目前，糖尿病患者的数量在全球范围内持续增长，其中以2型糖尿病为主，约占患者总数的90%以上^[1−2]。临床研究表明，口服降糖药、合理控制饮食以及适当的运动可有效改善餐后血糖浓度，从而能够减缓部分心脑血管病等慢性并发症的发生^[3]。目前用于治疗糖尿病的降糖药主要有胰岛素增敏剂、促胰岛素分泌剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等^[4]。由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有预防心血管疾病等功效，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物^[5]。在2017年版的《中国2型糖尿病防治指南》中，阿卡波糖被列入治疗2型糖尿病的一线用药。

20世纪70年代，在游动放线菌SE50 (Actinoplanes sp.)的发酵产物中首次分离得到阿卡波糖^[6]。其化学结构由氨基环醇、4-氨基-4, 6-脱氧葡萄糖和麦芽糖三部分组成(图 1)。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌SE50的染色体上成簇分布，组成acb基因簇^[7]。该基因簇(图 5-A)由22个基因构成，长约30 kb，按照基因功能的不同可将已知基因分为2个大类：acbAB和acbVUSRPIJKMLNOC为阿卡波糖生物合成基因；acbWXY和acbFGH为转运蛋白基因^[8]。在acb基因簇中没有任何与调控相关的基因，推测存在簇外调控因子对acb基因簇的转录起到调控作用，这为研究其生物合成基因的调控机制带来了挑战。

调控因子可以通过直接或间接识别并结合特定的DNA序列，从而调控基因的转录效率^[9]。有些调控因子是全局性或多效性调控因子，调控范围比较广泛，如天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor中的Crp、WblA、GlnR，均能参与多条代谢途径的调控^[10−14]。途径特异性调控因子通常在基因簇内，能特异性地调控簇内结构基因的转录，如PapR6能特异性地调控普那霉素生物合成，在SE50/110中麦芽糖酶基因amlE受到其上游转录因子AmlR的调控，在Streptomyces sp. FR-008中，fscR1、fscR2、fscR3和fscR4四个调控基因对多烯抗生素杀念菌素的生物合成具有重要调控作用^[15−17]。由于放线菌的转录调控系统非常复杂，对于调控因子的寻找及其功能解析比较困难。通过启动子区域DNA亲和层析技术钓取与DNA片段特异结合的蛋白，继而验证其功能，是解析放线菌生物合成调控机制的一种新策略^[18]。在恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis L10中，利用wblAch启动子DNA亲和层析技术成功钓取到正调控蛋白AdpAch^[19]。因此，本研究以acb基因簇的2个双向启动子P_WV、P_AB为探针，利用DNA亲和层析技术钓取到与该启动子区域结合的调控蛋白，并通过体内基因强化表达与敲除确定了它们与阿卡波糖产生、阿卡波糖生物合成基因转录水平的相关性，并实现了高产改造，为深入解析阿卡波糖生物合成的转录调控机制及其高产奠定了基础。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、引物:

本研究中所用菌株、质粒和引物见表 1。

1.1.2 主要试剂和仪器:

实验所用限制性内切酶、反转录酶、EMSA试剂盒等购自Thermo Scientific公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；各种抗生素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母提取物等培养基相关试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司；本研究所用引物和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本研究所用仪器主要包括安捷伦公司的液相色谱、伯乐生命医学产品有限公司的PCR仪、宁波新芝生物科技有限公司的超声破碎仪、德国耶拿分析股份公司的荧光定量PCR仪、GE公司的多功能激光扫描成像仪。

1.1.3 培养基和培养方法:

LB培养基(g/L)蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5。STY菌株活化培养基(g/L)：蔗糖30，蛋白胨5，酵母提取物5，酪蛋白水解物1，磷酸氢二钾1，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.05，琼脂20。SM培养基(g/L)：葡萄糖15，麦芽糖10，麦芽提取物10，甘油10，蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氢二钾1，酪蛋白水解物1。SAM培养基(g/L)：黄豆饼粉20，甘露醇20，琼脂20，pH 7.2。种子培养基(g/L)：黄豆饼粉40，麦芽糖15，葡萄糖10，甘油10，可溶性淀粉10，碳酸钙2.5，pH 7.2。发酵培养基(g/L)：麦芽糖50，葡萄糖30，谷氨酸3，磷酸氢二钾1，氯化铁0.5，黄豆饼粉10，碳酸钙2.5，pH 7.2。游动放线菌具体培养方法均参照文献[20]。

1.2 钓取调控蛋白

1.2.1 游动放线菌总蛋白提取:

收集50mL发酵后的游动放线菌菌丝体，6500 r/min离心10 min后以10 mL buffer A (300 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)重悬，清洗2次，再以50 mL binding buffer (10%甘油，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)重悬后，使用超声破碎仪进行破碎，超声一个工作周期总时长5 min，超声3 s，暂停5 s，功率为40%，共重复3个工作周期。超声破碎结束后在4 ℃、12000 r/min离心25 min，取上清，重复离心1次，使用3 kDa超滤管超滤，得到浓缩的游动放线菌总蛋白。

1.2.2 DNA亲和层析:

通过PCR扩增得到生物素标记的DNA探针，将100 μL亲和层析所用填料(GE公司的Streptavidin-agarose)离心弃去上清，用100 μL binding buffer重悬后与10 μg左右DNA探针混合均匀，离心弃去上清，加入1 mL binding buffer重悬后离心除去未与填料结合的DNA。将结合有探针的填料与150 mg左右的总蛋白均匀混合，同时加入250 μg左右鱼精DNA以减少非特异性蛋白的结合。将整个体系放置于4 ℃冰浴环境，旋转混匀1 h。离心，弃去上清，将沉淀重悬在1 mL binding buffer中，离心并去上清，重复1−2次。将结合有蛋白的DNA探针沉淀用100 μL的elution buffer (10% V/V甘油，20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，1 mol/L EDTA，pH 6.8)重悬，离心，上清液即为与DNA探针相结合的蛋白。蛋白质谱检测由上海厚基生物科技有限公司完成，采用Label-free定量蛋白质组学分析技术，通过LC-MS/ MS技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析。

1.3 突变株构建

1.3.1 基因敲除:

以ACPL_1889基因(本实验调控蛋白基因序列均可在NCBI数据库中获得，GenBank：CP003170.1)敲除菌株的构建为例。以游动放线菌SE50/110基因组DNA为模板，利用ACPL_1889-LF/R和ACPL_1889-RF/R两对引物，分别扩增出带有酶切位点的上游和下游同源臂。将测序正确的片段经酶切后连接至游离型载体pLQ752中，获得同源重组质粒pLQ1461。将重组质粒转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，采用菌丝体接合转移的方式^[20]将质粒导入游动放线菌QQ-2中，于SFM培养基30 ℃培养5−7 d后，挑出接合子扩大培养，经转接2轮无抗性SM培养基松弛培养和双交换筛选，获得基因缺失突变候选株。提取基因组DNA，以ACPL_1889-YZ-F/R为引物进行PCR验证，得到突变株WXM-12。

1.3.2 基因强化表达:

以ACPL_1889基因强化表达菌株的构建为例。以pDR4-K*质粒DNA为模板，利用引物kasOp*-F/R，通过PCR扩增得到126 bp的kasOp*启动子片段。以游动放线菌SE50/110基因组DNA为模板，利用引物ACPL_1889GB-F/R，通过PCR扩增得到228 bp的ACPL_1889基因片段。以获得的kasOp*启动子片段和ACPL_1889基因片段为模板，利用引物kasOp*-F/ACPL_1889GB-R，通过重叠PCR扩增得到354 bp的kasOp*-ACPL_1889基因片段。将测序正确的基因片段经酶切后连接至载体pSET152中，得到整合型质粒pLQ1450。将质粒转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，采用菌丝体接合转移的方式^[20]将质粒导入QQ-2中。于SFM培养基30 ℃培养5−7 d后，挑出接合子扩大培养，经过抗性验证及提取基因组DNA和PCR验证后，得到基因强化表达突变株WXM-01。

1.4 突变株发酵

将菌液涂布至STY平板30 ℃培养2−3 d后，将菌体接种至SM培养基，30 ℃、220 r/min培养30−36 h，转接4 mL至40 mL种子培养基中，30 ℃、220 r/min培养30−36 h，然后转接7.5 mL种子液至42.5 mL发酵培养基中，根据实验需求于30 ℃、220 r/min培养2−4 d.

1.5 RT-qPCR分析阿卡波糖生物合成基因的转录水平

收取1 mL发酵48 h的菌体，离心弃去上清加入1 mL带有玻璃珠的Redzol溶液，在细胞破碎仪中破碎细胞。加入300 μL酚-氯仿，混合均匀于4 ℃、12000 r/min离心10 min，吸取上清，重复此步骤3–4直到蛋白几乎除净。加入200 μL无水乙醇，充分混匀后加入离心柱中，于4 ℃、12000 r/min离心2 min，弃去收集管内液体，向离心柱中心加入50 μL DEPC处理过的水，静置片刻后于4 ℃、12000 r/min离心2 min，获得总mRNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板、编码RNA聚合酶Sigma因子的hrdB基因(GenBank No. AEV82165.1)作为内参进行RT-qPCR，使用SYBR Green为信号检测染料，具体计算分析方法参照文献[24]。

1.6 体外蛋白表达及纯化

1.6.1 体外蛋白菌株的构建:

以ACPL_1889蛋白表达菌株的构建为例。以游动放线菌SE50/110基因组DNA为模板，利用引物ACPL_1889-EX-F/R，通过PCR扩增得到228 bp带有EcoR I/Hind Ⅲ的ACPL_1889基因片段。将测序正确的基因片段经酶切后连接至载体pET30a中，得到蛋白表达质粒pLQ1466。将蛋白表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得蛋白表达菌株。

1.6.2 蛋白表达与纯化:

将构建好的蛋白表达菌株在含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中于37 ℃、220 r/min条件过夜培养，然后按2%的转接量转接至1 L含50 mg/L卡那霉素的LB培养基继续培养至OD₆₀₀达到0.6−0.8时，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，在16 ℃条件下继续诱导培养18−20 h。然后离心收集菌体，用buffer A重悬菌体。利用超声破碎仪进行破碎，离心收集上清，经镍柱亲和层析后，以20 mL浓度为50 mmol/L的咪唑洗去杂蛋白，再以10 mL浓度为250 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白。经Millipore超滤管脱盐浓缩后，保存于10%甘油中。

1.7 凝胶阻滞实验

以游动放线菌SE50/110基因组DNA为模板，利用FAM荧光标记的引物P_W-FAM-F/P_W-R，通过PCR扩增得到100 ng荧光标记的DNA探针。将获取的目的蛋白依次稀释到不同浓度(0−4000 nmol)，配制EMSA反应体系，同时以1 μg非标记探针作为特异性竞争对照、1 μg poly(dI: dC)作为非特异性竞争对照，25 ℃反应30 min。在4 ℃、100 V下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳60 min，在多功能激光扫描仪中观察结合情况。

1.8 阿卡波糖产量分析

取1 mL发酵液离心，收集上清，用ddH₂O将上清稀释5倍后加入等体积氯仿，离心除去蛋白质杂质。取上清，经滤膜过滤，利用HPLC进行含量检测。使用Agilent phenomenex NH₂柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为65%乙腈-35%磷酸盐(0.6 g/L KH₂PO₄，0.704 g/L Na₂HPO₄·12H₂O，100 mL乙腈)，检测波长为210 nm。

2 结果和分析 2.1 钓取阿卡波糖生物合成基因簇的转录调控蛋白

在SE50/110中，负责阿卡波糖生物合成的基因成簇分布，组成acb基因簇。其中P_WV、P_AB两个双向启动子控制了阿卡波糖生物合成基因的转录，P_AB控制acbA与acbB的转录，P_WV控制acbVUSRPIJKMLNOC及转运基因acbWXY的转录。但是在acb基因簇中未发现调控基因的存在，因此我们推测acb基因簇的转录很可能受到基因组中其他位置的调控因子的调控。基于上述假设，本研究利用P_WV、P_AB两个双向启动子区域的DNA作为探针(图 5-A)，以亲和层析的方式钓取与启动子特异结合的蛋白，并结合蛋白组质谱分析，从中筛选出可能的转录调控因子。亲和层析后将洗脱液经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，初步判断是否存在蛋白及洗脱特异性。

将洗脱2次与3次的蛋白洗脱液分别进行蛋白组质谱检测，质谱鉴定结果显示，与P_AB结合的蛋白共有228个，与P_WV结合的蛋白共有220个。通过与KEGG数据库进行比对分析，在P_AB结合蛋白中有23个、在P_WV结合蛋白中有16个被注释为转录调控相关的蛋白；被直接注释为调控因子的蛋白共有14个，其中ACPL_566、ACPL_1896、ACPL_6780、ACPL_3083只与P_AB启动子区域结合，ACPL_151只与P_WV启动子区域结合，ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104、ACPL_3989、ACPL_5445、ACPL_7617、ACPL_8270与P_AB、P_WV两个启动子区域均结合，最终确定这9个蛋白(表 2)的编码基因为候选基因，进行后续的体内、体外功能验证。

2.2 候选基因体内功能分析

2.2.1 候选基因强化表达菌株构建及产量分析:

将ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104、ACPL_7617、ACPL_8270、ACPL_5445、ACPL_3989经PCR扩增后，引入强启动子kasOp*并克隆至载体pSET152中获得整合型质粒pLQ1450 (图 2-A)、pLQ1451、pLQ1452、pLQ1453、pLQ1454、pLQ1457、pLQ1458、pLQ1459、pLQ1460，采用菌丝体接合转移的方式将质粒导入游动放线菌QQ-2中，分别获得基因强化表达突变株WXM-01 (图 2-B)、WXM-02、WXM-03、WXM-04、WXM-05、WXM-08、WXM-09、WXM-10、WXM-11。将质粒整合菌株与突变株进行发酵，利用HPLC检测发酵液中阿卡波糖产量。结果显示(图 2-C)，强化表达ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104，突变株的产量比整合有载体pSET152的对照菌株分别提高了25%、26%、18%、22%、15%；强化表达ACPL_5445、ACPL_7617、ACPL_3989、ACPL_8270，突变株的产量比对照菌株分别降低了12%、23%、39%、9%。

2.2.2 候选基因敲除菌株构建及产量分析:

通过PCR扩增，分别获得ACPL_5445、ACPL_3989、ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8270、ACPL_8104、ACPL_7617的左右同源臂，酶切连接至pLQ752中构建同源重组质粒pLQ1455、pLQ1456、pLQ1461、pLQ1462、pLQ1463、pLQ1464、pLQ1465、pLQ1466、pLQ1467。采用菌丝体接合转移的方式将质粒导入游动放线菌QQ-2中，获得基因缺失突变株WXM-06、WXM-02、WXM-12、WXM-13、WXM-14、WXM-15、WXM-16。未能获得ACPL_8270、ACPL_8104这2个基因的敲除突变菌株，推测它们可能为必需基因。将出发菌株与突变株进行发酵，利用HPLC检测发酵液中阿卡波糖含量。结果显示(图 3-C)，相较于出发菌株，ACPL_5445和ACPL_3989突变株的产量分别提高了13%、8%，ACPL_1889突变株的产量降低了22%，ACPL_7617、ACPL_7303、ACPL_4236、ACPL_6479突变株的产量无明显变化。

2.2.3 阿卡波糖生物合成基因转录水平分析:

基因强化表达和敲除突变株产量结果显示，ACPL_1889可能是正调控因子，ACPL_5445和ACPL_3989可能是负调控因子，因此，利用qPCR分析这3个基因的突变株中阿卡波糖生物合成基因acbW、acbV、acbA和acbB的转录水平。收集发酵第2天的菌体进行RNA提取和qPCR分析。结果显示(图 4)，与对照菌株相比，强化表达ACPL_3989使acbW、acbV、acbB的表达水平分别下调约4倍、2倍和5倍，敲除ACPL_3989使acbW和acbA的表达水平分别提高了约90倍和40倍；强化表达ACPL_1889使acbW、acbV、acbA的表达水平均提高了约2倍、acbB的表达水平提高了约6倍，敲除ACPL_1889使acbW、acbA、acbB的表达水平下调约2倍，acbV表达水平下调约9倍；强化表达ACPL_5445后acbW、acbV、acbA、acbB表达水平变化不大，而敲除ACPL_5445使acbW、acbV、、acbA、acbB的表达水平分别提高了约3倍、2倍、5.6倍和4.7倍。这些结果进一步表明，ACPL_1889对阿卡波糖的生物合成起到正调控作用，ACPL_5445和ACPL_3989对阿卡波糖的生物合成起到负调控作用。

2.3 候选调控蛋白的体外功能分析

为实现候选调控蛋白的异源表达，首先利用pET30a载体构建ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104、ACPL_5445、ACPL_3989、ACPL_7617、ACPL_8270的表达质粒pLQ1468、pLQ1469、pLQ1470、pLQ1471、pLQ1472、pLQ1473、pLQ1474、pLQ1475、pLQ1476。将这些质粒导入BL21(DE3)，经诱导表达和镍柱纯化得到可溶性蛋白。

按照1.6的实验方法，分别以FAM荧光标记的P_WV和P_AB中4个启动子区域DNA P_W、P_V、P_A、P_B (图 5-A)为探针，利用凝胶阻滞实验(EMSA)检测候选蛋白与启动子区域的结合特异性，以10倍浓度非标记启动子探针作为特异性竞争对照、poly (dI: dC)作为非特异性竞争对照。结果显示，ACPL_1889蛋白与P_AB和P_WV两个启动子DNA均能结合，发生迁移阻滞，随着蛋白浓度的增加阻滞越明显，加入特异性竞争性探针的阻滞明显减弱，加入非特异性竞争性探针的阻滞也有不同程度的减弱，说明ACPL_1889能特异性地结合P_AB和P_WV两个启动子DNA，但结合能力不强；ACPL_3989蛋白能与P_AB启动子DNA结合，发生迁移阻滞，随着蛋白浓度的增加阻滞越强，加入特异性竞争性探针的阻滞消失，加入非特异性竞争性探针的阻滞无明显变化，说明ACPL_3989蛋白与P_AB启动子DNA有特异性结合。

2.4 组合突变提高阿卡波糖产量

候选调控蛋白的体内验证结果显示，强化表达ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104或者敲除基因ACPL_5445、ACPL_3989，突变株的产量提高了8%−26%。因此，为获取更高产的阿卡波糖突变株，首先将ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104这5个基因在pLQ752中串联，构建重组质粒PLQ1477 (图 6-A)。采用菌丝体接合转移的方式将质粒导入游动放线菌QQ-2中，获得突变株WXM-17。经HPLC检测，阿卡波糖产量相较于整合空载质粒的QQ-2提高了27%。在此基础上进一步敲除ACPL_5445、ACPL_3989，获得突变株WXM-18，其阿卡波糖产量相较于整合空载质粒的QQ-2提高了32% (图 6-B)。

3 讨论

随着acb基因簇中各基因功能的解析，为阿卡波糖高产菌株的工程改造提供了基础与目标。然而，迄今为止，涉及阿卡波糖生物合成基因的转录调控因子的研究仍旧很少。虽然有研究发现在SE50/110中，蛋白AcrC能与acb基因簇中acbD和acbE之间的区域相结合，对acbD和acbE的转录有抑制作用，从而对阿卡波糖的早期合成有一定的调控作用，但acbD和acbE并不是阿卡波糖生物合成的关键基因，对阿卡波糖产量并未产生明显影响^[25]。因此，本研究以acb基因簇中2个双向启动子区域P_WV和P_AB为探针，通过DNA亲和层析结合蛋白组质谱分析，挖掘基因簇外转录调控因子，并结合体内体外实验，以验证其对阿卡波糖生物合成的调控作用。

DNA亲和层析技术目前已在放线菌中被有效应用。曲爽等在吸水链霉井冈变种5008 (S. hygroscopicus var. jinggangensis 5008)中以启动子valK-valA-int为探针，钓取到全局性调控因子GlnR^[14]。Ajith等也利用DNA亲和层析在S. peucetius 29050中寻找到一种具有二氢脂酰胺脱

氢酶(DLDH)活性的序列特异性DNA结合蛋白，该蛋白可能参与了柔红霉素生物合成的调控^[26]。本实验中，通过DNA亲和层析和蛋白质组质谱分析，成功钓取到9个与阿卡波糖生物合成簇的2个双向启动子区域P_WV、P_AB均结合的调控因子ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104、ACPL_8270、ACPL_5445、ACPL_3989、ACPL_7617。

随后，在体内验证中，通过引入强启动子kasOp*和同源重组的方式分别构建基因强化表达和敲除突变株，对于ACPL_8270和ACPL_8104这2个基因，我们未能成功在QQ-2中敲除。近一步分析发现ACPL_8270与ACPL_8104这2个基因在基因组中的位置距离复制起点较近，且通过NCBI数据库比对发现，ACPL_8104同源调控因子Crp在S. coelicolor中缺失，会导致菌体形态学发育缺陷，还会导致次级代谢物生物合成的改变^[27]。ACPL_8270属于GntR家族调控因子，这类调控因子在放线菌的初级和次级代谢中都发挥重要作用，有研究发现在S. coelicolor M145中缺失GntR家族调控因子dasR基因，突变株无法正常产生气生菌丝和孢子^[28]。因此，我们判断ACPL_8270与ACPL_8104可能为游动放线菌SE50/110基因组中的必需基因。

综合体内体外实验验证，我们推断ACPL_1889可能为阿卡波糖生物合成正调控因子，ACPL_3989和ACPL_5445可能为2个负调控因子。目前，对于ACPL_1889蛋白家族及其同源蛋白的有关报道非常少。在本实验中，ACPL_1889能与acb基因簇中2个双向启动子P_WV和P_AB均结合，并对阿卡波糖生物合成基因转录及阿卡波糖产量具有一定的促进，强化表达基因ACPL_1889，阿卡波糖生物合成相关基因acbW、acbV、acbA、acbB的表达水平均提高，阿卡波糖产量提升25%，敲除该基因后，阿卡波糖的产量下降了22%，表现出正调控作用，其结构和作用机制有待进一步探究。ACPL_3989是HTH型调控因子MalT，其属于LuxR家族调控因子，不同的LuxR家族蛋白表现出复杂的调控机制，大部分为正调控因子，少部分具有负调控作用。在S. hygrospinosus var. beijingensis中，AniF能激活aniR-G基因的转录并参与茴香霉素生物合成^[29]。本实验中，蛋白ACPL_3989能与启动子P_AB区域结合并调控阿卡波糖生物合成基因的转录，强化表达基因ACPL_3989，阿卡波糖产量降低39%，敲除该基因后，阿卡波糖产量提高8%，表明其起到负调控作用。ACPL_5445属HTH型抑制因子PurR，PurR调控因子主要负责调控嘌呤生物合成操纵子基因purCSQLF和purDEK以及核苷ABC转运蛋白基因的转录^[30−31]。本实验中，ACPL_5445虽未直接与阿卡波糖生物合成基因簇启动子区域结合，但强化表达基因ACPL_5445，阿卡波糖产量降低12%，敲除该基因后，阿卡波糖生物合成基因转录水平有所提高，阿卡波糖产量提高13%，表明其可能通过间接作用而发挥抑制功能。

本研究采用自下而上的研究方法，以acb基因簇的2个双向启动子为探针，利用DNA亲和层析技术钓取到与启动子区域结合的调控蛋白，并结合体内体外验证实验，寻找到阿卡波糖生物合成的调控因子，不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础，而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量。