近年来，大量工业污水排放使水体环境中的重金属含量严重超标，破坏了水生生态系统，而且通过食物链威胁着人类健康^[1]。在重金属污染中不只是某一种重金属，而是众多重金属的共同存在，重金属之间加和、协同和拮抗等效应使重金属污染的评价和监测更加复杂困难^[2]。镉和铬是植物生长的非必需元素，也是铬矿冶炼、耐火材料、电镀、制革、颜料和化工等工业生产以及燃料燃烧排出的废气、废水及废渣等的典型污染物^[3]。三价铬是人体必需元素，低剂量的情况下，在促进合成胰岛素和葡萄糖代谢过程中有重要作用，但在超过一定阈值的高剂量情况下，会对生命体造成严重的毒害，甚至死亡。镉通常以硫酸盐形式出现，被认为是IA级致癌物，对人类产生“三致性”危害(致癌、致畸、致突变)，浓度较高时会对机体造成严重的毒害作用^[4-5]。

在各类水生生物中，微藻对重金属胁迫相对敏感，主要包括生长代谢受阻、光合作用受影响、细胞色素减少，膜脂质过氧化、细胞畸变甚至中毒死亡等^[6]。已有研究表明，当过量重金属进入水体后，会对藻类植物产生毒害作用，因此检测藻类生长情况、细胞组成和抗氧化酶系统等对研究污染水体中重金属对水生植物产生的毒性作用具有重要意义^[7]。普通小球藻(Chlorella vulgaris)是地球进化过程中出现最早的生物之一，具有分布广、种类多、繁殖速度快和生长周期短等特点，同时也是水质检测的指示生物之一。目前，关于重金属对藻类的毒害作用的研究普遍较多，主要集中于各类单一重金属对藻类的毒性效应^[8-9]、生长生理^[10-11]、耐受性和吸附性^[12-13]等方面的研究，对有关复合重金属毒害作用的研究非常少。因此在之前的研究基础^[14-15]之上选取镉和铬，研究其在不同浓度的单一和复合情况下，对小球藻的生长及生理的影响，为研究水体重金属污染对水生植物的迫害提供参考依据，同时也为利用藻类净化重金属污染水体提供一定的理论基础。

1 材料和方法 1.1 实验材料

普通小球藻(Chlorella vulgaris)购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB-8)，CdCl₂·2H₂O (分析纯AR)和CrCl₃·7H₂O (分析纯AR)提供重金属离子。

主要仪器：LDZX-40B1型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安)；超净工作台(江苏苏净)；恒温光照摇床(江苏太仓)；TDL-5000B低温冷冻离心机；美国PE原子吸收光谱仪(AA800)；日立UV-1800可见紫外分光光度计；电子天平(日本岛津)；酸度计(美国奥利龙)；GY92-2D超声波细胞破碎仪(浙江宁波)。

1.2 培养方法

将分别添加不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 mg/L)的单一和复合重金属离子(含量为1:1) Cr³⁺和Cd²⁺的SoilEM培养基^[14]各90 mL装于250 mL的三角瓶中，以不加任何重金属离子的培养基为空白对照，每个处理设置3个平行，灭菌后加入10 mL培养至指数期的藻种进行接种，放置在恒温光照培养箱内，温度为(25±1) ℃，转速为150 r/min，光照强度3000 Lux，光暗比12 h: 12 h，pH 6.5，每天手动摇动2次随机摆放，连续培养6 d。

1.3 检测方法

将小球藻在恒温摇床上连续培养6 d后，取培养结束后的各处理组藻液离心(12000 r/min，20 min)，弃去上清液，用pH 7.8的PBS缓冲液将沉淀洗涤下来，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(400 W，10 min，超声时间5 s，间歇时间5 s)，收集细胞破碎液备用。

普通小球藻光密度与藻类生物量的对应关系参考Wan等^[16]的方法；EC₅₀ (半数效应浓度)计算参考刘益浩^[17]的方法；采用热乙醇和超声波结合法^[18]测叶绿素a的含量；丙二醛测定选用硫代巴比妥酸法^[19]；参考Sergiev等^[20]的方法测定H₂O₂的含量；氮蓝四唑(NBT)法^[21]测SOD，CAT活性的测定参考Aebi等^[22]方法，Rao等^[23]的方法测定POD酶活性。

1.4 数据统计与分析

运用Origin 8.0软件作图，SPSS 22.0统计学软件对实验数据进行分析。

2 结果和分析 2.1 不同浓度的Cr³⁺和Cd²⁺胁迫对小球藻生物量的影响

由图 1-A可知，随着小球藻生物量的不断增长，其相应的光密度值也不断增大，通过对藻细胞的光密度值与其生物量进行线性方程拟合可知其呈正线性相关关系(R² > 0.99)，由此可以说明藻细胞的光密度值可以反映藻生物量。

在相同初始生长情况下，连续培养5 d后发现在单一Cr³⁺或Cd²⁺胁迫下，其浓度在0.1–1.0 mg/L范围内，小球藻的生物量较对照组呈增长趋势，1 mg/L时生物量最大且相对于对照组分别高出15% (图 1-B)和18% (图 1-C)；当浓度大于1 mg/L时，藻生物量呈明显降低趋势，在培养第4天后藻生物量增长缓慢，第5天相比于第4天只增长了0.01。Cr³⁺和Cd²⁺复合胁迫下，藻生物量整体低于对照组(图 1-D)，说明两者可能发生了加和作用；当重金属离子浓度为1 mg/L时，其生物量仅次于复合胁迫下的对照组；重金属离子浓度低于1 mg/L时，藻生物量逐渐降低，大于1 mg/L时，小球藻生长随浓度的增大受到更严重的抑制。这一研究结果表明小球藻对单一和复合Cr³⁺和Cd²⁺均有一定的耐受性，且在一定浓度下有益于其生长，而高浓度则会严重影响小球藻的正常生长。通过计算Cr³⁺和Cd²⁺对小球藻胁迫96 h后的半数效应浓度(EC₅₀)，得出单一的Cr³⁺和Cd²⁺胁迫96 h后小球藻的EC₅₀分别是19.76 mg/L和15.26 mg/L，复合胁迫96 h后小球藻的EC₅₀为8.04 mg/L，可知其半数抑制浓度大小为Cr³⁺ > Cd²⁺ > Cr³⁺+Cd²⁺，由于毒性的大小与EC₅₀成反比，所以得出它们的毒性大小顺序为Cr³⁺+Cd²⁺ > Cd²⁺ > Cr³⁺。

2.2 不同浓度的Cr³⁺和Cd²⁺胁迫下小球藻叶绿素a含量的变化

小球藻叶绿素a是判断小球藻生长状况的一个重要指标，Cr³⁺和Cd²⁺对小球藻叶绿素a含量的影响见图 2。由图 2可知，在Cr³⁺和Cd²⁺单一胁迫下，浓度为0.01–1.00 mg/L之间，叶绿素a的含量表现为先下降后升高再下降，且在1 mg/L时出现最大值，分别较对照组增加10% (Cr³⁺)和15% (Cd²⁺)；浓度为20 mg/L时，叶绿素a含量较对照组分别降低25% (Cr³⁺)和32% (Cd²⁺)，说明单一Cr³⁺和Cd²⁺在一定浓度下可促进小球藻生长，且Cd²⁺的促进作用更为显著，浓度过高或过低都会对小球藻生长产生抑制作用，且高浓度胁迫下，Cd²⁺对叶绿体的毒害作用更大，说明小球藻对Cd²⁺更敏感。复合胁迫下，叶绿素a的含量均低于对照组，重金属离子浓度为1 mg/L时的最大值较对照组仍降低3.6%，可能由于两种重金属产生加和作用，抑制了小球藻生长。

2.3 不同浓度的Cr³⁺和Cd²⁺胁迫下小球藻丙二醛(MDA)的变化

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映机体受逆境伤害的程度。由图 3可知，重金属离子浓度低于1 mg/L时，MDA含量变化均不明显；当浓度在10–20 mg/L时，MDA含量明显上升且在20 mg/L处达最大值，与对照组的MDA相比单独Cr³⁺增长了1倍，Cd²⁺增长了1.20倍，Cr³⁺和Cd²⁺加和后增长了2.01倍。说明Cr³⁺和Cd²⁺对小球藻的细胞膜有较强的破坏性，且随着重金属离子浓度增加破坏性逐渐增强，而在两种重金属离子复合的情况下可能增强了这种破坏性，使得大量有毒物质进入藻细胞，破坏了藻细胞的正常代谢活动。

2.4 不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺胁迫下小球藻细胞内H₂O₂含量的变化

小球藻在不同浓度的单一和复合Cd²⁺和Cr³⁺胁迫下其细胞内H₂O₂含量变化如图 4所示。当重金属离子浓度低于10 mg/L时H₂O₂含量与重金属离子浓度变化呈正相关，在10 mg/L时单一和复合组的H₂O₂含量达到最大值，并且添加的重金属离子对小球藻胞内H₂O₂含量的影响趋势为Cr³⁺+ Cd²⁺ > Cd²⁺ > Cr³⁺；当Cd²⁺和Cr³⁺浓度在20 mg/L时各组中的H₂O₂含量均有所下降，说明过量的重金属可能引起藻细胞严重的代谢及功能障碍，对细胞造成不可逆转的损伤，抑制细胞生长，甚至导致藻细胞死亡。

2.5 不同浓度的Cr³⁺和Cd²⁺胁迫下小球藻SOD、CAT和POD含量的变化

由图 5可知，随着Cr³⁺和Cd²⁺浓度的升高，SOD活性在单一胁迫下呈现随浓度增大而增高的趋势；复合胁迫下呈先增高后降低的趋势，10 mg/L时出现最大值(11.32±0.5) U/mg，其活性是对照的142%。CAT活性在单一和复合Cr³⁺和Cd²⁺浓度为10 mg/L时均出现最大值(0.418±0.01)、(0.457±0.01)、(0.476±0.01) U/mg，较对照组分别提高166% (Cr³⁺)、147% (Cd²⁺)和177% (Cr³⁺+Cd²⁺)；大于10 mg/L时，其活性开始降低。复合胁迫下SOD和CAT活性均大于单一胁迫下的活性，再次说明复合胁迫对小球藻产生更严重的损害。单一胁迫下POD活性在10 mg/L时出现最大值(0.120±0.01)、(0.135±0.01) U/mg，相比于对照组分别提高200%和150%。复合胁迫下POD活性在1 mg/L时就出现了最大值(0.126± 0.01) U/mg。说明Cr³⁺和Cd²⁺浓度的增加会促进SOD、CAT和POD的活性增加，以清除重金属离子刺激而产生的过量超氧阴离子，保护细胞免受损伤。当重金属离子浓度超出一定范围时，会对小球藻的抗氧化机制造成破坏，细胞内的抗氧化酶不能将快速产生的大量自由基及时清理，使得细胞的新陈代谢紊乱，甚至藻细胞出现死亡，导致SOD、POD和CAT活性出现先升高后降低的现象。

3 讨论

藻类是水生生态系统中的初级生产者，它对水生生态系统有着重要影响^[24]。重金属等对藻类植物的影响迅速且复杂。Ababna等^[25]在研究小球藻对某些重金属离子毒性效应时发现，重金属离子对小球藻的抑制和刺激作用均取决于浓度，低剂量对小球藻生物量有促进作用，高剂量则会产生抑制作用。本研究通过对比小球藻在不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺单一和复合胁迫下的生物量和叶绿素变化发现Cr³⁺和Cd²⁺在浓度为1 mg/L时可促进小球藻生长，但浓度过高时会产生抑制作用。通过计算Cr³⁺和Cd²⁺对小球藻胁迫96 h后的半数效应浓度(EC₅₀)，发现它们的毒性大小顺序为Cr³⁺+Cd²⁺ > Cd²⁺ > Cr³⁺；由于Cr和Cd两种金属的原子量几乎相差一倍，在质量浓度相同的情况下，Cr³⁺的物质的量浓度是Cd²⁺的2.16倍，但Cd²⁺对小球藻生长仍表现出更强的抑制作用，这说明两种重金属离子中，Cd²⁺对藻细胞具有更大的毒害作用。葸玉琴等^[14]和耿红等^[26]分别在研究Cr³⁺和汞离子与镉离子对小球藻生理生化特性影响时发现，当Cr³⁺和Cd²⁺浓度分别超过3 mg/L和2 mg/L时，两种重金属离子都对小球藻产生了明显的抑制作用。这与本研究结果相符，即高剂量会对藻细胞的生长产生抑制作用，也进一步表明小球藻对Cd²⁺更为敏感，Cd²⁺对内膜、类囊体片层和光合色素等会造成更为严重的危害^[27]。这主要是因为Cd²⁺半径大于Cr³⁺半径而使Cd²⁺更有利于与较远的功能团结合，且小球藻对Cd²⁺的吸附能力高于对Cr³⁺的吸附能力^[28]，说明小球藻对Cd²⁺有更强的亲和性，所以Cd²⁺较Cr³⁺更容易被小球藻吸附进入藻细胞产生更大的毒性。复合胁迫下可能由于Cr³⁺和Cd²⁺发生加和作用，其产生的毒性更强，导致藻的生物量和叶绿素a均显著低于对照组和单一胁迫。

正常情况下，藻细胞中活性氧的合成和分解处于动态平衡。当Cr³⁺和Cd²⁺浓度达到阈值时藻生长明显受到抑制，较高的重金属离子浓度提高了藻细胞初始阶段抗氧化系统的活性，藻细胞中活性氧含量不断增加，诱导SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性提高，将藻细胞内产生的过量H₂O₂等活性氧分解为分子氧和水为自身解毒，此时重金属离子主要被细胞壁功能基团吸附，而随着毒害作用时间的增长，活性氧分子的大量产生使细胞膜发生过氧化作用。MDA的含量恰好反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，会随着膜系统的损伤程度而逐渐升高，此时细胞膜通透性增大，重金属不断转移到细胞体内^[29]。藻细胞内重金属离子含量超出了藻细胞的耐受限度，使得细胞内积累过多H₂O₂和超氧阴离子，导致藻细胞的生物量减少，产生的酶的量也减少，同时对细胞内多成分造成破坏，细胞功能降低，MDA含量不断增大，最终导致藻体死亡。本研究中当Cr³⁺和Cd²⁺浓度低于10 mg/L时，SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性呈增大趋势，重金属离子浓度为1 mg/L时，H₂O₂、SOD、CAT和POD等含量均有所提高，但单一胁迫下藻生物量均高于对照组，说明在该浓度的单一胁迫下藻体通过加强抗氧化酶活性进行抗逆来维持藻细胞的正常代谢；大于10 mg/L时，重金属离子浓度远超过藻细胞的耐受限度，使藻细胞内的抗氧化机制被破坏，H₂O₂和MDA含量不断增加，SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性明显降低。蔡卓平等^[30]研究表明重金属离子能胁迫抑制藻的光合作用，影响藻的生长繁殖；藻细胞膜的通透性增加，藻细胞被破坏。Deng等^[31]研究铜绿微囊藻对锌(Zn)和镉(Cd)离子的生理反应及其离子积累能力过程中发现较高浓度的重金属离子对藻细胞都有着明显的氧化损伤。刘璐等^[32]研究镉对铜绿微囊藻和斜生栅藻的毒性效应，也发现随Cd²⁺浓度的增加氧自由基含量升高，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性早期均上升。这说明小球藻对重金属离子有一定的耐受性，但超过藻细胞的耐受限度则会对藻细胞产生严重的毒害作用，甚至使藻细胞死亡。陈和祥等^[33]研究发现小球藻可作为去除污水中重金属Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺的生物吸附剂，本研究对培养前后重金属离子浓度进行检测发现小球藻对Cd²⁺和Cr³⁺吸附率可分别达到84.5%和75.2%。因此，此研究可为小球藻的规模化培养以及重金属离子对水生生物的毒性效应研究提供参考，也可利用小球藻对重金属的吸附作用清除水体中小球藻耐受范围内的重金属铬和镉，为水环境中重金属污染修复提供理论支持。