2021, Vol. 61中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 兰仙软, 王雨坤, 吴昊鸣, 卢姗, 仇金凤, 李茹, 陈保善. 2021
- Xianruan Lan, Yukun Wang, Haoming Wu, Shan Lu, Jinfeng Qiu, Ru Li, Baoshan Chen. 2021
- 甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的早期可视化观察
- Visualization of the early infection stage of Sporisorium scitamineum in sugarcane cultivars
- 微生物学报, 61(3): 596-606
- Acta Microbiologica Sinica, 61(3): 596-606
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文章历史
- 收稿日期：2020-04-19
- 修回日期：2020-07-31
- 网络出版日期：2020-08-10
引用本文 |
2. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西 南宁 530004;
3. 广西甘蔗生物学重点实验室, 广西 南宁 530004;
4. 广西大学农学院, 广西 南宁 530004
2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning 530004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China;
3. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology, Nanning 530004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China;
4. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
甘蔗黑穗病(sugarcane smut disease)是一种在世界范围内广泛发生的甘蔗真菌性病害[1]。染病甘蔗最明显的特征为蔗稍抽出长而细的黑色鞭状物，而在尚未出现黑鞭前，染病甘蔗表现为蔗种萌芽早，主轴叶片细长直立，叶色淡绿，茎细长，分蘖增多[2-3]。甘蔗黑穗病严重影响甘蔗产量以及蔗汁质量，一旦大面积暴发将会造成严重的经济损失[4]。引起甘蔗黑穗病的病原菌是担子菌亚门黑粉菌属的甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)，该菌生活史可分为3个不同的阶段：单倍体酵母样孢子、双核菌丝和二倍体冬孢子[5]。其中单倍体孢子不具备侵染甘蔗的能力，而由不同交配型单倍体进行有性配合后形成的双核菌丝体具有致病性，能穿透植物组织进行侵染[5-6]。侵染菌丝吸取寄主体内的营养物质并随着蔗株生长点向上生长而逐渐向上蔓延，最终在蔗稍抽出黑鞭，黑鞭中充满大量的冬孢子。病菌冬孢子可随气流进行远距离传播，亦可落入土壤长期存活[7]。冬孢子在适宜的环境条件下萌发出长短不一的担子，每个担子细胞又可以产生1至数个单倍体担孢子，异型担孢子配合后可再次侵染蔗株完成其生活史[8-9]。
甘蔗抗病品种的培育是目前控制甘蔗黑穗病最为经济有效的手段[10]。雷敬超等对甘蔗常用亲本黑穗病抗性进行了调查，筛选出了大量优质抗病育种材料[11]。熊国如等对23个甘蔗品种进行黑穗病抗性鉴定，发现云蔗99-596、粤甘42、桂糖29和福农39具有良好的黑穗病抗性[12]。最近由本实验室培育的甘蔗新品种(系)中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号具有高产、高糖、耐旱、耐寒等优点，并且拥有很好的黑穗病抗性[13]。目前甘蔗响应黑粉菌侵染的机制尚未明确，有关黑粉菌侵染甘蔗过程的研究还比较少。为方便示踪甘蔗鞭黑粉菌对甘蔗的侵染过程，本研究构建了黑粉菌强启动子启动的黄色荧光蛋白eYFP表达的表达载体，利用根癌农杆菌介导的转化技术将eYFP报告基因表达载体转化至甘蔗鞭黑粉菌[14]，获得了能持续稳定表达黄色荧光蛋白的甘蔗鞭黑粉菌标记菌株JG35-eYFP和JG36-eYFP。利用这一对荧光标记菌株对抗病、感病甘蔗的生长点进行侵染，并对侵染的早期阶段进行可视化研究，以期初步解析中蔗系列品种甘蔗的抗病机制。
1 材料和方法 1.1 试验材料1.1.1 材料与菌株: 供试甘蔗品种有ROC22、中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号。其中ROC22为高感黑穗病的广西主栽甘蔗品种，中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号为本实验室近年来自主培育的甘蔗新品种(系)，具有很强的黑穗病抗性。供试菌株有甘蔗鞭黑粉菌单倍体JG35、JG36，农杆菌AGL1，均为本实验室保存。
1.1.2 载体: 双元载体pEX1-GAP-eGFP由华南农业大学姜子德教授惠赠。
1.1.3 试剂: In-Fusion HD Cloning Kit、Prime STAR Max Premix (2×) DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根公司；快速限制性内切酶购自赛默飞公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 含eYFP报告基因重组质粒的构建根据本实验室前期甘蔗鞭黑粉菌转录组测序结果，选取在甘蔗鞭黑粉菌生长发育的各个时期(单倍体、冬孢子产生初期、中期及后期)都高效表达的基因g6182的启动子序列。分别用PCR获得启动子片段及eYFP片段，通过融合PCR[15]得到融合片段RB1-Pg6182-eYFP。用PmeⅠ和PacⅠ对双元载体pEX1-GAP-eGFP进行酶切，切除GAP-eGFP片段，并使用In-Fusion克隆技术将融合片段RB1-Pg6182-eYFP连入双元载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒用PmeⅠ和PacⅠ进行酶切鉴定，并经测序后保存正确的重组质粒pEX1-RB1-Pg6182-eYFP。本研究所用引物见表 1。
| Primer | Sequence (5′→3′) | Description |
| RB1-pEX1-F | TGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAAT | Fusion PCR |
| RB1-g6182-R | AATCAGCAGTGCCACGCTCTAACATTCGCTGTTTCTTCGGTCAGTCT | g6182 fragment amplification |
| g6182-RB1-F | AAAAGACTGACCGAAGAAACAGCGAATGTTAGAGCGTGGCACTGCTG | g6182 fragment amplification |
| g6182-eYFP-R | ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTTGGCAGTGTATAGTTTGTGTGGA | eYFP fragment amplification |
| eYFP-g6182-F | TCCACACAAACTATACACTGCCAACATGGTGAGCAAGGGCGAGG | eYFP fragment amplification |
| eYFP-pEX1-R | ACATCATAGGGGTAGTTAATTAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC | Fusion PCR |
| g6182-F | ATGTTAGAGCGTGGCACTGCTG | g6182 PCR verification |
| g6182-R | GTTGGCAGTGTATAGTTTGTGTGGA | |
| eYFP-F | ATGGTGAGCAAGGGCGAGG | eYFP PCR verification |
| eYFP-R | TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC |
1.3 农杆菌介导的甘蔗鞭黑粉菌遗传转化
利用甘油法制备农杆菌AGL1感受态细胞，并用电脉冲法将重组质粒转化进入AGL1中[12]。将重组AGL1转接到5 mL含有50 μg/mL利福平(rifampicin，Rif)和50 μg/mL壮观霉素(spectinomycin，Spec)的基础培养基(minimal media，MM)中，培养2 d至OD600=0.9 (28 ℃、200 r/min)，经诱导培养基IM (induce media，IM)稀释至OD600=0.15，添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)至终浓度为终浓度为200 μmol/L后在黑暗28 ℃、200 r/min条件下，诱导培养至OD600=0.5左右。另外在YEPSA平板上划线活化甘蔗鞭黑粉菌单倍体菌株JG35和JG36，并用新鲜的YEPS液体培养基培养菌株至OD600=1.0。
将诱导培养至OD600值为0.5的重组AGL1菌液与OD600值为1.0的JG35、JG36分别等体积混合，涂布到铺有混合纤维素微孔滤膜(孔径为0.45 μm)的含有终浓度为200 μmol/L的乙酰丁香酮的诱导培养基(induce media，IM)平板上，于黑暗条件下，28 ℃倒置培养2–3 d；再将微孔滤膜转移至含300 μg/mL头孢噻肟钠(cefotaxime，Cef)和200 μg/mL潮霉素(hygromycin，Hyg)的YEPS平板上，28 ℃避光倒置培养9 d至长出转化子。
1.4 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记转化子的鉴定在激光共聚焦显微镜下观察转化子，将能产生黄色荧光的菌落转移到YEPS平板(含300 μg/mL Cef+200 μg/mL Hyg)上进行二次筛选。筛选后的阳性转化子利用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit进行DNA提取，用引物g6182-F/R进行PCR验证转化子中是否含有g6182启动子序列，用引物eYFP-F/R进行PCR验证转化子是否具有黄色荧光蛋白基因。
1.5 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记菌株配合能力的检测分别活化菌株JG35、JG36、JG35-eYFP和JG36-eYFP，挑取单菌落于YEPS液体培养基中进行扩大培养，在28 ℃、200 r/min条件下培养2 d后，采用正交试验进行配合，分别取等体积菌液按照JG35+JG36、JG35+JG35、JG35+JG36-eYFP、JG35+JG35-eYFP、JG36+JG36、JG36+JG35、JG36+JG36-eYFP、JG36+JG35-eYFP、JG35-eYFP+ JG36、JG35-eYFP+JG35、JG35-eYFP+JG36-eYFP、JG35-eYFP+JG35-EyfpJG36-eYFP+JG36、JG36-eYFP+JG35、JG36-eYFP+JG36-eYFP、JG36-eYFP+ JG35-eYFP两两混匀，然后取10 μL混合液点在YEPS平板上，放置于28 ℃培养箱倒置培养，每12 h观察配合菌落生长情况，持续观察3 d。
1.6 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记菌株的菌丝荧光观察将含有eYFP报告基因的不同交配型黑粉菌单倍体进行有性配合，于28 ℃培养箱中培养至菌落表面产生白色菌丝，挑取菌丝于荧光显微镜下观察。同时以野生型单倍体配合形成的双核菌丝作为对照。
1.7 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记冬孢子的荧光观察用含eYFP报告基因的黑粉菌(JG35-eYFP+ JG36-eYFP)接种甘蔗品种ROC22，60 d后采集发病黑鞭中的冬孢子。将冬孢子接种于50 μL含有50 μg/mL氨苄西林(ampicillin，Amp)，50 μg/mL卡那霉素(kanamycin，Kan)和150 μg/mL Cef的YEPS液体培养基中，28 ℃、200 r/min进行培养，分别取培养0 h和6 h的样品进行荧光观察。同时吸取20 μL冬孢子稀释液划线于含有100 μg/mL Amp、100 μg/mL Kan、300 μg/mL Cef和200 μg/mL Hyg的YEPS固体培养基中，28 ℃培养72 h。挑取平板上的单菌落进行显微观察。
1.8 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记菌株在甘蔗体内的行为观察将活化好的甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记菌株单菌落接种到YEPS液体培养基，28 ℃、200 r/min培养2 d，取20 mL菌液，按1︰1的比例与对应交配型的单倍体菌株混匀后，用注射接种的方法接种生长至五叶期的甘蔗植株茎尖生长点附近，每株接种1次，每次接种100 μL混合菌液，阳性对照为野生型单倍体菌株JG35+ JG36混合液，阴性对照为灭菌蒸馏水，每接种处理重复3次。于接种后5日、35日从甘蔗植株上采样，对茎尖分生组织部位进行切片，在激光共聚焦显微镜下，观察甘蔗鞭黑粉菌在甘蔗体内的行为。
2 结果和分析 2.1 甘蔗鞭黑粉菌黄色荧光蛋白标记菌株的构建及单倍体荧光稳定性构建含有强启动子序列和eYFP的重组载体pEX1-RB1-Pg6182-eYFP，分别转化至JG35和JG36，分别随机挑取30个转化子进行荧光观察。结果如图 1-A所示，转化子JG35-eYFP和JG36-eYFP在荧光显微镜下均能发出强烈的黄色荧光，而野生型对照菌株JG35和JG36都没有荧光信号。进一步对转化子进行PCR鉴定(图 1-B)，以eYFP基因引物对eYFP-F/R进行PCR，在JG35-eYFP和JG36-eYFP转化菌株中均可扩增出720 bp的目的片段，而在野生型JG35和JG36及空载体pEX1中均扩增不出目的片段；以启动子序列引物g6182-F/R进行PCR，在JG35-eYFP和JG36-eYFP转化菌株中均可扩增出1500 bp的目的片段，而在野生型JG35和JG36及空载体pEX1中均扩增不出目的片段。研究结果说明该荧光报告基因已经转入到真菌中，获得了含有黄色荧光蛋白标记的甘蔗鞭黑粉菌单倍体菌株。
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| 图 1 含eYFP报告基因的甘蔗鞭黑粉菌转化子的荧光观察及PCR检测 Figure 1 Yellow fluorescence observation and PCR analysis of S. scitamineum transformants with eYFP reporter gene. A: yellow fluorescence observed in S. scitamineum transformants with eYFP reporter gene; B: the PCR analysis of S. scitamineum transformants with eYFP reporter; M: 1 kb plus DNA ladder. |
2.2 黄色荧光蛋白标记的甘蔗鞭黑粉菌的配合能力
将含eYFP报告基因的黑粉菌单倍体和野生型单倍体进行有性配合，由图 2-A可看出JG35-eYFP、JG36-eYFP与异型单倍体均能正常配合，形成白色绒毛状菌落，说明eYFP基因不影响其配合能力，仍可产生正常的双核菌丝。将含eYFP报告基因的黑粉菌双核菌丝体与野生型黑粉菌双核菌丝体置于荧光显微镜下进行观察发现，含eYFP报告基因的双核菌丝可以发出明显的黄色荧光信号，而野生型菌株的双核菌丝无黄色荧光信号(图 2-B)。说明eYFP报告基因能在甘蔗黑粉菌的双核菌丝阶段内稳定表达。
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| 图 2 含eYFP报告基因的甘蔗鞭黑粉菌配合能力检测及菌丝体中荧光观察 Figure 2 Mating analysis and yellow fluorescence observation of S. scitamineum with eYFP reporter gene. A: mating behavior of S. scitamineum with eYFP reporter gene; B: yellow fluorescence observed in the fungal hyphae of S. scitamineum with eYFP reporter gene. |
2.3 黄色荧光蛋白标记的甘蔗鞭黑粉菌的致病能力及冬孢子荧光观察
用含eYFP报告基因的黑粉菌接种甘蔗品种ROC22的生长点，60 d后甘蔗出现明显的黑穗病症状，病株长势矮小，在病株的蔗稍部位长出一条“黑鞭”，其形态特征与野生型菌株接种后长出的黑鞭无差异(图 3-A)。在荧光显微镜下观察发现，黑鞭上白色部位没有黄色荧光信号，灰色部位有少量黄色荧光冬孢子，黑色部位表现很强的黄色荧光信号。说明从白色部位到黑色部位的黑粉菌冬孢子逐渐增多，而且荧光报告基因在冬孢子时期也能稳定高效表达(图 3-A)。进一步对冬孢子在培养基中萌发前后进行观察，发现无论是冬孢子萌发形成的菌丝，还是冬孢子萌发后经减数分裂生成的单倍体孢子，在荧光显微镜下均有黄色荧光信号，说明黄色荧光蛋白在黑粉菌冬孢子到单倍体时期都能稳定表达，黄色荧光性状能通过冬孢子稳定遗传(图 3-B)。
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| 图 3 含eYFP报告基因的甘蔗鞭黑粉菌的黑鞭与冬孢子中的荧光观察 Figure 3 Yellow fluorescence observed in the black whip and teliospores of S. scitamineum with eYFP reporter gene. A: yellow fluorescence observed in the different parts of the black whip with eYFP reporter gene; B: yellow fluorescence observed in S. scitamineum teliospores with eYFP reporter gene. Teliospores were incubated in YEPS media and imaged at 0 h, 6 h and 72 h, post-inoculation. |
2.4 黄色荧光蛋白标记的甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的早期可视化观察
将含eYFP报告基因黑粉菌的异形交配型单倍体混合后注射接种甘蔗抗病品种(中蔗1号、中蔗6号、中蔗9号)及感病品种ROC22的生长点。接种后5 d，在接种口周围取样观察，发现在4个甘蔗品种中都能清楚观察到黑粉菌黄色荧光菌丝，菌丝沿细胞间隙生长。在感病品种ROC22号中菌丝扩散程度大，可见少量聚集状菌丝体；在抗病品种中蔗1、6、9号甘蔗中可见少量单一丝状，无聚集状菌丝体(图 4-A)。
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| 图 4 含eYFP报告基因的甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的早期可视化观察 Figure 4 Visualization of the early stage infection with an eYFP-tagged S. scitamineum in sugarcane cultivars. A: visualization of different sugarcane cultivars at day 5 post-inoculation; B: visualization of different sugarcane cultivars at day 35 post-inoculation. |
接种后35 d，取样观察发现4个甘蔗品种体内的菌丝形态发生变化，菌丝不再单一，变成高度螺旋盘绕的菌丝体。在ROC22中可见大量聚集状菌丝体，但在中蔗品种中的聚集状菌丝体明显较少，而以中蔗1号最少(图 4-B)。上述结果表明，中蔗系列品种存在抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝体在细胞间扩展的机制。
3 讨论荧光报告基因具有分子量小、对活细胞无毒性、易被检测、易于区别、荧光稳定和直观可视性等优点，目前在生命科学等领域被广泛应用[16]。将荧光报告基因同目的基因相连接，通过产生的荧光可以直观观测到目的基因的表达情况。2016年，Yan等[17]成功向甘蔗鞭黑粉菌中导入了荧光蛋白GFP和RFP，构建了含GFP与RFP的双色成像报告系统，并用于对甘蔗鞭黑粉菌整个生命周期的发育进行观察。但该系统未能在甘蔗体内成功应用，作者推测是由于甘蔗组织自发的荧光作用较强导致。Carvalho等[18]用GFP标记甘蔗鞭黑粉菌研究其完整的真菌生命周期，发现GFP标记的黑粉菌能够感染甘蔗组织，产生有活性的冬孢子并定植甘蔗体内，然而他们未对菌丝在甘蔗体内的侵染过程进行连续示踪。
最近由本实验室培育的甘蔗新品种(系)中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号具有很好的黑穗病抗性，但其抗病机制还未明确[13]。如果能构建一个在甘蔗体内高效表达荧光信号的黑粉菌标记菌株，就可以为研究中蔗系列甘蔗对黑穗病的抗病机制提供有力的工具。朱丽萍等曾对eGFP、mCherry、YFP、wGFP、RFP 5种荧光基因在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中表达的强度进行对比，结果发现YFP表现出更好的荧光特性，表达强度最明显[19]。Day等报道增强型黄色荧光蛋白eYFP是荧光最强、应用最广泛的荧光蛋白之一[20]。因此本研究选用eYFP作为报告基因导入甘蔗鞭黑粉菌构建荧光报告菌株。
启动子在基因转录调控中占有核心地位，决定基因的表达水平[21]。为了降低植物本身自发荧光的干扰，构建在甘蔗鞭黑粉菌各个生命周期都高效表达报告基因的标记菌株，我们选用了一个甘蔗鞭黑粉菌各个时期都能高效表达的基因的组成型启动子来启动报告基因的表达。本实验室前期转录组测序结果发现，甘蔗鞭黑粉菌的g6182基因在各个生命时期的表达量都很高，由此推测调控该基因表达的上游启动子是一个高效表达的组成型启动子。利用该基因的CDS序列，我们获取该基因上游1500 bp的启动子序列，用于启动下游荧光报告基因的表达。
通过对eYFP标记的黑粉菌株进行有性配合及致病力检测表明，eYFP的组成型表达不影响甘蔗鞭黑粉菌的配合及致病能力。而且荧光显微观察结果也表明eYFP报告基因在黑粉菌单倍体孢子、双核菌丝体、二倍体冬孢子3个生命周期中都能稳定高效表达，说明本研究构建的荧光报告系统是一个高效的、稳定的组成型表达系统，可以用于示踪甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的过程。
将成功构建的eYFP报告菌株通过注射接种的方式对本实验室选育的中蔗系列品种甘蔗进行了侵染实验，初步观察结果表明，在接种后5 d以及35 d的甘蔗组织内均可以观察到较强的发黄色荧光信号的黑粉菌，并且基本无植物背景干扰。在接种后5 d及35 d时，中蔗系列品种体内黑粉菌量较少，菌丝(体)扩散程度低；而感病品种ROC22甘蔗体内菌丝量相对较多且菌丝扩散程度大。由于本研究采用的是注射接种的方式进行黑粉菌侵染，黑粉菌进入甘蔗体内时已经突破了外层的物理屏障，但依然在中蔗系列甘蔗中形成的菌丝较少，因此初步推测中蔗系列品种甘蔗体内可能产生某种(些)化合物抑制了菌丝的扩散。已有研究表明，抗病品种甘蔗的抗病性与其自身产生的多胺含量[22-23]、酚类物质[24]、内源激素[25]和糖蛋白[26]等有关。中蔗系列甘蔗的抗病机制是否也是这些物质，需进一步实验证明。
迄今为止对甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗过程的报道仍很少，本研究构建的荧光报告系统的荧光蛋白表达量和荧光强度均优于之前报道的荧光标记系统，可用于示踪甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的过程，有助于在细胞生物学层面揭示致病性和甘蔗抗黑穗病机制，为抗病品种的选育以及黑穗病的防治奠定基础。
致谢
感谢华南农业大学姜子德教授惠赠的双元载体pEX1-GAP-eGFP。
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