氮循环是生态系统物质循环的关键步骤，在为生命提供氮源和维持地球稳态方面起到了重要作用^[1]。微生物参与的氮循环主要有以下六个过程：同化作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用、厌氧氨氧化作用和固氮作用^[2]。其中微生物的反硝化作用是指微生物将NO₃^–和NO₂^–向气态的NO、N₂O和N₂逐步还原的过程^[3]。长期以来，反硝化作用被认为是原核生物独有的特征，而真菌反硝化过程的发现则更新了传统观念^[4]。传统上认为，影响全球N₂O通量的主要生物来源是微生物的硝化和反硝化作用。近期的研究表明，真菌反硝化比细菌反硝化对土壤排放的N₂O的贡献更大^[5]。同时，有研究发现作为大气N₂O主要来源的陆海界面沉积物，其中存在的真菌反硝化过程(fDNF)对N₂O的释放也发挥着至关重要的作用^[6]。因此，有必要进一步认识自然环境中存在的真菌反硝化过程，以加深对环境中N₂O的微生物来源的了解。本文综述了国内外有关反硝化真菌的研究进展，包括反硝化真菌的在环境中的多样性及分布，反硝化机制、反硝化活性测定方法及其在自然环境氮循环中扮演的角色等方面的介绍。

1 真菌反硝化过程的发现

真菌反硝化是一个新兴的概念，最早于1972年由Bollag和Tung观察到在低氧浓度条件下尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀菌(Fusarium solani)能还原亚硝酸盐并释放出N₂O，但他们不能解释这一现象涉及的生理反应^[7]。直到1991年，Shoun和Tanimoto通过培养F. oxysporum的纯菌株并测定其细胞萃取液中相关反硝化还原酶的活性，首次证实该菌株在厌氧及存在NO₃^–/NO₂^–的条件下是通过反硝化作用产生N₂O，且由其内存在独特的细胞色素P450(P-450_dNIR)参与还原反应^[8]。真菌反硝化概念的提出打破了以往认为反硝化作用仅存在于原核生物的观念，而F. oxysporum也成为一种研究反硝化真菌生理生态和系统发育的模式生物。在1992年，Shoun等研究发现，许多来自Fusarium、Gibberella、Nectria、Cylindrocarpon和Trichoderma属的真菌具有反硝化能力，能够在厌氧条件下将NO₃^–或NO₂^–还原成NO或N₂O^[9]。Tanimoto等在早期利用抑制剂研究真菌的反硝化作用机制时发现，与仅添加亚硝酸盐的处理组相比，当添加含氮抑制剂时，反硝化产物中能检测出更高的氮氧化物的含量。随后他们利用了叠氮化物(azide)、水杨基异羟肟酸(salicylhydroxamic acid，SHAM)和氯化铵(ammonium chloride)等与亚硝酸盐混合培养F. oxysporum MT-811，结果发现添加亚硝酸盐和SHAM的处理组最终生成的N₂O的量远远超过了与亚硝酸盐添加量的化学计量比，而与两种添加物的总量近乎相等。添加了叠氮化物和亚硝酸盐的处理组除了N₂O还观察到了N₂，生成的N₂总量与叠氮化物的量相等，说明N₂来源于叠氮化物。

但若培养基不添加亚硝酸盐，则没有N₂O或N₂的产生。因此，Tanimoto等认为，含氮化合物本身无法诱导反硝化系统，但能够与亚硝酸盐通过真菌反硝化系统进行共反硝化(Co-denitrification)反应从而产生N₂O或N₂^[10-11]。

随着研究的深入，真菌反硝化过程的分子机制也随之被阐明^[12–14]。真菌具有与细菌相似的反硝化系统，细菌反硝化是将NO₃^–/NO₂^–逐步还原为N₂(NO₃^–→NO₂^–→NO→N₂O→N₂)的过程，参与的还原酶分别为硝酸盐还原酶(nitrate reductase，Nar)、亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，Nir)、一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase，Nor)以及氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase，Nos)^[15]。真菌反硝化系统缺乏编码N₂O还原酶的基因(nosZ)而不具备将N₂O还原成N₂的能力，故真菌反硝化的路径比细菌的短，是将NO₃^–或NO₂^–逐步还原成N₂O的过程^[15]。驱动真菌反硝化作用的酶位于真菌的线粒体膜上，与细菌相似的是真菌反硝化作用不需要严格厌氧，在好氧、微好氧以及微厌氧环境中均可以发生，因此人们预测在好氧与厌氧并存的环境中，真菌反硝化作用在驱动氮循环方面发挥重要作用^{[5, 15]}。

2 反硝化真菌的种类及其环境分布

据Mothapo等研究报道，从1972年至2014年间有关反硝化真菌的研究报告中共发现60个属119种反硝化真菌^[15]。这些源自富集、纯培养或者土壤样品的反硝化真菌有90%属于子囊菌门(Ascomycota)，其余分别属于担子菌门(Basidiomycota，7%)和接合菌门(Zygomycota，3%)。而在子囊菌门中，有46%的反硝化真菌属于粪壳菌纲(Sordariomycetes)，24%属于散囊菌纲(Eurotiomycetes)，另有9%和8%分别属于酵母纲(Saccharomycetes)和座囊菌纲(Dothideomycetes)。代表性的子囊菌真菌包括链格孢菌(Alternaria alternata)，灰质芽孢杆菌(B.cinerea)以及以下属内的种：曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和木霉属(Trichoderma)^[15]。

基于NCBI数据库，搜集反硝化真菌P450nor基因序列构建进化树如图 1所示^[16]。在子囊菌门内的Sordariomycetes纲中分布有最丰富的反硝化真菌属，包括Fusarium、Chaetomium、Trichoderma、Metarhizium等属，其次是Eurotiomycetes纲的Aspergillus、Trichophyton、Histoplasma等属，Leotiomycetes纲有Pseudogymnoascus、Glare、Marssonina和Sclerotinia属，而Dothideomycetes纲有Bonordeniella、Macrophomina及Bipolaris属。在P450nor基因进化树上不同纲的反硝化真菌之间相互聚集成簇(如Leotiomycetes纲Pseudogymnoascus属与Eurotiomycetes纲的Trichophyton属)，推测在进化过程中，不同纲的反硝化真菌的P450nor基因发生了水平转移，导致反硝化真菌18S rRNA与P450nor基因进化不同步，从而出现进化树相同纲的反硝化真菌分布在不同簇^[17]。

表 1汇总了近年来不同生境中反硝化真菌的种属组成以及鉴定方法。通常从土壤环境中识别和表征反硝化真菌的方法包括3个步骤，首先是将土壤样品中的真菌进行分离和纯培养，随后在液体培养基(如察氏培养基、甘油-蛋白胨培养基、马铃薯-葡萄糖培养基等)测试这些真菌纯菌株产生N₂O的活性，最后将这些具有反硝化活性的真菌基于形态学特征或者真菌ITS、18S rRNA基因或者真菌nirK功能基因等序列分析后进行属或种水平上的鉴定^[15]。

据Xu等研究，在不同的农田土壤(红粘土、冲积土和黑土)中nirK型反硝化真菌的丰度为9.92×10⁸–3.15×10⁹ copies/g^[1]。基于引物nirKfF/ nirKfR的PCR及高通量测序表明，不同农田土壤中含有的nirK型反硝化真菌具有高度的相似性，主要来自Hypocreales、Sordariales、Eurotiales和Mucorales目，以及8个属：Fusarium、Trichocladium、Chaetomium、Talaromyces、Trichoderma、Aspergillus、Byssochlamys和Actinomucor，其中Hypocreales纲和Fusarium属的反硝化真菌丰度最高^[1]。他们认为长期的耕作活动导致Fusarium属数量的积累，使得不同类型农田土壤具有相似的nirK型反硝化真菌群落。而真菌nirK基因丰度与土壤N₂O的排放呈正相关关系，也表明反硝化真菌在农田土壤产生N₂O的过程中起重要作用^[1]。Jirout等用琼脂平板法从Bohemia南部的牧场土壤样品中分离真菌并测定其反硝化活性，其中有63.8%的真菌菌株具有反硝化活性，而这些菌株隶属于13个属(如表 1所示)，主要来自Hypocreaceae和Trichocomaceae^[18]。Mothapo等分离了5种农业土壤(传统农田、综合农牧田、有机农田、人工林和废弃农田)中的真菌并测定其反硝化活性，基于ITS基因引物ITS-1/ITS-2鉴定的结果表明，大多数产N₂O的真菌菌株属于Sordariomycetes、Eurotiomycetes和Dothideomycetes纲，而五种不同农业土壤中均有分布 Fusarium、Penicillium、Aspergillus和Trichoderma属的反硝化真菌^[19]。除了农田环境，近年来Jasrotia等^[20]从铀和硝酸盐污染的地下环境中分离了反硝化真菌。研究发现来自Teberdinia、Aspergillus、Coniochaeta、Neolinocaron、Fusarium、Penicillium、Apiospora、Phialocephala和Paecilomyces属的反硝化真菌能够将NO₃^–还原成N₂O。在此之前的研究仅发现Fusarium、Cylindrocarpon和Trichosporon属的真菌能够还原NO₃^–为N₂O^[20]。

上述研究表明，Fusarium、Penicillium、Aspergillus和Trichoderma属反硝化真菌广泛分布在陆地环境中。目前，已有众多针对土壤反硝化真菌多样性的研究，但对其他环境(如海洋)中的反硝化真菌群落仍需要进一步探索。近期有研究表明，在雅浦海沟深海沉积物中分离了两株具有反硝化能力的枝孢菌，这表明在深海环境中同样存在反硝化真菌，且其群落组成以及对N₂O的排放贡献仍是未知，有待进一步探索^[21]。

3 真菌反硝化过程的机制

迄今，研究者对F. oxysporum和C. tonkinense的反硝化系统在细胞内的定位、参与反硝化过程的底物和酶的作用机制已有较为全面的研究，它们的反硝化系统如图 2所示^[22]。

1996年，Kobayashi等通过细胞分离和免疫荧光法技术观察到F. oxysporum的Nar和C. tonkinense的Nir均分布在线粒体上。他们通过分离Nar和Nir，发现呼吸底物如苹果酸、丙酮酸、琥珀酸和甲酸等能为Nar和Nir提供电子还原NO₃^–或NO₂^–，而呼吸链抑制剂如鱼藤酮、抗霉素A和噻吩甲酰三氟丙酮等能够显著抑制真菌Nar或Nir的活性^[14]。这些证据表明真菌反硝化过程发生在线粒体上，真菌反硝化过程与呼吸链合成ATP相偶联^[14]。Kobayashi等还认为，F. oxysporum的Nar系统利用甲酸提供电子的特性类似于大肠杆菌(E. coil)的硝酸盐还原系统，其中可能存在与呼吸链相关的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，Fdh)系统支持硝酸盐的厌氧还原^[14]。而后Uchimura等研究证实，在F. oxysporum的线粒体中检测到了Fdh的活性^[23]。研究还发现，F. oxysporum的细胞内至少存在两种类型的Nar，一种是位于线粒体膜上的异化型硝酸盐还原酶(dissimilatory nitrate reductase，dNar)，一种是存在于可溶组分中的同化型硝酸盐还原酶(assimilatory nitrate reductase，aNar)，其中aNar仅从NADH或NADPH中接收电子，而dNar从甲酸等呼吸底物中接收电子^[23]。进一步的分析表明，Fdh是通过UQ/UQH₂池从甲酸转移电子到dNar，Fdh-Nar的耦合参与了真菌NO₃^–呼吸^[23]。对部分纯化后的dNar进行光谱学分析显示，该酶含有钼蛋白、细胞色素b以及铁硫蛋白。无论是Fdh-Nar的耦合还是酶的组成，dNar参与的NO₃^–呼吸与大肠杆菌(Escherichia coli)的非反硝化型NO₃^–呼吸系统十分相似，而Fdh-Nar的耦合从未在反硝化细菌中发现^[23]。据Takaya等研究报道，F. oxysporum在缺氧或反硝化条件下能同时进行O₂呼吸和NO₃^–呼吸，两种呼吸同享线粒体的呼吸链，是一种杂合的呼吸过程^[24]。在这一过程中，dNar至少可以从三条途径接收电子(图 2)：泛醌-甲酸脱氢酶(UQFdh)、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ (NADH脱氢酶)或线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ (琥珀酸脱氢酶)。酶活性测定实验表明，Fdh-Nar的耦合反应在三条电子传输路径中具有最高的活性，因此是dNar接收电子的主要途径^[24]。

除了在F. oxysporum细胞内发现的特殊Fdh-Nar耦合NO₃^–呼吸系统，Watsuji等认为，与F. oxysporum具有亲缘关系的C. tonkinense在特定条件下可能进行硝酸盐的反硝化^[25]。经过一系列的酶活性检测实验，Watsuji等在C. tonkinense的细胞胞浆内检测出一种依赖NADH的同化型NO₃^–还原酶(assimilartory nitrate reductase，aNar)的活性，而未检测出dNar^[25]。在探究碳氮源对C. tonkinense反硝化过程的影响实验中，Watsuji等发现在特定条件下(初始含氧随后厌氧)，当NO₃^–是唯一的氮源时，aNar和aNir仅被诱导用于同化过程^[25]。借助同位素标记法(¹⁵NaNO₃和¹⁴NaNO₃)，他们发现在另外添加NH₄⁺和可发酵糖(葡萄糖或者半乳糖)后，NO₃^–出现消耗，且同位素标记结果表明生成的N₂O来源于NO₃^–[25]。此外，添加Nar抑制剂(钨酸盐)后也观察到NO₃^–的消耗和N₂O的产生过程受到明显抑制。因此，Watsuji等认为NH₄⁺和可发酵糖(葡萄糖或者半乳糖)作为电子供体的存在诱导了C. tonkinense发生硝酸盐反硝化^[25]。这是首次发现aNar利用同化的系统达到异化(反硝化)的目的，本被认为仅能进行亚硝酸盐反硝化的C. tonkinense在特定条件下存在aNar进行硝酸盐反硝化。另有研究称，在厌氧条件下aNar可将NO₃^–还原成NH₄⁺，此过程可利用底物产能使细胞生长，称为真菌的氨发酵^[26]。

F. oxysporum和C. tonkinense具有不同类型的Nar，但均含有NirK (含铜型dNir)和P450nor，由于缺乏N₂O还原酶，所以终产物是具有强烈温室效应的N₂O^[22]。1995年，Kobayashi等在F. oxysporum中首次发现和分离了异化型亚硝酸盐还原酶(dissimilatory nitrite reductase，dNir)，该酶由含有两个铜原子的亚基组成，分子量为41.8 kDa，能从菌体自身合成的类天青蛋白和细胞色素c549中接收电子，将NO₂^–还原为NO，同时耦合线粒体合成ATP，免疫染色结果显示dNir位于线粒体的内外膜之间^[13–14]。1999年，Kubota等通过破碎C. tonkinense的细胞在可溶组分和膜组分中均检测出Nir的活性。经过纯化、SDS-PAGE检测及光谱学分析显示，两种Nir在性质上相同，是一种亚基大小为67 kDa的同源二聚体^[27]。酶活性抑制实验显示，C. tonkinense的Nir可以被二乙基二硫代氨基甲酸强烈抑制，结合其吸收光谱的结果意味着这是同F. oxysporum类似的含铜型dNir (CuNir)^[27]。在C. tonkinense的线粒体中，呼吸底物如苹果酸、丙酮酸和琥珀酸可以为dNir作用过程提供电子^[14]。以丙酮酸和苹果酸为碳源的dNir的活性被鱼藤酮和抗霉素抑制而不被噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)抑制，而以琥珀酸为碳源的dNir活性被抗霉素和TTFA抑制而不被鱼藤酮抑制^[14]。因此，Kobayashi等认为C. tonkinense的dNir与O₂呼吸过程共享线粒体电子传递系统，与细菌的Nir同是经过呼吸链酶复合物Ⅲ(UQH₂-细胞色素c氧化还原酶)来得到电子^[14]。

以F. oxysporum和C. tonkinense为代表的真菌在反硝化过程中后一步的酶是P450nor，这是一种具有脂氧合酶活性和P450性质的血红素蛋白，能将NO还原成N₂O，在线粒体和细胞质中均有分布^[28]。P450nor属于细胞色素P450超基因家族，编号是CYP55^[22]。细胞色素P450具有加单氧酶的作用，能参与重要的生理反应如机体解毒、固醇类激素的合成等，在真核和原核生物中均有存在^[29]。尽管P450的分子大小多种多样且广泛分布于生物体中，但都起源于同一个基因^[30]。比起真核生物的P450s，CYP55的起源与细菌P450s具有更近的亲缘关系，有研究推测该基因可能是从放线菌中水平转移到真菌内而产生的^[22]。

在F. oxysporum中基因CYP55A1编码两种P450nor同工酶P450norA和P450norB，由于两者编码的起始密码子不同，使得P450norA作用于线粒体内，而P450norB作用于细胞质中，以NADH为电子供体。在C. tonkinense中也含有两种P450nor同工酶：位于线粒体的P450nor1(由CYP55A2基因编码)和位于细胞质的P450nor2(由CYP55A3基因编码)。其中P450nor1只能利用NADH提供电子，而P450nor2更倾向于从NADPH中接受电子^{[22, 31]}。P450nor参与反硝化过程的整体反应式为：2NO+NADH+H⁺→N₂O+H₂O+NAD^+[24]。真菌的P450nor从NADH(或者NADPH)中接受电子的特性与传统的P450从其他蛋白质组分(如P450还原酶和铁氧还蛋白)中接受电子形成了鲜明的对比，同时P450nor参与的还原过程不需要耦合呼吸链，这也是真菌反硝化系统的独特性之一^{[24, 30–31]}。

从真菌反硝化作用的发现至今，科学家们对真菌反硝化系统的机制也进行了深入的研究。其中，真菌F. oxysporum和C. tonkinense的反硝化系统已被详细的阐明，在它们的反硝化系统中dNar或aNar同dNir和P450nor参与了反硝化，N₂O是最终产物。研究发现，只有少数的真菌比如F. oxysporum和Gibberella fujikuroi (Swada) Wollenw.能够利用Fdh-Nar耦合的系统将NO₃^–还原为NO₂^–，大多数的真菌以NO₂^–为反硝化的起点^[15]。而Kim等表明真菌nirK与细菌nirK拥有共同的祖先，许多含有nirK同源物的真菌也含有P450nor的同源物，表明这种同时含有nirK和P450nor类型的反硝化系统在真菌中普遍存在^[32]。尽管真菌Nar和Nir与细菌具有许多相似性，但真菌P450nor却与细菌的Nor具有较大的差别，这与反硝化真菌线粒体起源于细菌的假说有一定的矛盾^[33]。另外，以真菌F. oxysporum和C. tonkinense为代表的反硝化机制能否代表大部分真菌的反硝化作用机制？除了这两种真菌反硝化机制是否还存在其他不同的真菌反硝化作用机制仍是未知，这些问题值得我们进一步探究。

4 真菌反硝化活性的测定

传统上认为，农业和自然土壤中的微生物硝化和反硝化作用是全球范围内N₂O的主要来源，其中由真菌反硝化作用排放的N₂O约占总N₂O排放量的34%–42%^[34]。基于现有的研究，常用于测定真菌反硝化对N₂O的贡献的方法为基质诱导呼吸抑制法(SIRIN)，而同位素法则常用来溯源土壤N₂O的产生途径，该部分将围绕这两种主要方法进行介绍。

4.1 基质诱导呼吸抑制法(SIRIN)^[35]

SIRIN法最初于1973和1975年由Anderson和Domsch用来测定土壤真菌和细菌的生物量及相对活性，而后科学家们改良此法用于测定土壤真菌和细菌对N₂O产生的相对贡献^[35-36]。该方法是以葡萄糖或蛋白胨作为细菌和真菌的碳源诱导基质，利用生物抑制剂，通常是放线菌酮(cycloheximide，C₁₅H₂₃NO₄)和链霉素(streptomycin，C₂₁H₃₉N₇O₁₂)来分别选择性抑制真菌和细菌合成蛋白质的活性。其中放线菌酮能够抑制真核生物60S核糖体亚单位肽基转移酶的活性，从而抑制真菌的反硝化活性。而链霉素可以抑制原核生物的蛋白质的初始合成，引起信使RNA的误读，以此抑制细菌的活性。除抑制剂外，还可配合使用一定浓度的乙炔来抑制样品中微生物的硝化作用对N₂O排放量造成的影响^{[35, 37]}。SIRIN法通过分组添加相应的抑制剂(放线菌酮、链霉素或两种结合)，利用气相色谱仪测定各组在不同时间段内的N₂O浓度，再结合相应公式即可计算出真菌对N₂O产生的贡献及速率^[38]。

该方法在样品(土壤、沉积物或水体)测定之前，需要先进行预实验来确定抑制剂的最佳浓度，避免高浓度的抑制剂对细菌或真菌造成非靶向抑制。确定最佳抑制剂浓度需要设置四组实验处理：(1) 空白对照组(A)，不添加抑制剂；(2) 放线菌酮组(B)，系列浓度的放线菌酮；(3) 链霉素组(C)，系列浓度的链霉素；(4) 双抑制剂组合组(D)，不同浓度组合的两种抑制剂。设置3组以上的平行实验，在一系列时间梯度(如4、12、20和32 h)内利用气相色谱仪测定瓶中N₂O的浓度并与时间进行回归来计算N₂O的产生速率^[38-39]。利用抑制剂加性比(IAR)的值(式1)来判断两种抑制剂是否具有非靶向效应，当IAR的值接近1时，相应浓度抑制剂效果最佳^[36]。

公式(1)

式中，A、B、C、D分别代表空白对照组、放线菌酮组、链霉素组以及双抑制剂组的N₂O速率[mol/(g·h)]。

确定抑制剂最佳浓度后，设置与预实验相似的四组处理，采用微宇宙培养实验测定样品中真菌产生N₂O的速率(式2)及贡献(式3)^[38]。

公式(2)

公式(3)

其中，C_t0、C_t1为初始培养和培养后瓶内的N₂O的浓度(ppm)，t₀、t₁为培养前后时间点(h)，P_B为真菌对N₂O的相对排放贡献(%)。

同理，代入数据可求出样品中细菌和非生物部分产生N₂O的速率及相对排放贡献。

表 2统计了近年来使用SIRIN法研究时选用的抑制剂浓度以及各自对N₂O排放的抑制率，其中放线菌酮的浓度最低为1 mg/g，最高为15 mg/g，链霉素的浓度最低为2 mg/g，最高为8 mg/g。使用抑制剂法判别土壤的微生物作用时，抑制效果的差异可能是土壤理化性质、生物群落组成不同或者抑制剂法本身的缺陷造成的。因为不排除在土壤样品中部分微生物对抑制剂具有耐受性的情况。因此，选择适合的抑制剂浓度是有效使用该方法的关键。最佳的抑制剂浓度应对样品中微生物的呼吸速率没有显著影响，且不应抑制非目标微生物的活性，否则测定结果将出现较大的误差。Yanai等利用SIRIN法研究了印度尼西亚加里曼丹中部可耕地泥炭土中的真菌反硝化作用^[40]。结果发现，与未添加抑制剂的土壤相比，链霉素的添加减少了31%的泥炭土N₂O排放率，而放线菌酮的添加则减少了81%的N₂O排放率，这说明真菌是泥炭土N₂O排放的主要贡献者^[40]。章伟等发现米槠天然林土壤中真菌的活性显著高于细菌，但两种微生物对土壤N₂O的贡献量相当^[41]。Chen等利用同浓度组合的抑制剂研究了五种农业土壤中真菌、细菌对N₂O排放的贡献，其中除了种植园林业土壤中的真菌对N₂O的贡献大于细菌外，其余四种土壤中真菌和细菌对N₂O的贡献相同^[38]。Wei等指出，施用肥料后农田土壤N₂O的排放主要是由真菌的反硝化作用驱动^[42]。

直至今天SIRIN法仍是研究土壤真菌和细菌对N₂O的相对贡献的主要方法，具备良好的研究基础。该法操作简单，可以在短时间内快速测定土壤中微生物的活性比，是实验室较为常用的一种测定真菌反硝化活性的方法。但是该方法是从总体上粗略估计样品真菌和细菌对N₂O的相对贡献大小，而且底物的选择和抑制剂的浓度均会影响某些微生物的活性(耐受或不耐受)，使结果出现偏差等。为此，可以结合使用其他测定方法(如同位素法)，彼此之间的相互验证得出更为可靠有效的数据^[41]。

4.2 同位素方法

由于土壤中具有复杂的微生物群落，要判断土壤N₂O的来源在以往是一项困难，而同位素及相关仪器的发展则带来了有效解决方法。N₂O的稳定同位素特征值如δ¹⁵N、δ¹⁸O和SP等是区别土壤N₂O产生和消耗过程(硝化、细菌反硝化、真菌反硝化和硝化反硝化)的有效指标^[43]。由于同位素的分馏效应的影响，在反硝化过程中导致生成的N₂O与其前体分子相比出现δ¹⁵N_bulk值(产物N₂O和前体分子NO₂^–/NO₃^–的δ¹⁵N之间的差值)的降低及δ¹⁸O值的升高，同时与未受还原作用影响的N₂O相比，N₂O还原过程会导致残余N₂O的δ¹⁵N_bulk和δ¹⁸O值的升高。此外，δ¹⁸O还会受到反硝化中间产物与水之间发生氧交换的影响。因此，在解读N₂O的氮氧同位素数据时必须考虑反硝化过程中同位素分馏和氧交换对N₂O的同位素组成造成的影响^[44]。

在N₂O分子中，根据¹⁵N所处的位置可分为中心位¹⁵N^α(¹⁴N-¹⁵N-O)和末端位¹⁵N^β(¹⁵N-¹⁴N-O)，它们的相对丰度分别用δ¹⁵N^α和δ¹⁵N^β表示，两者的差值称为位嗜值(site preference，SP=δ¹⁵N^α-δ¹⁵N^β)。SP值在分析N₂O产生途径(如硝化和反硝化)的相对贡献比例中不会受到N₂O前体分子的同位素影响，基于前人的纯培养研究提供的各种N₂O生成途径的SP值的差异性数据，可以用作区分N₂O来源的重要依据^[45]。Stuka等表明F. oxysporum和C. tonkinense的SP值约为(37.0±2.3)‰，明显区别于反硝化细菌纯培养中测定的SP值(约为0‰)，而真菌反硝化产生N₂O的SP值与在硝化细菌纯培养中测定的平均SP值(约为33‰)之间没有明显的差异^[46]。他还表示真菌反硝化过程和细菌硝化过程的δ¹⁵N和δ¹⁸O是不同的，因此为了能更准确判断N₂O的来源，多种同位素特征值的互相结合综合判断是解决该问题的有效手段。

近期Wankel等利用¹⁵N、¹⁸O同位素富集系数、SP值和δ¹⁷O特征值揭示了德国北海Sylt岛上的Königshafen沿海潮间带沉积物中的真菌反硝化作用及铁的氧化还原过程是驱动海岸沉积物产生N₂O的重要途径^[6]。他们发现在结合Δδ¹⁵N和SP值来区别N₂O来源途径时会出现数据重叠(如真菌反硝化和细菌、古菌氨氧化)，难以判断重叠部分数据所代表的N₂O产生来源^[6]。所以Wankel等还借助三氧同位素技术^[47]来进一步准确区分N₂O的产生来源。通过比较稳态时的Δ¹⁷O_N2O和Δ¹⁷O_NO2，他们发现在高NO₃^–条件培养下，有70%–80%的N₂O是从NO₂^–中通过还原而不是氨氧化途径转化而来的。同时结合升高的SP_N2O值和微弱变化的Δδ¹⁵N，再通过同位素质量平衡法计算出4个主要生物过程如细菌反硝化、真菌反硝化、氨氧化及硝化反硝化各自作用过程产生N₂O的相对贡献值从而推断真菌反硝化和化学反硝化作用可能是海岸沉积物N₂O排放的主要途径^[6]。

同位素法不影响微生物活性，能够有效区分N₂O的来源，但同位素标记物的不均匀扩散或受同位素前体转化过程的干扰等都会影响测定结果。在自然环境中是同时存在多种生物/非生物途径产生N₂O，因此，仅靠纯培养得出的SP值来判断复杂环境中N₂O的来源是不准确的，所以多种同位素特征值的结合判断能够更加准确区分环境中N₂O的微生物来源^[45]。

除上述两种方法可以测定真菌反硝化活性外，还可以对环境样品中的真菌进行分离和纯培养再测定其反硝化活性^[48]。不同的研究可以根据需求选择测定方法，同位素方法具有数据更准确可靠、对微生物不具有侵扰性等优点，但同时这种方法对实验设备的要求更高，实验操作和计算过程较为复杂。而抑制剂法可通用于各种实验室，操作简单，经济实惠，但抑制剂浓度和添加量却对微生物活性有影响，需做好预实验和实验控制，以避免其对非目标微生物的抑制作用，数据的可信度较同位素方法差。

5 不同环境中真菌反硝化的速率及贡献

自Shoun等^[8]发现真菌反硝化作用以来，越来越多的研究表明反硝化真菌的种类丰富且广泛分布于不同的环境(如农田、茶园、湿地、森林、牧场、半干旱草原)中对N₂O的排放有重要贡献。在不同抑制剂作用下，N₂O总量减少的百分比比值作为真菌与细菌产生N₂O相对贡献比(F: B)，可用来判断环境中哪类微生物对N₂O的产生起主导作用^[38]。表 3总结了近年来在不同环境研究中的F: B比值以及真菌的反硝化速率。

Wei等认为施肥后土壤表面含有丰富的有机质以及有氧/缺氧条件更适合真菌生长，所以对比未施肥的土壤，施肥后的农田土壤表面发生的真菌反硝化作用是主要的N₂O来源^[42]。Chen等探究了真菌在不同农田土壤(常规农业田、综合作物和牲畜地、有机农业田、人工林、废弃农田)中对N₂O的排放起到的作用，发现在偏酸性(pH=5.3)的人工林土壤中真菌主导N₂O的产生，pH可能是影响真菌和细菌活性和生物量的关键环境因子^[38]。Herold等证实真菌反硝化作用受土壤pH的影响较小，真菌比细菌能够在更广泛的土壤pH中生长，而细菌群落的反硝化潜势随pH的降低而减小^[49]。Huang等的研究也表明，在高酸性(pH=3.8)的茶土中，真菌和细菌反硝化的贡献分别为70%和23%，真菌反硝化主导了茶园土壤中N₂O的产生，其反硝化速率为6.7 mg N₂O/(kg·h)^[50]。Seo等利用SIRIN法探究了Louisiana沼泽森林湿地的沉积物在不同氧化还原电位(–200 mV，–100 mV，0 mV，+100 mV，+250 mV，+400 mV)下真菌和细菌的反硝化情况^[51]。结果发现，在强还原条件(Eh < 100 mV)下，细菌反硝化占主导地位。当氧化还原电位在+250 mV(适度还原条件)和+400 mV (微氧化条件)时，即处于有氧/厌氧交界条件下，真菌与细菌反硝化的贡献值分别为34.3%–35.1%和1.46%–1.59%，真菌反硝化起到主导作用，其反硝化速率为0.12–0.27 mg N/(kg·d)。除此之外，还有真菌反硝化作用在可耕种的泥炭土以及森林中对N₂O的排放均起到重要的作用，真菌对土壤N₂O的排放贡献也受到科学家们越来越多的关注^[40-41]。

6 展望

自然环境中的真菌反硝化过程对N₂O的产生有重要作用，陆地土壤环境的真菌反硝化作用研究已有众多报道，而其他环境如海洋、地下河口等的真菌反硝化作用还鲜有报道。近期有研究表明，在印度果阿海岸(Goa)的沉积物中能分离出反硝化真菌，还有研究发现东太平洋深海沉积物中也存在反硝化真菌^[52-53]。因此，研究不同环境中真菌反硝化作用介导N₂O释放过程是势在必行的，未来的研究可以注重以下几个方面：(1) 有必要探索更多环境中真菌反硝化作用对N₂O的排放贡献；(2) 真菌反硝化活性测定方法需要优化，更有效的功能基因引物需要开发：随着分子生物学的发展，引物的开发为分析土壤反硝化真菌的群落组成、丰度等提供了有效的手段，但目前的反硝化真菌功能基因引物还存在一定的缺陷，有必要开发更有效的真菌反硝化引物；(3) 真菌反硝化过程机制的研究需进一步拓展，目前真菌反硝化的过程机制研究主要是基于两种真菌F. oxysporum和C. tonkinense的研究，其他反硝化真菌的作用机理还有待进一步探索研究。增进对反硝化真菌群的认识，有利于人们进一步掌握全球氮循环的情况，从而为将来控制和改善氮排放污染问题提供理论基础。