化黏膜下层的DC尚不明确，因此研究枯草芽孢杆菌活化DC的具体机制具有重要意义。

肠上皮细胞作为肠道抵抗病原的第一道屏障，能通过模式识别受体识别病原相关分子模式^[9]，分泌多种细胞因子(IL-6、IL-5、IFN-γ和IL-33)，从而活化黏膜下DC、巨噬细胞和淋巴细胞。IL-33是IL-1家族的一种细胞因子^[10-11]，不仅能作为免疫佐剂促进抗体应答反应和病原清除^[12]，还能上调黏膜下DC表面共刺激分子的表达，促进DC分泌促炎细胞因子^[13-14]。尽管多种黏膜免疫增强剂都能刺激IL-33表达^[15]，但口服枯草芽孢杆菌能否刺激肠上皮细胞产生IL-33及其在活化黏膜下层DC中的作用尚不清楚。为此，本研究先用枯草芽孢杆菌刺激小鼠肠上皮细胞系，然后将细胞培养上清与小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)进行共孵育，利用RNA干扰技术证明IL-33在活化BMDC中发挥重要作用，为阐明枯草芽孢杆菌促进黏膜免疫应答的具体机制提供了科学依据。

1 材料和方法 1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌168购自武汉淼灵生物公司；小鼠结肠癌细胞系(CMT93)由扬州大学阴银燕老师惠赠；4–6周龄C57BL/6J小鼠购自扬州大学实验动物中心；RPMI 1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；青霉素、链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和小鼠重组白介素4 (rmIL-4)购自南京巴傲德生物科技公司；脂质体(Lipofectamine 3000)购自赛默飞世尔科技公司；PE标记羊抗小鼠CD40单克隆抗体、FITC标记羊抗小鼠MHC Ⅱ单克隆抗体、PE标记羊抗小鼠CD80单克隆抗体、FITC标记羊抗小鼠CD86单克隆抗体及对应的同型对照抗体购自美国BD公司；细胞活力检测试剂盒(CCK-8剂盒)和小鼠IL-33 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；细胞RNA提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；反转录试剂盒和荧光定量PCR酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 枯草芽孢杆菌对CMT93细胞的毒性检测

将枯草芽孢杆菌168接种于LB培养基中37 ℃培养过夜，离心收集细菌，无菌PBS离心洗2次后涂琼脂平板，37 ℃培养过夜后进行菌落计数，用PBS悬浮备用。将含10%胎牛血清(FBS)和2%青霉素、链霉素的DMEM分装96孔板，加入CMT93细胞，5×10⁴个细胞/孔，CO₂培养箱37 ℃培养至满层。按1×10⁵、1×10⁴、1×10³ CFU/孔加入枯草芽孢杆菌，37 ℃孵育24 h。加入CCK-8溶液，10 μL/孔，37℃避光孵育2 h，用酶标仪测定OD₄₅₀值。细胞活性(%)=(OD_{枯草芽孢杆菌}– OD_{细胞培养基})/(OD_阴性孔–OD_{细胞培养基})×100。

1.3 枯草芽孢杆菌刺激与细胞因子ELISA检测

将含10% FBS和2%青霉素、链霉素的DMEM分装12孔板，接种CMT93细胞，5×10⁵个细胞/孔，37 ℃培养至细胞满层。按1×10⁵ CFU/孔加入枯草芽孢杆菌，37 ℃孵育24 h。收获细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IFN-γ、IL-12、IL-1β和IL-33表达水平。

1.4 IL-33表达荧光定量PCR检测

如前进行CMT93细胞培养，长满单层后加入枯草芽孢杆菌，接种剂量分别为1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴ CFU/孔，孵育24 h后分别收集细胞和培养液。细胞培养上清10000 r/min离心10 min，用0.22 μm滤膜过滤后备用。用细胞RNA提取试剂盒提取细胞RNA，用PrimeScript^TM RT Mix反转录试剂盒反转录得到cDNA。用荧光定量PCR检测IL-33转录水平，正、反向引物序列分别为5′-GTTCTGGAGACTACAGCGCA-3′和5′-TTTG CCGGGGAAATCTTGGA-3′，内参(GAPDH)正、反向引物分别为5′-GGCTGTATTCCCCTCCATC G-3′和5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。PCR程序为：恒温段95 ℃ 30 s；循环段95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；熔解段95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.5 小鼠BMDC制备与培养

颈椎脱臼处死C57BL/6J小鼠，无菌分离股骨和胫骨。注射器吸取RPMI 1640培养基冲洗骨髓至无菌离心管中，1500 r/min离心10 min，弃上清。沉淀细胞加入1 mL红细胞裂解液混匀，孵育1 min后加入5 mL RPMI 1640培养基，1500 r/min离心10 min，弃上清。细胞用含10% FBS、10 ng/mL rmGM-CSF、10 ng/mL rmIL-4和1%青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基重悬，接种6孔细胞培养板，CO₂培养箱37 ℃培养60 h后换液，继续培养5 d，收集未活化的BMDC。

1.6 BMDC活化标志的流式细胞术检测

将BMDC接种24孔板，5×10⁵细胞/mL，用上述细胞培养液培养24 h后收集细胞，1500 r/min离心10 min，弃上清。细胞用适量PBS洗涤2次，每孔细胞用100 μL PBS重悬。按照使用说明书分别加入PE标记羊抗小鼠CD40单克隆抗体、FITC标记羊抗小鼠MHCII单克隆抗体、PE标记羊抗小鼠CD80单克隆抗体、FITC标记羊抗小鼠CD86单克隆抗体以及对应的同型对照抗体，4 ℃孵育30 min，PBS清洗2次后进行流式细胞术检测。

1.7 siRNA干扰CMT93细胞的IL-33基因表达与检测

用网络在线软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/insert.do)设计3条小鼠IL-33 siRNA序列，靶向序列分别为AGACTC CGTTCTGGCCTCACCATAA(222)、GCTGCGT CTGTTGACACATTGAGCA(384)和ACACAGA CATCTGGCTGCATGCCAA(643)，经过预实验筛选发现siRNA 384的干扰效果最佳。将CMT93细胞接种6孔板，按照Lipofectamine 3000说明书进行siRNA384转染，30 pmol/孔。转染后36 h收集细胞，接种12孔板，待细胞贴壁后加入枯草芽孢杆菌，1×10⁶ CFU/孔。CO₂培养箱37 ℃孵育24 h后收集细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测IL-33表达水平。按1.6方法分离培养未成熟BMDC，与CMT93细胞培养液孵育24 h后收集BMDC，用流式细胞术检测进行BMDC活化表型检测。

1.8 数据处理及分析

数据均采用平均值±标准误表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，采用单因子方差分析进行差异显著性检验。

2 结果和分析 2.1 枯草芽孢杆菌对CMT93细胞的毒性检测

从图 1可以看出，与不同剂量的枯草芽孢杆菌孵育24 h后，CMT93细胞的活性无明显改变。

2.2 枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞的细胞因子表达检测

将枯草芽孢杆菌168与CMT93细胞共孵育24 h，收集培养上清用ELISA检测IL-6、IFN-γ和IL-33表达水平。从图 2可知，枯草芽孢杆菌刺激能显著促进CMT93细胞分泌IL-6、IFN-γ和IL-33，但不能显著促进IL-12和IL-1β表达。

2.3 枯草芽孢杆菌刺激CMT93表达IL-33的剂量依赖性

用不同浓度枯草芽孢杆菌与CMT93细胞进行共孵育，24 h后分别收集细胞和培养上清，分别用荧光定量PCR和ELISA检测IL-33表达水平。从图 3可以看出，枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞的IL-33表达具有明显的剂量依赖性。

2.4 细胞因子激活BMDC的表型检测

用不同浓度枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞，收集培养上清与BMDC共孵育24 h，用流式细胞术进行激活表型检测。从图 4可以看出，与空白对照组相比，枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞产生的细胞因子能上调BMDC的CD40 (A)、CD80 (B)、CD86 (C)和MHCII (D)表达，并具有枯草芽孢杆菌剂量依赖性。

2.5 siRNA抑制CMT93细胞的IL-33表达检测

将IL-33基因特异siRNA转染CMT93细胞，转染后24 h用高剂量枯草芽孢杆菌刺激，用ELISA检测细胞培养上清中的IL-33表达水平。结果与正常CMT93细胞相比，siRNA转染细胞培养上清中的IL-33表达量显著降低(图 5)。

2.6 IL-33表达抑制对活化BMDC的影响

在IL-33基因特异性siRNA转染后，用高剂量枯草芽孢杆菌刺激CMT93细胞，流式细胞术检测BMDC活化表型。结果与正常CMT93细胞培养液相比，IL-33基因特异性siRNA转染细胞在枯草芽孢杆菌刺激后，其培养上清上调BMDC活化的能力降低(图 6)。

3 讨论

黏膜疫苗接种可以同时诱导黏膜和全身免疫反应^[16-17]，但黏膜免疫系统的复杂性和屏障作用制约着黏膜疫苗的研发。枯草芽孢杆菌具有黏膜免疫增强作用，其表面展示的病毒抗原能有效诱导黏膜局部和全身免疫应答^[18]，但具体的免疫应答机制还有待进一步研究。枯草芽孢杆菌168是全基因组最早测序的枯草芽孢杆菌^[19]，已被用作黏膜免疫佐剂^[20]。例如，口服枯草芽孢杆菌168分泌的抗菌肽(sublancin)能激活小鼠肠道巨噬细胞、减轻免疫抑制和诱导平衡的Th1和Th2免疫应答^[21]。口服和鼻内接种表面表达或吸附梭状芽孢杆菌FliD抗原的枯草芽孢杆菌168都能诱导小鼠产生抗原特异性IgA抗体^[22-23]。然而，枯草芽孢杆菌增强黏膜免疫应答的具体机制还有待深入研究。

枯草芽孢杆菌增强黏膜免疫应答的可能机制包括黏膜下DC伸出树突直接摄取枯草芽孢杆菌从而活化DC^{[8, 18]}，或者通过刺激肠上皮细胞分泌细胞因子间接激活DC^[24]。为了阐明这一问题，本研究用枯草芽孢杆菌168刺激小鼠肠上皮细胞系^[25-26]，结果显示枯草芽孢杆菌能显著刺激CMT93细胞分泌IFN-γ、IL-6和IL-33等细胞因子，而且具有枯草芽孢杆菌剂量依赖性。将含细胞因子的CMT93细胞培养液与BMDC进行共孵育，结果显示能显著活化BMDC，提示枯草芽孢杆菌可能通过刺激肠上皮细胞产生细胞因子活化DC。

IFN-γ、IL-6和IL-33都是能活化DC的细胞因子^[24]，其中IL-33是新发现的IL-1家族成员，不仅参与局部炎症、过敏反应和免疫应答^[27-28]，还能促进DC分化成熟^{[11-12, 15, 29]}。为了阐明枯草芽孢杆菌刺激肠上皮细胞分泌的IL-33在激活DC中的作用，本研究先用siRNA干扰CMT93细胞的IL-33基因表达，经枯草芽孢杆菌刺激后，再用细胞培养上清与BMDC进行共孵育，结果显示细胞培养上清活化BMDC的能力显著降低，提示IL-33是活化BMDC的主要细胞因子，枯草芽孢杆菌可能通过刺激肠上皮细胞分泌IL-33来活化黏膜下DC。