兔出血症病(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，又称兔瘟、兔出血症、兔出血性肺炎，是由嵌杯病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。经典RHDV呈二十面体对称球形，是一种无囊膜的单股正链RNA病毒^[1-2]。该病毒于1984年首次在我国江苏无锡等地暴发^[3]，2月龄以下的吮乳兔或幼兔对本病有较强的抵抗力，不表现出临床症状，而2月龄以上的亚成年兔或成年兔对经典RHDV易感，发病率达100%，病死率达90%，病死兔以肝、脾、肾等器官出血、肿大，鼻腔、气管淤血等为特征^[4-5]。该病潜伏期短、发病急、传播快，给全国养兔业造成了巨大的经济损失。

2020年4月，我国四川省某养兔场发生疑似RHD疫情，感染率为42.86%，死亡率高达为100%。经红细胞凝集试验、RT-PCR及测序分析等，确定该病原为兔出血症病毒2型(RHDV2)，这是我国首次发现RHDV2型毒株。不同于经典RHDV^[5-6]，除成年兔外，RHDV2也可感染致死幼兔与亚成年兔^[7-8]，病死兔病理变化主要表现为气管充盈血色泡沫，肝脏肿大、边缘梗死，脾脏淤血、边缘钝圆，肺脏弥漫性出血等。RHDV2的感染病例由法国于2010年4月首次报道^[9]，导致家养和野生兔群的大面积感染和死亡。在不到一年的时间内，RHDV2迅速席卷南欧(葡萄牙、意大利和西班牙等)，北欧和一些岛屿如亚速尔群岛。2015年，RHDV2在澳大利亚、非洲与其他欧洲国家被发现，次年在加拿大被发现，并继续在欧洲传播。6年后，RHDV2在美洲和大洋洲相继出现^[10]。严重影响世界各国养兔业发展，同时导致全球野兔种群数量的急剧减少，给生态平衡带来严重的负面影响。

经典RHDV组织灭活疫苗对RHDV2的感染仅有有限保护作用^[11]，目前尚无有效防制措施。可通过发病兔群日龄、病死率与临床表现作出初步判断，经实验室检测确诊。应立即扑杀发病兔群，阻止感染面积的扩大，同时对养殖场环境、圈舍、物料等进行全面消毒处理。本研究拟对四川省某兔场疑似RHDV2感染病死兔进行RT-PCR检测及测序分析。并结合PMA-RT-qPCR探究RHDV2理化特性。叠氮溴化丙锭(PMA)是一种与核酸具有高度亲和性的光反应染料^[12]，可嵌入核酸分子并被强可见光激活修饰核酸，进而阻断目的基因的PCR扩增。由于PMA不能穿透病毒衣壳，因此以其处理含有失活病毒和仍具复制能力病毒的样品时，可修饰失活病毒(衣壳结构破坏)核酸，结合PCR可实现对样品中具有复制能力病毒的定性定量检测^[13]。本研究结论可为RHDV2致病机理研究、疫苗研发提供参考材料和理论依据，为临床生产中饲料制粒工艺优化、高效消毒剂与疫苗灭活剂选择提供指导。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 样品来源: 病料样品来源为2020年4月四川省某兔场疑似RHDV2感染的病死兔(20–60日龄)。

1.1.2 主要试剂和仪器: 病毒基因组RNA提取试剂盒购自于宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq PCR Master Mix、2×SYBR Green Pro Taq HS Premix、反转录试剂盒购自于湖南艾科瑞生物工程有限公司；叠氮溴化丙锭(PMA)购自Biotium公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 引物序列: PCR和qPCR引物参考本实验室已建立的方法^[14] (表 1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体积(20 μL)包含10 μL的2×SYBR Green Pro Taq HS Premix或2×Taq PCR Master Mix，每种引物(F/R) 1 μL (10 μmol/L)，2 μL模板，ddH₂O补足20 μL。

1.2 病死兔剖解及样品处理

在严格生物安全条件下对送检病死兔进行解剖，采集心脏、肺脏、脾脏、肝脏和肾脏用于提取病毒RNA。

1.3 RNA的提取与cDNA合成：

取病变组织，按宝生物生物技术有限公司病毒RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取病毒RNA，–80 ℃备用。以提取的RNA作为模板，使用反转录试剂盒获得cDNA于–20 ℃保存备用。

1.4 RT-PCR与RT-qPCR检测

以上述反转录获得的cDNA作为模板，以RHDV2-PCR-F/R引物进行扩增。反应结束后，取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果用BLAST比对分析。核酸阳性样品以RHDV2-qPCR-F/R引物进行qPCR检测，验证该引物的特异性。

1.5 病毒液的制备

含RHDV2肝脏和脾脏组织，研磨成匀浆并反复冻融3次。用无菌0.22 μm滤头过滤制成病毒液，分装后于–80 ℃保存。

1.6 病毒片的制备

制备大小为10 mm×10 mm的无菌方形滤纸片若干作为吸附介质，平铺于无菌平皿内，逐片滴加病毒液，滴加量为10 μL/片。用接种环涂匀整个介质表面，置室温下自然阴干后备用。

1.7 RHDV2对酸碱敏感性

用50 μL HCl (pH=1、pH=3)或NaOH溶液(pH=10、pH=13)均匀滴加于病毒片表面，静置30 min后，取病毒片于含500 μL无菌蒸馏水的离心管中振荡离心，取200 μL备用，每样重复3组。

1.8 RHDV2对热敏感性

将病毒片置于离心管中，经65 ℃处理30 min，85 ℃处理30 s、1 min、2 min、3 min后，分别置于含500 μL无菌蒸馏水的离心管中振荡离心，取200 μL备用，每处理重复3组。

1.9 RHDV2对兽用消毒剂敏感性

将病毒片置于一次性无菌培养皿中，用50 μL过硫酸氢钾(0.5%)、聚维酮碘(0.1%)、75%酒精，均匀滴加于病毒片表面，作用30 min后，收集病毒片于含500 μL无菌蒸馏水的离心管中，取200 μL备用，每样重复3组。

1.10 RHDV2对不同浓度甲醛的敏感性

用50 μL 0.2%、0.3%甲醛分别均匀滴加于病毒片表面，作用30 min后，收集病毒片于含500 μL无菌蒸馏水的离心管中，取200 μL备用，每样重复3组。

1.11 PMA处理样品与RHDV2 PMA-RT-qPCR检测

200 μL各处理组样本，分别加入10 μL PMA染液(至终浓度2 mmol/μL)，1500 r/min，离心10 min。再置于暗室孵育15 min。将所有管置于冰上，在500 W卤素灯下照射15 min后保存备用。使用病毒基因组RNA提取试剂盒提取上述各处理组样品的病毒RNA，用于RT-qPCR检测。

1.12 数据分析

统计归纳各组RT-qPCR检测所得拷贝数，并对拷贝数做log转换处理。计算各处理病毒杀灭率(公式1)。

(1)

2 结果和讨论 2.1 病毒RNA提取与核酸检测

用引物RHDV2-PCR-F/R扩增VP60基因序列，产物经琼脂糖凝胶电泳可见在441 bp左右有一特异性扩增条带(图 1)，产物测序后经BLAST比对分析，结果显示，目的片段基因序列与GenBank中RHDV2 VP60基因(登录号：MN276176.1)的一致性为98.35%。

组织病料提取RNA进行RT-qPCR检测，结果表明，RHDV2为阳性，经典RHDV、兔巴氏杆菌、欧洲褐兔综合征病毒(European brown hare syndrome virus，EBHSV)均为核酸阴性^[15] (图 2-A、B)。

2.2 RHDV2对酸碱敏感性

用不同pH值的酸碱处理病毒片后，提取病毒RNA并进行PMA-RT-qPCR检测，每处理重复3组，计算病毒拷贝数均值以及病毒杀灭率。结果表明，RHDV2对酸碱均敏感，随pH值降低或升高，病毒杀灭率均有提高(表 2)。RHDV2对盐酸(pH=3)与氢氧化钠溶液(pH=10)敏感性较低，随pH值降低或升高，病毒杀灭率均有提高。与经典RHDV相比，RHDV2同样对酸碱有一定的耐受力^[16]。在实际生产应用中，盐酸(pH=1)或氢氧化钠溶液(pH=13)可用于养殖场内环境(如地面、圈舍、沟渠等)与外环境(养殖场外围、公路等)的消毒，但在使用后需注意对废液的中和处理，以免影响环境。

2.3 RHDV2对热敏感性

病毒片置于无菌离心管，经65 ℃处理30 min，85 ℃处理30 s、1 min、2 min、3 min后，提取病毒RNA并进行PMA-RT-qPCR检测，每处理重复3组，计算病毒拷贝数均值以及病毒杀灭率。结果表明，两种试验温度均对RHDV2有杀灭作用，65 ℃处理毒片30 min后，病毒杀灭率可达77.61%。用83 ℃处理毒片，病毒杀灭率随时间的延长而升高，处理时间延长至3 min对病毒的杀灭率有大幅度提升(表 3)。在实际饲料生产中，调制与制粒过程(80–83 ℃)不仅可以杀灭细菌^[17]，也能对原料中可能存在的RHDV2有杀灭作用，生产中针对消除RHDV2潜在威胁的制粒工艺优化可考虑适当延长作用时间。

2.4 RHDV2对兽用消毒剂敏感性

用不同兽用消毒剂处理病毒片后，提取病毒RNA并进行PMA-RT-qPCR检测，每处理重复3组，计算病毒拷贝数均值以及病毒杀灭率。结果表明，试验所用3种消毒剂对RHDV2的杀灭率均在80%以上，其中聚维酮碘对RHDV2杀灭作用最好，病毒杀灭率高达88.78%；75%乙醇其次，杀灭率可达84.51%；0.5%过硫酸氢钾杀灭率为80.05% (表 4)。据此，在生产中可选择高效且成本可控的消毒剂。

2.5 RHDV2对不同浓度甲醛的敏感性

用两种浓度甲醛处理病毒片后，提取病毒RNA并进行PMA-RT-qPCR检测，每处理重复3组，计算病毒拷贝数均值以及病毒杀灭率。两种浓度的甲醛对病毒都有杀灭作用，0.3%甲醛的杀灭率优于0.2%甲醛，杀灭率可达82.22% (表 5)。甲醛是灭活疫苗生产中常用的灭活剂^[18]，适当浓度的甲醛灭活病毒后，病毒抗原性、血凝性均不改变，故常用于灭活疫苗的制备。其作用浓度为0.1%–0.8%，需37–39 ℃处理24 h以上。鉴于经典RHDV组织灭活疫苗对RHDV2的感染仅有有限的保护力，故需研发针对RHDV2的有效疫苗。本研究结果表明，甲醛可有效灭活RHDV2，可用于疫苗制备。

由于RHDV2不能在体外培养，阻碍了对该病毒的进一步研究。经典RHDV的理化特性研究是将病毒液处理后，注射在兔体内，以其发病率和死亡率作为研究结果^[19]。但该方法受到试验动物自身健康状态、饲养环境等因素的限制，且结果并不代表病毒拷贝数的改变。故经典RHDV的理化特性研究仍有待进一步完善。本研究采用PMA-RT- qPCR用于RHDV2理化特性的检测，利用PMA修饰失活病毒核酸阻断PCR扩增，结合qPCR实现了对待检病毒是否具有复制能力的区分，为今后开展RHDV2相关研究提供重要的科学依据。