微生物学报  2021, Vol. 61 Issue (11): 3594-3606   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210083.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210083
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
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文章信息

李碗芯, 赵怡扬, 林玲, 林向民. 2021
Wanxin Li, Yiyang Zhao, Ling Lin, Xiangmin Lin. 2021
嗜水气单胞菌中转录因子AHA_1581对细菌生理功能调控机制的研究
Study on the transcription factor AHA_1581 in Aeromonas hydrophila on the regulation mechanism of bacterial physiological functions
微生物学报, 61(11): 3594-3606
Acta Microbiologica Sinica, 61(11): 3594-3606

文章历史

收稿日期:2021-02-04
修回日期:2021-04-25
网络出版日期:2021-08-19
嗜水气单胞菌中转录因子AHA_1581对细菌生理功能调控机制的研究
李碗芯1,2,3 , 赵怡扬1,2 , 林玲1,2 , 林向民1,2,3     
1. 福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002;
2. 福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室, 福建 福州 350002;
3. 福建农林大学福建省海洋生物技术重点实验室, 福建 福州 350002
摘要[目的] LuxR家族转录因子能够抑制或刺激不同功能类型基因的表达,来维持细胞功能的稳定性。嗜水气单胞菌是水产养殖中重要的致病菌之一,目前对该菌中的LuxR家族转录因子功能的研究还较少。[方法] 本研究利用含有sacB标记的自杀载体pRE112和同源重组技术敲除LuxR家族转录因子AHA_1581基因。[结果] 生理表型测定结果发现,ΔAHA_1581的运动与胞外蛋白的酶活增强、生物被膜形成能力降低,且耐受低温、卡那霉素、庆大霉素胁迫,但是对K2Cr2O7更加敏感。进一步对野生型AhΔAHA_1581的定量蛋白质组学分析,共鉴定到2654个蛋白,其中59个蛋白下调表达,142个蛋白上调表达。生物信息学分析表明AHA_1581参与调控双组分调节系统、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA循环等细菌重要生理过程,以及细菌耐药基因和毒力因子的差异表达。[结论] 了解AHA_1581基因在调控细菌毒力以及生物过程中所起的重要作用,对预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的发生和传播可能具有重要的科学意义。
关键词嗜水气单胞菌    LuxR家族转录因子    AHA_1581    定量蛋白质组学    生理功能    
Study on the transcription factor AHA_1581 in Aeromonas hydrophila on the regulation mechanism of bacterial physiological functions
Wanxin Li1,2,3 , Yiyang Zhao1,2 , Ling Lin1,2 , Xiangmin Lin1,2,3     
1. School of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;
2. Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;
3. Fujian Key Laboratory of Marine Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China
Abstract: [Objective] To study the role of LuxR family transcription factors in Aeromonas hydrophila. [Methods] In this study, we have knocked out the AHA_1581 gene by homologous recombination technology to understand their role in virulence and drug resistance. [Results] The deletion of AHA_1581 gene not only enhanced the extracellular protease enzyme activity, the tolerance of A. hydrophila to survive under low temperature, different antibiotic stress, but also reduced the biofilm formation capability. Further the quantitative proteomic and bioinformatics analysis showed that the deletion of AHA_1581 gene 59 proteins were down-regulated and 142 proteins were up-regulated, which affected several important biological processes and virulence pathways in A. hydrophila. [Conclusion] Overall, the outcome of this study on the role of transcription factor AHA_1581 in the biological processes and virulence of A. hydrophila may pay the way for controlling their infections.
Keywords: Aeromonas hydrophila    LuxR family transcription factor    AHA_1581    quantitative proteomics    physiological function    

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)广泛分布于淡水环境中,是水产养殖动物中的重要病原菌之一,水产动物尤其是经济鱼类感染该菌容易出现皮肤溃疡和急性出血性败血症等进而造成鱼类死亡,给全球水产养殖业造成严重的经济损失[1-2]。此外,嗜水气单胞菌亦可感染人类并引起各种疾病,例如急性胃肠炎、腹泻等,对人类健康造成严重后果[3-4]。当前,嗜水气单胞菌表现出很强的耐药性,出现耐药谱广、耐药率高的特点,导致抗生素防控该菌的方法逐渐失效[5-6]。因此,寻求有效的预防和控制该菌的靶点至关重要。

AHA_1581编码的蛋白由212个氨基酸组成,其C端存在类似LuxR家族蛋白的DNA结合域,被注释为LuxR家族转录调节因子。LuxR家族转录因子广泛存在于细菌中,是多功能转录因子,能够抑制或者刺激不同类型基因的表达,从而维持细胞功能的稳定性[7-8]

1983年,Engebrecht首次描述了LuxR家族蛋白与群体感应(quorum sensing,QS)相关,此后其在QS中的重要作用备受关注,其还参与生物发光、细菌毒力因子产生、生物被膜形成、运动能力等重要生理过程[9-11],对于细菌的生存和繁殖至关重要。之前有研究通过RNA干扰技术研究嗜水气单胞菌B11中的6个LuxR家族蛋白,发现它们在细菌耐药、生长、生物被膜形成、运动、胞外蛋白酶活中发挥重要作用[12],但是关于LuxR家族基因AHA_1581的功能还没有相关的研究。因此,本研究通过自杀载体pRE112和同源重组技术在嗜水气单胞菌中成功敲除LuxR家族转录因子AHA_1581,并研究其在嗜水气单胞菌中的生理功能;进一步通过定量蛋白质组学技术分析转录因子AHA_1581参与调控的代谢通路。研究结果将有助于对LuxR家族转录因子AHA_1581更加全面的理解,并为防控嗜水气单胞菌提供一个有效靶点,从而达到预防和控制该菌引起的细菌疾病。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和培养条件:

嗜水气单胞菌ATCC 7966 (Ah),最适培养温度为30 ℃;自杀载体pRE112,大肠杆菌MC061(pir)和S17-1(pir)最适培养温度均为37 ℃,以上菌株和质粒均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和配方:

细菌基因组提取试剂盒、DNA marker、蛋白酶抑制剂、Sac Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶购自宝生物(TaKaRa)工程有限公司;质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美基生物;DNA聚合酶和核酸染料购自上海翊圣生物技术有限公司;多片段无缝连接试剂盒购自南京诺唯赞生物技术有限公司;蛋白Marker购自Thermo Fisher Scientific公司(Rochester,USA);PVDF膜购自Millpore公司(Bedford,USA);半干转转膜缓冲液、滤纸和ECL显色液购自BIO-RAD公司(Hercules,USA);胰蛋白酶购自Promega公司(Madison,USA);蛋白A0KIL6、A0KK68和P55870一抗为本实验室自己免疫小鼠制备的多克隆抗体,山羊抗小鼠二抗购自康为世纪;尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)购自Sigma (St. Louis,MO)等。

LB培养基含5 g/L酵母粉,10 g/L胰蛋白胨,10 g/L NaCl (M/V),调pH约等于7.2;固体LB平板含1.5%的琼脂粉;蔗糖平板为含20%的蔗糖的固体LB平板;检测胞外蛋白酶活性平板含1%的脱脂牛奶。配制氨苄青霉素(Amp) 100 mg/mL、氯霉素(Cm) 30 mg/mL、卡那霉素(Kan) 10 mg/mL、庆大霉素(Gen) 10 mg/mL、重铬酸钾溶液(K2Cr2O7),以上试剂在超净工作台里经0.22 μm滤膜过滤除菌后–20 ℃保存备用。蛋白裂解液含6 mol/L尿素和2 mol/L硫脲溶解于0.1 mol/L的Tris-HCl (pH 7.6)溶液,并加入蛋白酶抑制剂。以上试剂和质谱分析相关试剂均为分析纯,其他试剂为化学纯。

1.2 ΔAHA_1581敲除菌株的构建

AHA_1581基因的敲除方法参照本课题之前的研究[13]。首先,在NCBI上找到Aeromonas hydrophila ATCC 7966的全基因组序列并导入Snapgene软件。从Ah基因组中找到AHA_1581基因的上下游片段约500 bp左右,利用CE Design V1.03软件设计缺失引物,引物送福州尚亚生物技术有限公司合成,引物见表 1。其次,提取Ah的总DNA作为模板,利用引物P1P2和P3P4扩增出AHA_1581基因的上下游片段并回收目的片段,用多片段无缝连接试剂盒把P1P2和P3P4片段连接到经过Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后的自杀载体pRE112质粒上,构建重组质粒pRE-1581,转化到MC1061(pir) (图 1-A)。挑取CmR单克隆进行PCR验证(引物P1P4)并送铂尚生物技术有限公司测序。验证序列正确后,提取质粒再次转化到S17-1(pir)中,同样挑取CmR单克隆进行PCR验证(引物P1P4)以及送测序。测序正确的S17-1(pir)-pRE-1581与野生型Ah按照1︰4的体积比混合进行接合实验,把重组质粒pRE-1581转入野生型Ah中进行同源重组,通过Amp (100 μg/mL)和Cm (30 μg/mL)双抗平板筛选出AmpRCmR菌株进行PCR验证(引物P1P4)以及送测序,测序正确的菌株在含20%的蔗糖平板上连续筛选出CmSSacBR表型菌株(图 1-B),利用引物P7P8和P5P6进行验证,条带大小符合并送测序结果正确的即为成功敲除菌株ΔAHA_1581

表 1. AHA_1581基因缺失引物 Table 1. AHA_1581 gene knockout primers
Primer name Primer sequence (5′→3′) Application
P1 cgatcccaagcttcttctagaGGGATACGGTCAAAGCCGA Amplify the upstream homology arm fragment of AHA_1581
P2 cgatcccaagcttcttctagaGGGATACGGTCAAAGCCGA
P3 agcctaacaagagatgcctgCGCCCTCCCATCCAGCAA Amplify the downstream homology arm fragment of AHA_1581
P4 catgaattcccgggagagctcATACTTCCCGCAGTCGGGTC
P5 atatcggatccATGGACGAGATGAAATATAGTGTTCTG AHA_1581 verification primer
P6 gccgcaagcttTTAGTTGCGCTGCTCCAGGT
P7 ggatcttccagagatGCTGCACGACTCGCTGGC AHA_1581 verification primer on the outer side of the homology arm
P8 ctgccgttcgacgatCGGGCCGCTTCGCTATTT

图 1 AHA_1581基因缺失菌株构建示意图 Figure 1 The construction of AHA_1581 gene mutant strain. A: construction of recombinant plasmid; B: the diagram of homologous recombination.

1.3 ΔAHA_1581生理表型的测定

1.3.1 运动能力检测:

本研究利用泳动和集群运动来观察细菌的运动能力[14]。配制0.3% (泳动)和0.6% (集群运动)的半固体LB平板;将AhΔAHA_1581菌株的单克隆点在平板上,30 ℃培养,泳动结果于培养4–5 h内观察,集群运动培养12–14 h后观察。

1.3.2 生物被膜的测定:

生物被膜的测定参考王贵宾等的方法利用96孔板微量板法和结晶紫染色法[15]。细菌培养至OD600≈1.0时,按照5%转接到96孔微孔板中,30 ℃静置培养24 h后,弃去菌液,利用0.1%的结晶紫染色后,用95%的乙醇溶液洗脱样品,利用SpectraMax® i3酶标仪检测波长595 nm下的吸光值,每个样品做8个复孔、3次生物学重复,最后利用GrapPad Prism 8软件生成图形,T检验做显著性分析。

1.3.3 胞外蛋白酶活性检测:

利用酪蛋白酶水解法检测细菌胞外蛋白酶活性。配制含1%脱脂牛奶的固体平板,凝固后在板上打6个2 mm的小孔,在每个小孔中加入5 μL过夜培养的菌液,晾干倒置于30 ℃培养14–16 h后,测量酶解圈的大小,进行3次生物学重复。最后也利用GrapPad Prism 8软件生成图形,T检验做显著性分析。

1.4 ΔAHA_1581耐受性的检测

本研究利用稀释点板检测细菌的耐受性。过夜培养的AhΔAHA_1581菌液按照1%转接到新鲜的LB培养基中,并加入终浓度为25 μg/mL的Kan、5 μg/mL的Gen以及2 mmol/L的K2Cr2O7,置于30 ℃、200 r/min摇床培养1 h后,10倍梯度稀释样品,然后各取2 μL的样品点在空白的LB平板上,晾干后,倒置于30 ℃培养箱中培养14–16 h后,观察实验结果,并拍照保存。低温胁迫为未处理样品梯度稀释点板后置于4 ℃冰箱培养3 d后观察实验结果。

1.5 AhΔAHA_1581全蛋白的质谱鉴定

AhΔAHA_1581过夜培养16 h后的菌液按照1%转接到30 mL新鲜的LB培养基中,30 ℃、200 r/min培养至OD600≈1.0时,4 ℃、8000×g离心10 min,收集菌体,用预冷的PBS清洗2次。样品中加入1 mL的蛋白裂解液后,进行超声破碎15 min (功率为30%,工作6 s,暂停9 s)直至样品澄清。4 ℃、12000×g离心30 min,取上清到新的EP管中即为提取的细菌可溶性全蛋白。利用Bradford法进行蛋白浓度的检测。取50 μg的蛋白样品利用FASP (filter-aided sample preparation)法进行蛋白的酶解,加入50 mmol/L的DTT,56 ℃水浴处理40 min和50 mmol/L的IAA避光处理30 min后,加入胰蛋白酶37 ℃酶解过夜,获得多肽样品,并利用C18除盐小柱对样品除盐后,用于质谱鉴定。

质谱鉴定方法参照王贵宾等的方法进行细微的修改[15]。首先,通过数据依赖性采集模式(data-dependent acquisition,DDA)进行分析。除盐后的样品用A液(含0.1% FA和2% CAN,pH=10)溶解,在EASY-nano-LC色谱系统上上样,随后以600 nL/min的流速在分析柱上进行分离。色谱分离梯度为:0–77 min,B液(含0.1% FA的乙腈)从6%到20%线性上升;77–109 min,B液从20%到32%线性上升,然后在1 min内上升至90%并维持到120 min。质谱数据的采集使用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪(Thermo Scientific)。具体参数设置如下:离子源喷雾电压为2.0 kV、循环时间为3 s、一级扫描范围为300–1400 m/z、分辨率为120 K、AGC target为5e5、Maximum IT为50 ms。二级使用DIA (data independent acquisition)扫描模式,离子源喷雾电压为2.1 kV、累计时间为0.05 s、扫描范围为100–1500 m/z、一个MS1图谱最多与45个最强母离子进行串联扫描,碰撞能量选择“rolling collision energy”。

1.6 质谱数据分析

首先,质谱采集到的DDA原始数据导入到Spectronout Pulsar X (Biognosys,Schlieren,Switzerland)建立DDA谱图库,默认最优参数“BGS factory setting”进行建库。然后将DIA原始数据导入到Spectronout Pulsar X进行蛋白质定性定量分析。建库参数包括:Peptides FDR (最大错误发生率)、PSMs FDR和Proteins FDR均设置为1%,至多选择最优6个子离子生成库谱图。定量参数:iTR标曲采用非线性拟合;蛋白鉴定使用Precursor qvalue cutoff≤0.01,Protein qvalue cutoff≤0.01,P值校正用Kernel Density Estimator;蛋白定量使用的是离子峰面积,至少选择3个子离子的平均强度定量。

1.7 生物信息学分析

首先对定性定量获得的原始数据以Ah为对照,计算ΔAHA_1581中各蛋白丰度的比值,以及进行T检验。取蛋白丰度比值差异(fold change,FC)≥2和≤0.5、P-value < 0.05的蛋白作为差异表达蛋白进行生物信息学分析。利用IBM SPSS Statistics 19软件进行样品间的相关性分析,并利用TBtool软件生成结果图形;质谱数据火山图分析利用GraphPad Prism 8.0软件;利用在线软件OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/)对差异蛋白进行GO (gene ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能分析并结合GOplot R语言包编程绘图[16]。进一步,利用综合抗生素耐药数据库(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD,https://card.mcmaster.ca/)和毒力因子数据库(Virulence Factors Database,VFDB,http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)对数据中的耐药基因和毒力因子进行筛选[17-18],进一步利用Cyctoscape 3.7.1软件生成图形。

1.8 Western blotting验证

制备AhΔAHA_1581菌株的全蛋白样品,首先蛋白样品进行SDS-PAGE分离,然后利用BIO-RAD半干转膜仪(程序:25 V,15 min)将蛋白胶里的蛋白样品转移到PVDF膜上。利用含5% (W/V)脱脂牛奶的PBST室温下封闭1 h后,加入对应的一抗(1:5000稀释)室温孵育1 h,用PBST洗膜5次,每次5 min。结束后加入二抗(1:5000稀释)室温孵育1 h后,用PBST洗膜5次,每次5 min。最后,利用BIO-RAD的化学发光成像系统(ChemiDoc MP)进行ECL显色。

2 结果和分析 2.1 ΔAHA_1581菌株的鉴定

对经过2次同源重组筛选获得的敲除菌株利用目的基因引物P5P6和同源臂外侧引物P7P8进行PCR验证,结果如图 2-A显示,与野生型相比,目的基因验证引物P5P6在ΔAHA_1581模板中639 bp的位置上没有目的条带,而同源臂外侧引物P7P8的条带大小也明显较小;进一步利用A0KIL6 (AHA_1581)蛋白的特异性抗体进行Western blotting验证,结果如图 2-B显示,在野生型菌株相对应位置有明显的目的条带,而在ΔAHA_1581中则没有。以上结果说明AHA_1581基因在嗜水气单胞菌中被成功敲除。

图 2 ΔAHA_1581菌株的验证 Figure 2 Verification of the knockout ΔAHA_1581. A: PCR validation; B: Western blotting verification. Coomassie R-350 staining of the membrane indicated equal loading of the protein samples. 1: Primer P7P8, Ah template, 1802 bp; 2: Primer P7P8, ΔAHA_1581 template, 1163 bp; 3: Primer P5P6, Ah template, 639 bp; 4: P5P6, ΔAHA_1581 template.

2.2 ΔAHA_1581生理表型结果

本研究中,测定AhΔAHA_1581的运动、生物被膜形成能力以及胞外蛋白酶活性。结果发现,在嗜水气单胞菌中敲除AHA_1581基因后,细菌的泳动圈和集群运动圈明显大于野生型(图 3-A),说明ΔAHA_1581运动能力高于野生型。利用结晶紫染色法比较AhAHA_1581突变株生物被膜形成能力,发现在Ah中缺失AHA_1581基因后,其生物被膜形成能力降低(图 3-B)。而胞外蛋白酶活性检测结果发现,缺失AHA_1581基因后,细菌的水解圈明显变大(图 3-C)。

图 3 ΔAHA_1581生理表型测定结果 Figure 3 The results of ΔAHA_1581 physiological phenotype. A: swimming and swarming activities; B: biofilm formation ability (P < 0.05); C: extracellular protease activity (P < 0.05).

2.3 ΔAHA_1581耐受性检测结果

利用点板稀释法测定ΔAHA_1581菌株的耐受性,结果如图 4显示。与Ah相比,ΔAHA_1581菌株在低温(4 ℃)、Kan和Gen胁迫下生长得更好,其耐受性更高;而对Cr6+离子的敏感性更高,生长状况明显低于野生型。

图 4 ΔAHA_1581耐受性检测结果 Figure 4 The tolerance of A. hydrophila wild-type and ΔAHA_1581 strains.

2.4 ΔAHA_1581和野生型嗜水气单胞菌定量蛋白质组学的比较分析

为了进一步研究AHA_1581基因的功能,本研究提取了AhΔAHA_1581的全蛋白样品进行定量蛋白质组学研究。样品进行3次生物学重复,利用IBM SPSS Statistics 19软件结合TBtool软件对样品间的相关性进行分析,结果显示样品的生物学重复高度相似,回归系数均大于0.9,表明本研究中的质谱定量分析结果稳定可靠(图 5-A)。本研究中,共鉴定到2654个蛋白(置信度≥95%,肽段数≥2和FDR < 1%),以蛋白丰度比值差异(FC)≥2 (上调表达)和≤0.5 (下调表达)、T检验P-value < 0.05的蛋白作为差异表达蛋白。与Ah相比,共鉴定到201个(占总蛋白7.573%)差异表达蛋白,其中59个下调表达,142个上调表达,利用火山图分布情况展示差异蛋白见图 5-B,部分差异较为明显的蛋白见表 2

图 5 嗜水气单胞菌野生型和ΔAHA_1581蛋白质组学数据分析 Figure 5 A. hydrophila wild type and ΔAHA_1581 of quantitative proteomic analysis. A: correlation analysis of protein abundance; B: the Volcano plots of the significantly differentially expressed proteins. Each dot represents a protein, purple dot represents down regulated expression, red dot represents up regulated expression.

表 2. ΔAHA_1581与野生型嗜水气单胞菌定量蛋白质组学分析部分差异表达蛋白列表 Table 2. Quantitative proteomic analysis of some differentially expressed proteins between ΔAHA_1581 and wild- type A. hydrophila
Protein Gene Protein description Log2 (Ratio) –log10 (P)
A0KI69 AHA_1431 Pts system, fructose-specific iiabc component 10.88 9.37
A0KLW8 AHA_2761 4Fe-4S binding domain protein 8.20 2.73
A0KKK3 rmf Ribosome modulation factor 8.03 5.61
A0KL26 AHA_2463 Type Ⅰ secretion target ggxgxdxxx repeat (2 copies) domain protein 7.89 3.42
A0KFX8 AHA_0621 Pyruvate formate lyase activating enzyme 5.01 4.46
A0KLP4 AHA_2687 Microbial serine proteinase 4.14 3.78
A0KIE7 AHA_1510 Uncharacterized protein 3.95 5.21
A0KQG5 arcC-2 Carbamate kinase 3.37 5.88
A0KFX7 AHA_0620 Uncharacterized protein 3.28 7.30
A0KIA0 AHA_1463 1, 3-propanediol dehydrogenase 3.27 8.14
A0KK68 AHA_2145 Long-chain fatty acid transport protein 1.04 4.08
P55870 AHA_1512 Hemolysin ahh1 1.03 3.34
A0KIM0 napD Chaperone NapD –6.64 3.47
A0KPB0 AHA_3655 Uncharacterized protein –6.88 3.03
A0KPJ7 AHA_3750 Uncharacterized protein –6.96 4.08
A0KLJ7 rnfE Ion-translocating oxidoreductasecomplex subunit E –7.07 3.85
A0KNS1 AHA_3433 Outer membrane protein –7.08 1.81
A0KI48 AHA_1410 Conserved domain protein –7.41 2.12
A0KK11 AHA_2082 Enoyl-CoA hydratase/isomerase family protein –7.46 2.84
A0KIM2 AHA_1587 MauM/NapG ferredoxin-type protein –7.84 4.67
A0KIL9 napF Ferredoxin-type protein NapF –11.62 5.05
A0KJ12 arsC-2 Arsenate reductase –13.07 5.11

2.5 Western blotting验证结果

为了验证定量蛋白质组学数据的可靠性,利用2个(P55870和A0KK68)差异蛋白特异性抗体进行Western blotting验证。结果如图 6显示,在嗜水气单胞菌中缺失AHA_1581基因后,P55870和A0KK68蛋白的表达量上调与定量蛋白质组学数据结果基本一致,表明质谱数据结果具有可靠性。

图 6 Western blotting验证定量蛋白质组学结果 Figure 6 Western blotting verification. Coomassie blue R350 membrane staining showed the amount of protein sample loaded; ratio showed the change multiple of the protein in quantitative proteomic data.

2.6 ΔAHA_1581和野生型嗜水气单胞菌定量蛋白质组学的生物信息学分析

为了研究转录因子AHA_1581对嗜水气单胞菌生理生化过程的调控作用,进一步对定量蛋白质组学数据进行GO和KEGG分析,结果如图 7显示。分子功能聚类中,结果发现转录因子AHA_1581参与调控7种分子功能,主要涉及阳离子结合(GO:0043169,cation binding)、铁硫团簇结合(GO:0051536,iron-sulfur cluster binding)、转移酶活性和转移酰基(GO:0016746,transferase activity,transferring acyl groups);而水解酶活性,作用于糖基键(GO:0016798,hydrolase activity,acting on glycosyl bonds),相关蛋白全部上调表达(图 7-A)。在KEGG代谢通路富集结果中发现,转录因子AHA_1581主要参与调控次生代谢产物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、不同环境下的微生物代谢(microbial metabolism in diverse environments)、双组分系统(two-component system)、丙酮酸代谢(pyruvate metabolism)和碳代谢(carbon metabolism)等相关通路,且各代谢通路相关蛋白大部分是上调表达的(图 7-B)。

图 7 嗜水气单胞菌野生型与ΔAHA_1581差异蛋白的生物信息学分析 Figure 7 A. hydrophila wild type and ΔAHA_1581 bioinformatics analysis of expressed differential proteins. A: Molecular function analysis of GO annotation; B: KEGG metabolic pathway analysis. The outer circle shows a scatter plot of the expression levels (log10FC) for the proteins in each GO/KEGG term. The inner ring is a bar plot where the bar height indicated the significance of the GO/KEGG term (–log10 P value) and the color indicated the Z-score.

进一步还分析了转录因子AHA_1581参与调控的耐药基因和毒力因子,结果如图 8显示。结果发现转录因子AHA_1581参与调控13个耐药基因,其中5个下调表达8个上调表达,还参与调控5个毒力因子的差异表达,其中AHA_0389pilFahh1上调表达,AHA_0523AHA_0524下调表达。但是,这些耐药基因和毒力因子在嗜水气单胞菌中的功能还不清楚,有待进一步研究验证。

图 8 转录因子AHA_1581参与调控的耐药基因和毒力因子 Figure 8 Drug resistance genes and virulence factors regulated by transcription factor AHA_1581. The red circle represents the upregulation expression, and the green circle represents the downregulation expression.

3 讨论

LuxR家族蛋白通常由250个氨基酸组成,具有2个功能域,一个用于AHL结合的N端DNA结合域和一个用于转录调控的C端DNA结合域,从而调控下游基因的表达以调节某些功能[19]。LuxR型转录因子控制革兰氏阴性细菌中基于酰基高丝氨酸内酯的群体感应(AHL-QS),其还参与协调包括编码毒力因子和抗生素的生物合成、运动和生物被膜形成等多种基因的表达[10, 20]。有研究还发现在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中突变LuxR型转录因子相关基因能够降低细菌的存活率和致病性[21]。本研究中,我们对以前从未报道过的LuxR家族转录调节因子AHA_1581的功能进行研究,成功敲除AHA_1581基因(ΔAHA_1581)后,细菌的存活率没有明显的差异,但是细菌的运动能力增强、生物被膜形成能力降低以及胞外蛋白酶活性增强,说明转录因子AHA_1581可能与细菌致病性密切相关;耐受性检测结果还发现其可能参与调控细菌的耐药性以及对低温和Cr6+的胁迫。但是,转录因子AHA_1581如何参与调控的机制还有待进一步研究。

接下来利用定量蛋白质组学技术对ΔAHA_1581蛋白表达谱进行分析,探讨转录因子AHA_1581参与调控的生物过程。通过毒力因子数据库的筛检,首先发现在ΔAHA_1581中,溶血素Ahh1蛋白上调表达,粘附因子MSHAⅣ型菌毛(AHA_0389)、Tap Ⅳ型菌毛(pilF)和Ⅰ型菌毛(AHA_0523AHA_0524)等毒力因子发生显著变化。之前的研究报道,在嗜热栖热菌HB27中,PilF是Ⅳ型菌毛生物发生必不可少的关键组分,与细菌粘附和生物被膜的形成密切相关[22],在Shewanella oneidensis菌株中Msh菌毛相关基因发生突变,可促进细菌在斑马鱼中定殖,增加细菌泳动,减少表面黏附[23]。因此,AHA_1581可能参与调控嗜水气单胞菌的致病性。进一步代谢通路富集分析发现,能量生成相关途径如丙酮酸代谢、TCA循环、淀粉和蔗糖代谢过程等发生显著变化,表明AHA_1581还参与调控胞内能量生成相关代谢途径。此外,通过综合抗生素耐药数据库的分析,发现转录因子AHA_1581参与调控13个耐药基因的差异表达,其中AHA_3076AHA_4192AHA_2550基因通过抗生素外排作用(antibiotic efflux)来调控细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。组学分析还发现,2个内膜蛋白(yebEyoaE)、3个外膜蛋白(AHA_3433ompWompA)以及4个TonB系统相关蛋白(AHA_4275AHA_3434AHA_0461AHA_0494)在敲除菌中发生显著变化。众所周知,膜蛋白通过控制小分子溶质进入细胞内部,在抗生素耐药中发挥重要作用,而先前的研究报道TonB系统参与细菌多药耐药[24-25]。本课题组前期的研究中也发现在耐土霉素的嗜水气单胞菌中TonB系统相关蛋白显著上调表达[26]。这些可能是导致ΔAHA_1581对KAN和GEN更加耐药、对高浓度的K2Cr2O7更加敏感的原因,但其调控机制还有待进一步的研究。

4 结论

本研究通过基因敲除技术,在嗜水气单胞菌中成功构建了AHA_1581菌株,并测定了其生理表型和耐受性,结果发现AHA_1581基因影响细菌运动、生物被膜、胞外蛋白酶活性、耐低温、耐KAN和GEN,以及对高浓度K2Cr2O7敏感。进一步的定量蛋白质组学分析发现,AHA_1581参与调控双组分调节系统、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA循环等细菌重要代谢过程以及细菌耐药基因和毒力因子的表达。综上所述,嗜水气单胞菌中的转录因子AHA_1581在调控细菌致病性以及生物过程中起着重要的作用,其可以作为预防和控制嗜水气单胞菌的一个有效靶点。

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