锌是大部分细菌所必需的微量元素，具有催化、氧化还原和调节等作用^[1]。它的高结合亲和力可导致竞争性金属错配，过量时会使细胞中毒，因此胞内锌离子浓度的动态平衡对细菌的正常生长至关重要^[2-4]。细菌中ZntR蛋白[Zn(Ⅱ)-responsive transcriptional regulator]属于MerR家族，是7个主要金属响应蛋白家族-锌响应转录调节因子之一^[5]。ZntR表达的蛋白能以类似MerR蛋白的方式促进RNA聚合酶结合znt (zinc resistance operon znt)的启动子^[6]。同时，ZntR蛋白还可以感应胞内锌离子浓度与ZntR蛋白结合，激活锌离子外排基因zntA将多余的锌泵出，从而维持胞内锌稳态^[7-8]。研究发现，金属诱导的zntA的表达受zntR调节，并且zntA和zntR突变体对镉离子高度敏感，对钴离子的敏感性相对较小。zntA的失活会增加细胞内镉和钴的积累，导致细胞中毒甚至死亡^[9-10]。但是由于细菌的种类不同，zntR的作用可能也不尽相同甚至相反，而目前对zntR操纵子对细菌生理功能影响的研究还鲜有报道。

嗜水气单胞菌是一种人-畜-鱼共患的重要病原菌，其生存范围广，可适应如淡水、土壤或者重金属污染等多种复杂环境。该菌可导致人体、水生和陆生动物感染并发生出血性疾病，在温暖的淡水养殖鱼类中引起运动性气单胞菌败血症，影响淡水养殖生产^[11]。本研究利用同源重组的方法构建zntR敲除菌株及补救株∆zntR::zntR，以野生型A.h和空载∆zntR::vertor为对照，对其生理功能进行测定，并结合定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异，最后结合生物信息学和生理表型分析zntR基因在细菌的生命活动中可能参与的调控机制，为进一步探究嗜水气单胞菌的防治提供理论基础。

1 材料和方法 1.1 材料

本实验使用的嗜水气单胞菌ATCC7966 (Aeromonas hydrophila，A.h)、大肠杆菌及质粒均保存在本实验室。LB培养基：蛋白胨、胰酵母粉(购于北京拜尔迪生物技术有限公司)、氯化钠(购于国药集团化学试剂有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA marker (DL2000和DL5000)、Sac I和Xba I限制性内切酶均购于宝生物工程(大连TaKaRa)有限公司；DNA聚合酶、氯霉素(chloramphenicol，Cm)和氨苄青霉素(ampicillin，Amp)均购于上海翊圣生物科技有限公司；多片段无缝连接酶购于南京诺唯赞生物科技有限公司；核酸染料、甘油、蔗糖和琼脂糖(Agarose B，Low EEO)均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 构建缺失菌株及回补株

对嗜水气单胞菌基因组中zntR基因上下游各500 bp序列设计2对引物，分别为P1P2、P3P4。将这2个上下游片段分别扩增出来，并用无缝连接酶将酶切后的质粒与上下游片段连接起来，再转入大肠杆菌MC1061感受态细胞中，而后提取质粒再转入大肠杆菌S17感受态细胞中。将转化质粒成功的大肠杆菌S17与野生株(A.h)进行同源重组。再利用含有20%蔗糖的LB培养基进行筛选，用引物P5P6、P7P8 (目的基因两端设计引物分别为P5、P6；P1上游100 bp、P4下游100 bp设计引物分别为P7、P8)进行PCR验证，并以总DNA为阴性对照。经测序比对正确后获得敲除菌∆zntR。

设计嗜水气单胞菌中zntR基因的克隆引物(命名为zntR-F和zntR-R)进行扩增。以pBBR1-MCS1质粒为载体，将目的片段与酶切回收后的质粒进行连接，再将连接产物转化到感受态细胞DH5α感受态细胞中。第2天从转化成功后的平板中挑取单克隆进行菌液PCR验证，后提取质粒并测序比对。测序结果完全正确的质粒利用电转化法转化到∆zntR感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR验证并测序比对。质粒成功转入∆zntR缺失菌株中(pBBR1-MCS1通用引物：F和R)，获得回复和空载菌株。

1.3 泳动(Swimming)和群集运动(Swarming)能力检测

分别配制含0.3%琼脂粉和0.6%琼脂粉的LB培养基(分别为泳动培养基和群集运动培养基)，121 ℃灭菌20 min冷却至室温后分别倒入平板中。将培养好的划在LB平板中的单克隆点在倒好的平板中，做好标记，正放平板置于30 ℃培养箱中培养。泳动培养4 h，群集运动培养12 h，后取出拍照并记录实验结果。

1.3.1 生物被膜生成的测定:

将OD₆₀₀=1.0的菌株按5%转接至96孔微量板中，每孔200 μL，每个菌株做4个重复孔，置于30 ℃培养箱中培养24 h，后去除培养液，用双蒸水洗涤3次，每孔中加入200 μL的0.1% (W/V)结晶紫溶液，染色20 min后，去除染色液，再用双蒸水洗涤3次后吹干，每孔中加入200 μL的95%乙醇溶液，室温孵育10 min后用SpectraMax^® i3多功能酶标仪(molecular devices)检测在OD₅₉₅波长下的吸光值，并做3次生物学重复。

1.3.2 溶血性检测:

配制含有0.8%琼脂粉的LB培养基，121 ℃灭菌20 min后冷却至室温，加入7 mL绵羊血混匀后再倒入平板中。凝固后用10 μL枪头分别在每个平板中打3个小孔，将OD₆₀₀=1.0的菌株各取3个10 μL菌液分别加入平板中的3个小孔中。倒置平板后置于30 ℃培养箱中培养16 h后，测量溶血圈直径大小。

1.3.3 金属离子胁迫检测:

配制含有1.5%琼脂粉的M9培养基(0.5 g的NaCl，1.0 g的NH₄Cl，3.0 g的KH₂PO₄，17.1 g的Na₂HPO₄·12H₂O，4.0 g的葡萄糖溶于1 L的双蒸水中)灭菌15 min后冷却至室温，分别加入不同浓度的金属离子：氯化钴(CoCl₂)、重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)、硫酸锌(ZnSO₄)，制备成含不同浓度的固体平板。将OD₆₀₀=1.0的菌株稀释100倍后，各取2 μL分别点在不同浓度不同金属离子的平板中，置30 ℃的培养箱中培养16 h后取出记录其生长情况。

1.3.4 蛋白样品制备:

挑取A.h和∆zntR单克隆至5 mL LB培养基中，30 ℃摇床中过夜培养16 h至稳定状态后，第2天按1%转接至30 mL LB培养基中，30 ℃摇床中培养至OD₆₀₀=1.0时取出，4 ℃、8000 r/min离心10 min收集菌体并用PBS缓冲液洗涤2次。后加入1 mL的lysis buffer (6 mol/L尿素和2 mol/L硫脲溶解于0.1 mol/L的Tris-HCl (pH 7.6)溶液，并加入蛋白酶抑制剂)混匀，置于冰上并在超声波破碎仪中超声破碎15 min至呈现透明液体。最后10000×g、4 ℃离心20 min取上清，并取5 μL用于Bradford法进行蛋白浓度的测定，剩余样品用于质谱鉴定。

1.3.5 胰蛋白酶消化和LC-MS/MS鉴定:

取50 μg蛋白样品至超滤管中，用50 mmol/L二硫苏糖醇DTT、56 ℃进行还原40 min，再用25 mmol/L碘乙酰胺IAA、避光静置进行烷基化30 min，离心弃滤液按1︰20加入胰蛋白酶，37 ℃孵育过夜降解成多肽。将处理好的多肽样品用C₁₈柱(Waters，Inc.，Milford，MA)除盐，并使用CentriVap Concentrator (Labconco，Inc.，Kansas City，MO)干燥。

酶解完的肽段用液相色谱流动相A相(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解后使用LC-20AB HPLC Pump system (Shimadzu，Kyoto，Japan)色谱仪进行分离。分离液相梯度设置：0–0.1 min，流动相B液(含0.1%甲酸和80%乙腈的水溶液)从2%上升至5%；0.1–20.0 min，B液从5%上升至30%；20–22 min，B液从30%上升至80%；22–24 min，B液维持在80%；24.0–24.1 min，B液从80%到5%线性降低；直到30 min后结束。其次，反相液质联用(RPLC-MS)进行样品分析。利用Eksigent nano LC425 (SCIEX，USA)色谱系统串联Thermo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行蛋白定量。离子源电压设置为2.0 kV；离子源温度为150 ℃；循环时间设置为3 s；GSI设置为4以及帘气为30 psi。一级质谱扫描范围设置为350–1400 m/z，扫描分辨率设置为60000；Orbitrap扫描分辨率设置为15000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。质谱采集到的DDA原始数据导入到Spectronout Pulsar X (Biognosys，Schlieren，Switzerland)建立DDA谱图库，默认最优参数“BGS factory setting”进行建库。然后将DIA原始数据导入到Spectronout Pulsar X进行蛋白质定性定量分析。

1.3.6 生物信息学分析:

以野生型为对照，筛选肽段数目大于1，P＜0.05，且将蛋白比值大于1.5倍或小于0.667倍的蛋白作为差异表达蛋白进行生物信息学分析。首先通过David (https://david.ncifcrf.gov/)在线软件对差异表达蛋白进行KEGG富集分析，并结合病原菌毒力因子数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm，VFDB)进行毒力基因筛选，再利用Rstudio软件进行可视化分析。

1.3.7 Western blotting:

根据数据分析结果以及实验室现有抗体筛选差异蛋白，进行Western blotting验证。将相应蛋白样品跑SDS-PAGE，利用BIO-RAD半干转膜仪(程序：25 V，15 min)将蛋白胶里的蛋白样品转移到PVDF膜上；转膜结束后利用PBST洗膜5 min后，加入封闭液室温孵育1 h；封闭结束后，加入一抗，4 ℃孵育过夜，或者室温孵育1 h；然后用PBST缓冲液洗5次，每次5 min；加入二抗，室温孵育1 h后用PBST缓冲液洗5次，每次5 min；ECL显色。

2 结果和分析 2.1 基因缺失突变菌株的筛选和鉴定

以野生型嗜水气单胞菌为阳性对照，根据表 1所示进行引物设计。实验结果如图 1-A所示，泳道3和4是用P5P6引物分别以野生株和敲除株全基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物，从图中可以看出泳道3在250–500 bp有目的条带，而泳道4则没有，说明敲除株的基因组中不含有目的基因。为了进一步验证同源重组成功，在嗜水气单胞菌基因组上邻近上下游同源臂的地方截取一对新的引物P7P8，以野生菌和敲除菌的全基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别如图 1-A的泳道1和2所示，泳道1和2 PCR产物大小的差值约为1200 bp，与预计值相符，进一步测序比对验证可靠性，从而获得敲除株∆zntR。

以野生株全基因组DNA为模板进行PCR扩增回复片段，利用电转化法，把构建好的质粒及pBBR1-MCS1质粒分别转化到∆zntR感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR验证，分别如图 1-B的泳道1和2所示，泳道1和2 PCR产物大小的差值约为438 bp，表明质粒成功转入∆zntR缺失菌株中，获得回复和空载菌株。

2.2 ∆zntR对嗜水气单胞菌运动性的影响

细菌泳动和集群运动是细菌在液体环境和半固体环境中运动能力的指示，它们都是以鞭毛为导向的运动行为，而细菌的运动能力也与病原菌的致病性密切相关。本研究以野生株A.h为对照，使用0.3%和0.6%半固体LB平板分别检测zntR基因缺失后和补救后细菌的泳动和集群运动能力。结果发现，zntR缺失后，在0.3%和0.6%半固体LB平板上均形成明显的泳动圈，而在其补救菌株中泳动圈层又得到回复(图 2-A，B)，表明zntR基因的缺失增强嗜水气单胞菌的泳动能力和群集运动能力。

2.3 ∆zntR对嗜水气单胞菌生物被膜生成的影响

生物被膜是由细菌及其分泌的胞外基质组成，生物被膜的形成可以保护细菌免受物理、化学或机体免疫反应的攻击。本研究以A.h野生株为对照组，利用0.1%结晶紫染色方法对∆zntR敲除株的生物被膜形成能力进行检测。结果发现，zntR的缺失使嗜水气单胞菌生物被膜形成能力显著下降(图 2-C)。

2.4 ∆zntR对嗜水气单胞菌溶血活性的影响

细菌的溶血活性与其致病性密切相关，为研究zntR基因是否会对致病菌嗜水气单胞菌的溶血活性产生影响，本研究以A.h野生株为对照组，利用含5%绵羊血平板对∆zntR敲除株的溶血活性进行测定。发现∆zntR敲除株的溶血圈显著大于野生株(图 2-D)，表明zntR的缺失可能对细菌的致病性具有一定的负调控作用。

2.5 ∆zntR响应金属离子胁迫的影响

虽然金属离子在所有生物有机体中都发挥着重要作用，但是高浓度的金属离子会对细胞产生很强的毒性。因此，本研究检测嗜水气单胞菌野生型、zntR缺失菌株、补救株和空载菌株在金属离子胁迫下的生长情况，进而探讨这些转录调控因子是否参与金属离子运输的调控。结果显示，与野生型相比，zntR对1 mmol/L的Zn₂SO₄和50 μmol/L的K₂Cr₂O₇表现出较强的耐受性，对300 μmol/L的CoCl₂表现更为敏感，其补救菌株则能恢复其表型(图 2-E)，表明转录调控因子zntR参与细菌应对金属离子胁迫的调控过程。

2.6 ∆zntR对嗜水气单胞菌蛋白表达的影响

本研究利用DIA定量蛋白质组学技术，研究嗜水气单胞菌zntR的缺失对嗜水气单胞菌蛋白表达丰度的影响。通过收集A.h野生株和∆zntR敲除株的全蛋白，使用胰蛋白酶消化成多肽后再进行质谱鉴定。根据肽段匹配数≥2和错误发生率(FDR)＜1%双标进行筛选，共鉴定到2655个蛋白(表 2)。相关性分析发现各个样本的相关系数R均大于0.98 (图 3-A)，表明此次蛋白组学数据稳定、可靠，∆zntR与A.h在生物学之间存在极相关。同时通过以野生菌A.h为对照且以P < 0.05、差异倍数≥1.5或≤0.667标准筛选差异蛋白，共鉴定到了83个差异蛋白，其中56个蛋白上调表达，27个蛋白下调表达(图 3-B)。

2.7 ∆zntR中差异蛋白生物信息学分析

为了更好地了解∆zntR对嗜水气单胞菌生理生化过程的调控作用。本研究利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)在线网站对差异表达蛋白的KEGG代谢通路进行富集分析，并结合R语言软件进行可视化分析。发现敲除zntR基因后共富集到6个代谢通路，其中核糖体、双组分系统、细菌的趋化性、苯乙烯降解和β-内酰胺耐药代谢通路占主导位置，且代谢通路相关蛋白大部分都是上调表达(图 4-A)。

通过病原菌毒力因子数据库对差异蛋白进行毒力基因的筛选，结果共匹配到15个毒力因子，其中AHA_0388、AHA_2809、pilF、AHA_0389在敲除zntR基因后表达下调，其余均表达上调(图 4-B)。

2.8 Western blotting验证定量蛋白质组学结果

为了验证定量蛋白质组学数据的可靠性，利用课题组已有的2个差异蛋白特异性抗体进行Western blotting验证。结果显示，在转录调控因子zntR缺失菌株中，Western blotting验证差异蛋白的表达情况与定量蛋白质组学的结果基本一致(图 5)，证实了质谱数据的可靠性。

3 讨论

众所周知，转录调控因子参与调控细菌各种生理生化过程，以此响应复杂的外界胁迫环境^[12-14]。人们对原核生物基因转录调控进行全局分析时发现原核生物具有复杂的调控机制，可通过转录因子的作用来调节基因转录过程^[15-17]。ZntR是一个Zn(Ⅱ)-反应性转录调节因子，也属于转录激活因子MerR家族蛋白^[18]。在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，zntR突变体对CdCl₂和ZnCl₂高度敏感，对CoCl₂的敏感性较低，但不影响细菌毒力^[5]；在假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)中zntR对Ⅵ型分泌系统(T6SS)有正向调节作用，参与对宿主细胞的毒力和细胞间的相互作用，且在维持胞内锌稳态、控制活性氧浓度以防止细菌在氧化应激下的死亡中起重要作用^[19-20]。

本研究通过对嗜水气单胞菌zntR缺失菌株生理表型的分析，进一步利用基于DIA模式的定量蛋白质组学技术对∆zntR的差异蛋白进行比较分析，进而结合细菌毒力相关表型和响应环境胁迫的结果，探讨该转录调控因子可能参与调控细菌毒力和响应各种金属离子胁迫的内在机制。研究首先发现，zntR基因缺失后对锌和铬离子胁迫敏感，对钴离子胁迫耐受，后续蛋白质组学数据中也发现zntR缺失导致锌离子外排ZntA蛋白显著下降，提示嗜水气单胞菌中ZntR也和以往研究结果类似，通过调控ZntA蛋白将多余金属离子泵出胞外^[21-22]；此外，表型分析还发现缺失株的泳动和群集运动能力增强、生物被膜形成能力减弱、溶血活性增强，表明嗜水气单胞菌中的zntR除了参与金属离子的动态平衡以外，可能还参与调控细菌其他的生理功能；进一步通过KEGG代谢通路对差异蛋白进行生物信息学分析，结果发现12个细菌趋化性过程的相关蛋白(例如AHA_1470、AHA_1784、AHA_1602等)均表达上调、23个双调节系统相关蛋白(例如AHA_4192、AHA_3031、AHA_4256)表达上调或下调，而细菌趋化性和双调节系统与细菌运动能力和生物膜合成能力密切相关，这可能是zntR缺失导致泳动、群集、以及生物膜形成能力发生变化的原因之一^[23]。此外缺失菌株与对照相比有15个毒力相关基因发生显著性差异，提示zntR调控胞内毒力因子相关蛋白的表达，可能参与细菌的毒性调控过程，并导致细菌溶血性发生改变。

4 结论

本论文通过同源重组的方法成功构建了嗜水气单胞菌ATCC7966中的zntR敲除株。对A.h、∆zntR、∆zntR::vertor和∆zntR::zntR菌株之间响应金属离子胁迫进行检测比较，发现存在显著性差异，表明zntR基因可能在响应金属离子胁迫过程中发挥重要作用。此外，zntR基因的缺失导致细菌的泳动和群集运动能力均显著增强，生物被膜形成能力显著减弱。这些结果表明：zntR基因可能参与嗜水气单胞菌生命活动中的多个调控机制。