2021, Vol. 61中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
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- 岩溶区土壤微生物驱动的自养固碳过程与机制研究进展
- Research progress in the process and mechanisms of autotrophic carbon sequestration driven by soil microorganisms in karst areas
- 微生物学报, 61(6): 1525-1535
- Acta Microbiologica Sinica, 61(6): 1525-1535
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文章历史
- 收稿日期：2021-02-28
- 修回日期：2021-04-16
- 网络出版日期：2021-05-18
引用本文 |
2. 分子生物物理教育部重点实验室, 湖北 武汉 430074
2. Key Laboratory of Molecular Biophysics, Ministry of Education, Wuhan 430074, Hubei Province, China
大气中CO2浓度持续升高，被认为是全球气候变暖的重要原因之一，因此，陆地生态系统的固碳作用已经成为各国政府关注的重要议题和国际前沿热点。陆地生态系统主要通过植物的生长以及土地利用方式的改变来固定并增加碳储存[1-3]。土壤固碳是陆地生态系统固碳的一个重要组成部分，而自养微生物在其中扮演着重要角色[4]。自养微生物能广泛分布于营养相对贫瘠的生态系统中，如湖泊盆地[5]、海洋深处[6]和火山口[7]等地。
陆地生态系统中的岩石圈储存有地球上99.9%的碳[2]，地壳中的碳酸盐岩储存的碳占全球碳储存量的90%。岩溶系统是一个CaCO3-H2O-CO2三相动态平衡开放系统[8]，据估计，每年因全球碳酸盐岩溶解而吸收大气CO2的量可达(1.10-6.08)×108 t C，从而可能形成巨大的碳汇[9]。岩溶区土壤由于特殊的地质环境与岩溶作用影响，呈现出土层浅薄、高钙偏碱等特点，因此其有机碳周转机制与其他非岩溶区土壤不同[10-12]。据报道，岩溶区顶级植被群落的土壤有机碳含量平均高达66.21 g/kg[13-14]，与其他同纬度的生态系统相比有机碳含量较高，这可能与岩溶土壤高钙偏碱性的地质特征有关。而且，受岩溶作用影响，岩溶土壤中的无机碳含量一般高于非岩溶区，可提供更多的无机碳源，因此，岩溶区土壤中可能存在大量的自养微生物[15-16]。自养微生物在土壤固碳过程中起关键作用[4]，其群落结构的改变，可能会影响土壤的固碳潜力，进而可能导致陆地生态系统土壤碳库的改变[17-18]。
随着分子生物学技术的发展，固碳功能基因库不断完善，通过将稳定性同位素示踪技术与高通量测序、基因芯片等技术结合起来，对不同生态系统中土壤微生物与碳循环转化相关的机制进行研究，为提高土壤固碳潜能、减少土壤碳排放、实现碳中和提供新的思路和方法。目前对土壤微生物驱动的自养固碳过程及机制方面的研究较为缺乏，因此本文综述了岩溶区土壤微生物驱动的自养固碳过程、土壤固碳微生物功能群以及岩溶区土壤微生物自养固碳的分子机制及其产生的生态效应，为深入研究和认识岩溶区土壤生态系统的生物固碳机制、提高岩溶区土壤的固碳潜能、增强岩溶区土壤的生态稳定功能提供参考。
1 土壤微生物驱动的自养固碳过程土壤为微生物提供良好的生存条件，同时微生物有助于维持土壤的生态功能[19]。据估算土壤中微生物量碳(MBC)含量大于土壤总有机碳的80%[20]，由此可见土壤微生物的碳储量不可忽视。微生物的碳固定能力在土壤有机质的转化过程中起重要作用[19]，虽然目前对岩溶区土壤中微生物驱动的自养固碳过程研究较少，但是对不同生态系统中微生物驱动的自养固碳过程的研究一直是国内外研究的热点之一。
已有研究表明，微生物参与的碳循环代谢过程主要包括3个基本过程[21]：(1) 碳固定，无机碳(CO2)转化成有机碳；(2) 甲烷代谢，包括产甲烷与甲烷氧化过程；(3) 碳降解，有机质的分解过程。参与碳固定过程的微生物主要是自养微生物，其按照能量来源不同分为光能自养微生物和化能自养微生物，分别以光和电子供体为能源，两者都能将周围环境中的无机碳转化成有机碳进行储存[22]。自养微生物在适应不同环境过程中进化出不同的CO2固定途径。目前，自然界中发现6种CO2固定途径，包括卡尔文循环途径、还原性三羧酸循环途径、还原性乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸双循环途径、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环途径和二羧酸/4-羟基丁酸循环途径[22-26]，此外，在异养固碳微生物中发现还存在草酰乙酸盐途径、嘧啶和嘌呤核苷酸途径[27-28]。不同类群的固碳微生物在不同的生境下可能表达不同的固碳途径，从而其固碳能力也有差异。
微生物在岩溶生态系统中可参与地表岩石和矿物的风化过程[29]，其驱动的土壤固碳过程可能与其他生态系统不同[9]。作者课题组的前期研究发现，碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)广泛存在于自然岩溶土壤和水体环境中以及典型流域(长江流域、乌江流域和珠江流域)的土壤和水体环境中[30-32]，岩溶区的表层土壤CA活性高于非岩溶区，且其与土壤有机碳(soil organic carbon，SOC)含量呈一定的正相关，两者的相互作用可能对流域岩溶生态系统的碳循环产生影响[33]。CA广泛存在于动物、植物、细菌、藻类等生物细胞中，是一种能够与锌离子结合并高效催化CO2和HCO3-相互转化(CO2+H2O⇔HCO3-+H+)反应的酶[34]，产CA的微生物能显著促进碳酸盐岩溶蚀[35-37]。因此，岩溶土壤中自养固碳微生物同化的无机碳还有可能来源于碳酸酐酶诱导的碳酸盐岩溶蚀产生的HCO3-，这就增加了岩溶土壤中自养固碳微生物可利用的无机碳浓度，从而刺激其固碳能力，有利于岩溶区的固碳减排。近年来一些研究亦表明，CA促进岩溶作用所产生的HCO3-能被藻类利用进行光合作用，将HCO3-转化为相对稳定的有机碳[38-40]。因此，对岩溶区土壤中产CA微生物驱动的自养固碳过程的研究亦不容忽视。
2 岩溶区土壤固碳功能微生物 2.1 岩溶区固碳微生物的群落组成近年来，岩溶区土壤的固碳能力得到广泛关注，固碳微生物在其中扮演了重要角色。因此，对岩溶区土壤固碳微生物群落的研究逐步受到重视。土壤中的固碳微生物包括细菌、真菌和古菌[41-43]，其中对固碳细菌的研究最为广泛。由于cbbL、cbbM基因分别编码卡尔文-本森循环的特征酶1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCO)的Ⅰ型和Ⅱ型的大亚基，且具有高度保守性，因此可以通过检测土壤中cbbL和cbbM功能基因的多样性以分析土壤中的固碳细菌群落[24, 44-45]。张双双等[41]以cbbLR为固碳细菌的指示基因，比较岩溶区、混合区与非岩溶区三类区域土壤中固碳细菌的群落结构特征，发现三类区域土壤中固碳细菌均属于变形菌门和放线菌门。岩溶区具有一些丰度较高的微生物，如伯克氏菌目(Burkholderiales)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)和费氏根瘤菌(Sinorhizobium fredii HH103)等。作者课题组[46]利用cbbL和cbbM功能基因，对桂林会仙3种状态岩溶湿地(原生湿地、自然退化湿地和人为垦殖湿地农田)土壤中的固碳细菌群落结构进行了分析，结果显示其群落结构基本相似，但部分优势菌属的相对丰度存在显著差异，如Thiomonas在原生湿地土壤中相对丰度较高，Sulfuricaulis、Ferriphaselus等在垦后湿地土壤中相对丰度较高，而在自然退化湿地土壤中Bradyrhizobium相对丰度较高；不同状态岩溶湿地土壤中理化性质的差异改变了固碳微生物群落结构，主要的土壤影响因子有土壤有机碳(SOC)及其组分包括可溶性有机碳(DOC)、微生物量碳(MBC)和易氧化有机碳(ROC)，以及土壤温度等。目前对岩溶区土壤中具有固碳功能的真菌和古菌的研究尚比较缺乏，已有研究表明丛枝菌根真菌(AMF)和氨氧化古菌在土壤的碳固定中发挥着一定作用[42-43]。
GeoChip功能基因芯片是近些年来发展的一种研究微生物群落的技术，该技术能够对微生物参与的代谢途径相关的功能基因及其代谢潜力等进行研究。例如，Yu等[47]利用GeoChip 5.0对4年来少施氮肥并且进行间作的甘蔗田的土壤微生物功能基因进行了研究，共检测到与碳固定过程相关的基因2383个，其中古细菌88个、细菌2270个、真菌7个；在施氮肥和间作4年后，能分离出大部分与碳固定和碳降解有关的功能基因。不过，目前尚未见有关利用GeoChip功能基因芯片技术研究岩溶区土壤中固碳微生物群落的报道，对于岩溶土壤中特有的固碳微生物种群的认识尚有待于进一步深入研究。
2.2 固碳功能微生物的分离及其固碳潜力目前尚未分离培养的微生物大约占微生物种类的99%[48]，由于许多的基因储存在尚未发现其具体功能的未知的基因数据库中，因此分离培养具有固碳功能的微生物仍然是优先考虑的思路[49]。若能分离得到岩溶土壤中具有固碳功能的微生物纯培养物，研究人员便可对其直接进行更深层次的生理生化机制研究，为进一步认识固碳微生物在岩溶生态系统中的功能提供理论基础，并为其在岩溶生态环境保护与修复、固碳减排中的应用提供科学依据。
目前有关岩溶区土壤中固碳功能微生物的分离及其固碳潜力方面的研究鲜见报道，而对岩溶区水体中微藻的分离及其固碳能力的研究已有一些报道。例如，王培等[50]从岩溶区寨底地下河出口筛选出小球藻(Chlorella)，将其与非岩溶区小球藻进行了无机碳利用率的比较研究，结果显示岩溶区筛选出的小球藻对HCO3-吸收转化成有机碳的利用率较非岩溶区小球藻高约10%，表明岩溶区小球藻的碳汇能力更大。程文理等[51]从岩溶区水体中筛选得到了小球藻(Chlorella)和栅藻(Scenedesus)，并利用气升式防贴壁藻类培养装置，研究不同光照强度和HCO3-浓度对微藻固碳能力的影响，结果表明高浓度HCO3-以及高光照条件下微藻培养过程形成更多难降解有机质，具有更强的稳碳能力。但是微藻培养所需的环境条件较严格，需要光照，且培养面积较大，因此，对无需光照的化能自养微生物的分离及其固碳潜力研究有利于在更广泛的环境条件下发挥微生物的固碳功能，对固碳减排具有重要意义[52]。
在岩溶区土壤中可能存在大量的化能自养微生物[16]，其以CO2为无机碳源，主要通过氧化H2、S2O32-、NH4+及Fe2+等还原态无机物质获得能源，可分为严格化能自养菌和兼性化能自养菌[27, 53]。目前虽然从岩溶区土壤中分离筛选化能自养微生物的研究鲜见报道，但是从非岩溶区土壤中分离筛选化能自养微生物及对其进行固碳潜力方面的研究已有一些报道。例如，王竞等[54]利用筛选培养基，采用置换排气法配气，优化培养基中H2、O2、CO2的比例，从花园土壤中分离筛选到一株氢氧化细菌，能够高效固定CO2；Khalifa等[55]以硫化亚铁(FeS)作为能量来源，采用改良的矿物培养基从日本稻田土壤中分离得到1株铁氧化菌，命名为Ferrigenium kumadai gen. nov., sp. nov.，对其16S rRNA基因序列的分析表明，该菌株属于披毛菌科(Gallionellaceae)，其在系统发育上与该家族的其他成员不同；郭珺等[56]利用无碳源的无机培养基从太原市东太堡污水处理厂的活性污泥、沼液、设施土壤等多种生态环境中分离筛选出生长较快的8株固碳菌株，经鉴定分别隶属于假单胞菌属(Pseudomonas)和嗜甲基菌属(Methylophilus Jenkins)，将生长较快的菌株施用到土壤后，土壤中的RuBisCO酶活性升高，认为筛选出的菌株具有一定的固碳潜力。综上，国内外学者通过对培养条件的不断优化，从非岩溶区不同生境土壤中不断分离筛选出新的化能自养微生物，其技术和方法可为从岩溶区土壤中分离筛选具有高效固碳潜力的化能自养微生物菌株提供借鉴和参考。
3 岩溶区土壤微生物自养固碳的分子机制目前已报道的岩溶区土壤中的优势固碳微生物主要是通过卡尔文循环途径进行碳固定[41]，例如，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)能利用H2、硫代硫酸钠、H2S等作为电子供体，而慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)能利用NH4+、NO2-、S2-、H2S、H2、Fe2+等作为电子供体，为卡尔文循环提供能量进行CO2的固定[57-58]。基因组分析显示，卡尔文循环可分为3个阶段：CO2的固定、PGA的还原和1, 5-二磷酸核酮糖(RuBP)的再生[59]。第一阶段CO2的固定：RuBisCO酶催化一分子CO2整合到五碳糖分子(RuBP)第二位碳原子上，得到一种非常不稳定的中间产物，其立即分裂为2 mol的3-磷酸甘油酸(PGA）；随后第二阶段PGA的还原：PGA被NADPH还原得到3-磷酸丙糖；最后第三阶段RuBP的再生：3-磷酸丙糖通过一系列紧密联系的复杂生化反应生成一分子(CH2O)和一分子RuBP，该循环重复运行6次后生成一分子葡萄糖，为自养微生物的生长代谢提供能源。
已报道的化能自养微生物的固碳途径除了卡尔文循环以外，还有3-羟基丙酸/4-羟基丁酸途径、厌氧乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸途径双循环途径和还原性三羧酸循环途径。目前在岩溶区土壤中这4种自养微生物固碳途径的研究尚鲜见报道，但是在非岩溶区生境中已有一些发现。例如，氨氧化古菌(AOA)主要是通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸(3-HP/4-HB)途径固定CO2[60-61]，3-羟基丙酰-CoA脱氢酶和4-羟基丁酰-CoA合成酶是该途径的关键酶。在产乙酸菌、硫酸盐还原菌和甲烷氧化菌等细菌中发现了厌氧乙酰辅酶A途径，CO2通过CO脱氢酶的催化作用被还原，再利用乙酰-辅酶A固定CO2，CO脱氢酶是该途径的关键酶[25, 62-63]。3-羟基丙酸途径首次在绿弯菌(Chloroflexus)中被发现[64]，该途径包含2个循环过程，首先利用乙酰-CoA的羧基化作用将碳酸氢盐固定形成乙醛酸盐，随后乙醛酸盐和丙酰辅酶A歧化生成乙酰辅酶A和丙酮酸[65]。还原性三羧酸循环主要存在于少数光合紫色细菌和绿硫细菌中，CO2通过琥珀酰-CoA的还原性羧化作用被固定，该循环过程的关键酶为铁氧化还原蛋白酶、富马酸还原酶及ATP柠檬酸裂解酶[66]。
目前人们对岩溶区自养微生物驱动土壤固碳的机制研究较少，但是宏基因组学、稳定同位素探针(SIP)等分子生态学技术的快速发展为岩溶区土壤微生物自养固碳的分子机制的探索提供了新的技术手段。例如，Li等[16]采用13C-NaHCO3作为标记底物，通过DNA-SIP技术对贵阳岩溶石漠化生态系统3种类型(草地、森林和农业)土壤中的化能自养细菌进行了分析，结果表明，Ralstonia、Ochrobactrum、Brevibacterium、Acinetobacter和Corynebacterium能够利用硝酸盐或硫代硫酸盐作为电子供体进行生长，吸收无机碳作为碳源，同时通过DNA-SIP分析也鉴定出了可能的混合营养体，通过共生网络进一步表明，自养微生物和异养微生物可能形成共生群落来维持生态系统的功能，揭示了化能自养菌在岩溶石漠化生态系统中具有一定的固碳作用。
目前，将SIP技术与多种分析技术如纳米二次离子质谱技术(NanoSIMS)、透射电子显微镜(TEM)成像技术等手段相结合，能够直接研究微生物单细胞水平的代谢功能，对于深入研究微生物驱动的土壤碳循环机制意义重大。例如，Tourna等[67]从草地和花园土壤中富集到一株氨氧化古菌Nitrososphaera viennensis，为了验证该菌能够利用丙酮酸中的C元素来合成自身的细胞组织，他们用含有13C-丙酮酸的培养基培养N. viennensis，然后运用NanoSIMS技术对培养后的菌液样品进行分析，发现大约有10%的C元素来自13C-丙酮酸，其余的C主要来自Nitrososphaera viennensis对碳酸氢盐的固定，该技术为研究氨氧化古菌的生理代谢机制提供了新的思路。Ploug实验室[68-69]将同位素标记技术与NanoSIMS和TEM成像技术相结合，分析海洋中的碳氮循环时发现了丝状蓝藻Nodularia spumigena和Aphanizomenon sp.的重要性，同时结合微传感器技术测定它们在单细胞水平的氮固定和碳固定速率，发现在光照下两者的单个细胞的净C: N固定率分别为8.0±0.8和7.3±3.4。虽然目前这些技术手段在岩溶区土壤微生物驱动的自养固碳机制研究中的应用尚未见报道，但它们在其他领域研究中的成功运用亦为深入研究岩溶区土壤微生物自养固碳的分子机制提供了借鉴和参考。
4 岩溶区土壤微生物自养固碳的生态环境意义全球岩溶面积占陆地生态系统的15%[70]，我国岩溶面积占全球岩溶总面积的15.6%[71]，岩溶碳汇量可能达到3.7×107 t C/a[72]。在岩溶区土壤中具有CO2同化功能的微生物主要包括自养微生物和异养微生物，由于两者的固碳机制不同，前者固定CO2的能力一般大于后者[73-74]，且自养微生物在岩溶区土壤中广泛存在[16]。相比于异养微生物，自养微生物不需要利用土壤中已有的有机碳，新输入的“碳”能够增加土壤的碳储存，可能会对整个岩溶区土壤的固碳机制有重要影响。此外，由于微生物的自养固碳过程，有机物降解过程中相对惰性的碳可能转化为更难降解的形式，并可以长期储存在土壤中，提高土壤的固碳潜能。因此，自养微生物可能是岩溶区土壤生物固碳的重要贡献者。加强对岩溶区自养微生物的基础及应用研究，有利于提升岩溶区土壤的固碳潜能。
近年来以土地退化为主要特征的岩溶环境问题日益严峻，而岩溶自然生态系统受到人为干扰后会发生退化，土壤有机碳含量会相对下降，对土壤的固碳能力产生影响[71, 75]。基于此，研究岩溶区土壤固碳功能微生物及其驱动的自养固碳分子机制以及产生的生态效应，对于提高岩溶区土壤的固碳潜能、保护和恢复土壤功能，应对气候变化及人类活动引起的土壤退化风险具有重要意义。
5 结语与展望自养微生物是岩溶区土壤固碳的重要驱动因素，为科学认识岩溶土壤生态系统的固碳潜力奠定了一定基础。目前有关岩溶区土壤微生物驱动的自养固碳的生物地球化学过程和分子生态学机制尚不清楚，一些关键科学问题亟待开展广泛深入的研究以作出科学的解释，例如：岩溶土壤生态系统中微生物驱动的土壤固碳过程是否为自养微生物与异养微生物共同参与的结果，还是自养微生物是这一过程的主导者？真菌和古菌在岩溶土壤中的固碳潜力有多大？不同自养固碳途径对环境变化的响应有何不同？自养固碳的贡献有多大，固定下来的有机碳有多少可转化为岩溶土壤中难降解的惰性有机碳？另一方面，基于固碳功能基因分析岩溶土壤环境中自养固碳微生物的多样性及碳同化机制的研究尚有待深入，尤其是采用基因组、转录组、蛋白组及代谢组等组学联合分析，探索可能存在的新的碳同化机制亟待加强。通过对不同岩溶生境中固碳微生物培养条件的不断优化，能够分离得到更多未知的固碳微生物的纯菌株，为固碳微生物的理论及应用研究提供更加丰富的菌种资源。而且，随着合成生物学的快速发展，基于对固碳微生物的固碳途径及其分子机制的深入研究和认识，人为改造菌株，从而提高自养固碳微生物的固碳效率，为固碳减排、实现碳中和提供新的途径和菌种资源。
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