微生物学报  2021, Vol. 61 Issue (10): 3291-3304   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210035.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210035
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
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文章信息

李慧, 杨彤, 陈茜, 白鑫, 丁祥. 2021
Hui Li, Tong Yang, Xi Chen, Xin Bai, Xiang Ding. 2021
不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5在有丝分裂中的分子动力学研究
Kinetics of cell division cyclin protein Cdc5 in budding yeast during mitosis at different temperatures
微生物学报, 61(10): 3291-3304
Acta Microbiologica Sinica, 61(10): 3291-3304

文章历史

收稿日期:2021-01-16
修回日期:2021-05-09
网络出版日期:2021-06-07
不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5在有丝分裂中的分子动力学研究
李慧1 , 杨彤1 , 陈茜2 , 白鑫1 , 丁祥2     
1. 西华师范大学生命科学学院, 西南野生动植物资源保护教育部重点实验室, 四川 南充 637009;
2. 西华师范大学环境科学与工程学院, 四川 南充 637009
摘要[目的] 探究不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5蛋白在有丝分裂中的分子动力学变化。[方法] 本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为材料,采用活细胞成像的方法,探究Cdc5蛋白在不同温度下在酿酒酵母有丝分裂过程中的精细分子动力学变化; 通过测量OD595绘制生长曲线图,看其宏观的分裂情况是否与微观下Cdc5蛋白的分子动力学变化一致; 利用流式细胞术检测细胞的细胞周期变化的情况。[结果] 在胞质分裂时,Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞,并在芽颈处发生聚集。25℃条件下细胞中Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间长,37℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处聚集时间短,两者间存在显著差异; 但两个温度下,细胞中Cdc5蛋白的表达量没有显著性差异。同时,温度也会影响Cdc5蛋白在降解过程中的动力学行为,包括Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中荧光强度峰值出现的次数和时间。生长曲线结果显示,酿酒酵母单一细胞分裂周期的变化影响了其宏观的细胞生长,且酵母分裂速度越快,子细胞长宽比越小; 细胞周期结果表明,37℃下Cdc5蛋白的动力学变化与酿酒酵母细胞周期变化一致,酿酒酵母细胞周期从G0/G1期进入S期,亦加速了酿酒酵母的分裂。[结论] 本研究首次探究了不同温度下酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的精细分子动力学及对应的酵母的宏观生长情况,结果表明温度会对Cdc5蛋白的动力学产生影响,且其精细分子动力学与酿酒酵母的分裂速度成正相关,该结果为进一步研究其在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。
关键词酿酒酵母    有丝分裂    Cdc5蛋白    分子动力学    细胞周期    
Kinetics of cell division cyclin protein Cdc5 in budding yeast during mitosis at different temperatures
Hui Li1 , Tong Yang1 , Xi Chen2 , Xin Bai1 , Xiang Ding2     
1. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation, Ministry of Education, College of Life Sciences, China West Normal University, Nanchong 637009, Sichuan Province, China;
2. College of Environmental Science and Engineering, China West Normal University, Nanchong 637009, Sichuan Province, China
Abstract: [Objective] To explore the molecular dynamics changes of cell division cyclin protein Cdc5 in budding yeast during mitosis at different temperatures. [Methods] In this study, Saccharomyces cerevisiae was used as the experimental material objective to explore the molecular dynamic changes of Cdc5 protein in the mitosis process of budding yeast at different temperatures by using living cell imaging method; draw the growth curve by measuring OD595 to see whether the macro division is consistent with the micro dynamic changes of Cdc5 protein; use flow cytometry to detect the cell cycle changes. [Results] During cytokinesis, Cdc5 protein entered into daughter cells from mother cells and aggregated at bud neck. The aggregation time of Cdc5 protein at the bud neck was long at 25℃, and the aggregation time of Cdc5 protein at the bud neck was short at 37℃. There was a significant difference between them. However, there was no significant difference in the expression of Cdc5 protein between the two temperatures. At the same time, the temperature also affected the dynamics of Cdc5 protein during degradation process, including the occurence of frequency and time of the peak of fluorescence intensity of Cdc5 in mother cells and daughter cells. The growth curve results showed that the single cell division cycle of budding yeast affected its macroscopic cell growth, and the faster the division rate of budding yeast, the smaller the ratio of length to width of the daughter cell. The cell cycle results showed that the dynamic changes of Cdc5 protein at 37℃ were consistent with the cell cycle changes of budding yeast. The cell cycle results showed that the cell cycle of budding yeast changed from G0/G1 phase to S phase at 37℃, which also accelerated the division of budding yeast. [Conclusion] This study was to explore the molecular dynamics of Cdc5 protein in the mitosis of budding yeast at different temperatures and the corresponding macro growth of budding yeast for the first time. The results showed that the temperature had an effect on the dynamics of Cdc5 protein, and its molecular dynamics was positively correlated with the division speed of budding yeast, which provided a basis for further study of its function in mitosis.
Keywords: budding yeast    mitosis    cell division cycle protein 5    molecular dynamics    cell cycle    

细胞分裂是母细胞将细胞核和细胞质分裂为2个子细胞的过程,该过程在生物体的整个生命周期中至关重要,是生物体生长、发育和繁殖的基础[1]。酿酒酵母作为单细胞真核生物,具有和动植物相似的细胞结构特征且基因组小,生命周期短,繁殖快速,可以在二倍体和单倍体这两种状态间相互转换,常用作研究真核生物的模式生物。通过对酿酒酵母细胞分裂机制的研究对揭示细胞生物学和人类健康中的重要问题具有重要意义[2]。细胞的生长与分裂不仅受自身的生长与调控机制如必需基因表达调控、细胞分裂调控等的影响,而且还受外界环境如溶氧量、温度、pH值等的影响,其中温度是影响细胞中蛋白表达和功能体现的极其重要的因素之一[3]。Bembenek等以酿酒酵母为对象对有丝分裂退出途径(mitotic exit network,MEN)中的关键蛋白进行了研究,研究结果表明,在37 ℃条件下酿酒酵母BY4743菌株中细胞分裂周期蛋白14 (cell division cycle protein 14,Cdc14)在参与芽颈形成的隔蛋白(septin)处的定位被打乱,且出现芽生长和胞质分裂不完全的现象[4]。Zhang等的研究发现,参与细胞组装的6种热休克蛋白(heat shock protein),包括Hsp9、Hsp16、Hsp20、Hsp104等,只有Hsp9参与正常温度下的营养代谢,而另外5种蛋白在高温胁迫中显示不同的蛋白功能[5]。谷月等研究表明,酿酒酵母菌株FFC2146在37 ℃胁迫下细胞壁蛋白质中出现热休克蛋白Hsp70家族伴侣蛋白Ssa2使得细胞壁在高温下依然保持完整,以维持细胞正常的生长繁殖[6]。以上研究表明,不同温度下细胞中蛋白的表达和功能存在一定差异。

隔蛋白Septin是一类高度保守的鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白,在酿酒酵母分裂位点形成由Cdc3、Cdc10、Cdc11、Cdc12等蛋白构成的杆状异源寡聚复合体。这些复合体组装成细丝和其他高级结构(例如环或沙漏状结构),以执行胞质分裂、维持细胞形态等一系列重要的生理功能[7-8]。在细胞周期开始时(G1期),隔蛋白Septin通过胞吐作用募集到芽位点并形成隔蛋白Septin环。在子细胞生长过程中(S/G2期),隔蛋白Septin会形成一个由双细丝组成的沙漏结构。当细胞分裂进入后期时,隔蛋白Septin呈现出由双细丝和单细丝相互交织而成的纱布状的过渡结构。在胞质分裂时,隔蛋白Septin在芽颈处形成由双细丝和单细丝周向排列组成的双环结构[9-10]

在酿酒酵母中,cdc5编码的蛋白与哺乳动物的Polo样激酶1 (Polo-like kinase 1,Plk1)具有较高的同源性,其结构和功能与高级真核生物的Plk1高度保守[11]。Cdc5蛋白在S期的后期开始合成,其蛋白表达水平在有丝分裂后期达到顶峰,直到细胞分裂结束前降解。Cdc5蛋白在G2期及有丝分裂后期都定位于芽颈[12-14],对胞质分裂和调节膜沉积至关重要[15]。研究发现,Cdc5蛋白在有丝分裂早期聚集在细胞核中,对调节核形态与核膜扩张有着重要作用,有丝分裂后期若阻止Cdc5蛋白从细胞核中释放会导致细胞有丝分裂出现缺陷[14, 16]

虽然有关于Cdc5蛋白在芽颈处定位的相关报道,但却未见其精细的分子动力学报道,因此本研究以酿酒酵母作为模型来探讨不同温度下酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的分子动力学变化。因此,本文将为进一步研究Cdc5蛋白在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。

1 材料和方法 1.1 实验材料

本实验中所使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因型(genotype)如下:YEF2231 (WT: W303-1A: MATa ade2-1 his3-1115 leu2-3112 trp1-1 ura3-1 can1-100)、YEF9105 (WT: Cdc3- mCherry: Leu2)、YEF7869 (WT: Cdc5-GFP: His3)、YEF9087 (WT: Cdc5-GFP: His3Cdc3-mCherry: Leu2),以上菌株保存于四川省西华师范大学生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室。

1.2 主要药品及仪器

1.2.1 实验试剂:

酵母无氨基酸基础氮源(Yeast Nittogen Base w/o Amino Acids)购于Becton Dickinson公司,葡萄糖(Dextrose)购于Thermo Fisher Scientific公司,丙氨酸(Alanine)、精氨酸(Arginine)等19种氨基酸购于Thermo Fisher Scientific公司,天冬酰胺(Asparagine)购于Acros公司,肌醇(Myo-Inositol)、腺嘌呤(Adenine)、氨基苯甲酸(Amiobenzoic Acid)、尿嘧啶(Uracil)购于Sigma-Aldrich公司,琼脂(Agar)购于Thermo Fisher Scientific公司,细胞周期与凋亡试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司,高保真DNA聚合酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase)购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司,质粒DNA提取试剂盒(ZR Plasmid Miniprep-Classic Kit)购于北京天漠科技开发有限公司。

1.2.2 仪器与设备:

激光共聚焦显微镜(Leica TCS-SP8);荧光正置显微镜(Leica DMI3000B);Epoch酶标仪(美国基因有限公司);T630SC流式细胞仪(Bio-Rad);T100 PCR仪(Bio-Rad)。

1.2.3 培养基:

酵母SC液体培养基(synthetic complete medium,SC Medium,g/L):丙氨酸0.0835,精氨酸0.0835,天冬酰胺0.0835,天冬氨酸0.0835,半胱氨酸0.0835,谷氨酸0.0835,谷氨酰胺0.0835,甘氨酸0.0835,异亮氨酸0.0835,甲硫氨酸0.0835,苯丙氨酸0.0835,脯氨酸0.0835,丝氨酸0.0835,苏氨酸0.0835,酪氨酸0.0835,缬氨酸0.0835,肌醇0.0835,氨基苯甲酸0.0083,腺嘌呤0.0209,组氨酸0.0835,亮氨酸0.1671,赖氨酸0.083,色氨酸0.0835,尿嘧啶0.0418,酵母无氨基酸基础氮源6.7,SC powder 1.91,配制为900 mL溶液,121 ℃灭菌50 min,葡萄糖20 g/L,配制为100 mL溶液,121 ℃灭菌50 min,将两种溶液混合均匀后,4 ℃保存。在酵母SC液体培养基配制基础上添加琼脂20 g/L,即为酵母SC固体培养基。

1.3 酿酒酵母菌株的构建

Cdc5基因终止子前整合GFP基因。引物设计为40 bp目标基因同源片段+20 bp质粒通用片段(Cdc5-F5:GGAAGGTTTGAAGCAGAAGTCCACA ATTGTTACCGTAGATGGTGACGGTGCTGGTTTA,Cdc5-R3:GTAATTTCGTATTCGTATTTCTTTCT ACTTTAATATTGGTTCGATGAATTCGAGCTCG),PCR反应以质粒为模板,扩增GFP基因,采用同源重组法,将带有目的基因同源片段的筛选标记转入酵母中,利用His营养缺陷筛选培养基,挑出单克隆,并在荧光显微镜下镜检,分离带有荧光蛋白标记的菌株,进行纯化和甘油保存。运用整合质粒YIp128-Cdc3-mCherry (整合型,LEU2) 在其自身启动子的控制下携带一个N端带有mCherry标记的cdc3 (Cdc3蛋白为酿酒酵母周期指示蛋白),通过Bgl Ⅱ酶进行酶切,用酶切片段进行转化,与cdc3基因通过同源重组,将YEF7869转化为YEF9187,利用Leu营养缺陷筛选培养基,挑出单克隆,并在荧光显微镜下镜检,分离带有荧光蛋白标记的菌株,进行纯化和甘油保存[17]

1.4 显微镜镜检

在25 ℃及37 ℃下使用Leica TCS-SP8激光共聚焦显微镜进行活细胞成像。为了获得较高质量的图像,在进行活细胞成像时,采用的参数为:连续光学切片11个,成像间距0.5 µm,GFP/mCherry曝光时间为300-500 ms,间隔2 min,总时间90 min[18]

1.5 生长曲线的测定

将YEF9087菌体均匀涂布到SC固体培养基上,于25 ℃恒温培养箱培养48 h。刮取YEF9087菌体,接种至4 mL SC液体培养液中,置于25 ℃,120 r/min恒温摇床振荡培养24 h;测得OD595 (酶标仪)为0.5-0.8,得到种子液。取1 mL种子液接种于10 mL SC液体培养中;分别置25 ℃和37 ℃恒温摇床中培养12 h,每2 h取200 μL菌液用酶标仪检测OD595,每种培养3个重复;收集数据,并用GraphPad Prism 8作图,以培养时间为横坐标,OD595为纵坐标,绘制生长曲线。

1.6 流式细胞仪测定细胞周期

取1 mL处于对数生长期的菌液,2000 r/min离心5 min,去上清,加入1 mL 4 ℃预冷的70%乙醇后置于-20 ℃冻存过夜。将上述混合液2000 r/min离心5 min,去上清,向沉淀中加入50 mmol/L柠檬酸钠溶液1 mL,以2000 r/min离心5 min,去上清,重复洗涤1次,加入500 μL PI染料染色,37 ℃避光水浴30 min后,立即上机测定[19]

1.7 数据分析

图像处理和分析使用Fiji图像处理软件。为了定量荧光强度,在统计芽颈处Cdc5和Cdc3的荧光强度(n=12)以及母细胞和子细胞中Cdc5的荧光强度(n=12)时,使用相同的VANILE比值,以减少荧光强度的统计误差。通过对Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞直至降解的过程中,Cdc5蛋白的荧光强度进行求取平均值,得到荧光强度平均值。

所有数据均表示为x±s,并且使用SPSS软件单因素方差分析对实验组与对照组之间的显著差异进行统计学分析。*P < 0.05表示差异显著,** P < 0.01表示差异极显著。使用GraphPad Prism 8作图,柱状图单个点显示所有数据,每个柱形顶部的误差线表示该组数据的标准差。

2 结果和分析 2.1 不同温度下Cdc5的动力学变化

为了观察不同温度下酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的分子动力学变化,以Cdc3-mCherry和Cdc5-GFP作为检测信号,通过激光共聚焦扫描检测Cdc5蛋白的运动过程。结果表明,Cdc5在胞质分裂开始时由母细胞向子细胞移动,并且在芽颈处发生聚集。Cdc5蛋白定位于芽颈处,聚集处的荧光颜色呈黄色(图 1-A)(箭头指向为Cdc5蛋白的聚集)。37 ℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处也出现聚集(图 1-B)。以上结果提示,在胞质分裂期间,Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞,并在芽颈处发生聚集。该结果与Botchkarev VV Jr的研究结果相一致[14]

图 1 25 ℃ (A)与37 ℃ (B)条件下酿酒酵母细胞有丝分裂过程中Cdc5蛋白的动力学变化图示 Figure 1 The dynamic changes of Cdc5 protein and of budding yeast mother cells during mitosis at 25 ℃ (A) and 37 ℃ (B). Cdc3 acts as a clock protein.

为探究Cdc5蛋白在芽颈处的分子动力学变化,隔蛋白septin双环在胞质分裂完成时,双环将会分开形成“八”字,因此以隔蛋白Septin双环断裂为时间节点(隔蛋白Septin双环断裂前时间为“-”,隔蛋白Septin双环断裂后时间为“+”),分别统计了芽颈处Cdc5蛋白和Cdc3蛋白的荧光强度(Cdc3蛋白为酿酒酵母周期指示蛋白)(n=12)。在25 ℃条件下,-42 min时,Cdc5蛋白在芽颈处发生聚集,其荧光强度为81 a.u.,而37 ℃条件下,Cdc5蛋白则在-18 min时发生聚集,延迟了24 min,其荧光强度为53 a.u. (图 2-AB)。统计结果显示,37 ℃条件下,Cdc5蛋白的荧光强度亦较弱,但与25 ℃条件下Cdc5蛋白的荧光强度相比无显著性差异。

图 2 25 ℃ (A、C)与37 ℃ (B、D)条件下在酿酒酵母有丝分裂中处于芽颈处的Cdc5蛋白的荧光强度统计图和荧光强度百分比统计图(n=12) Figure 2 Statistical chart of fluorescence intensity and percentage of fluorescence intensity of Cdc5 protein at the bud neck of budding yeast during mitosis at 25 ℃ (A, C) and 37 ℃ (B, D). Cdc3 acts as a clock protein (n=12).

为了更加明确Cdc5蛋白在芽颈处的精细动力学变化,以隔蛋白Septin双环断裂时的荧光强度为基准,定量统计了芽颈处Cdc5蛋白和Cdc3蛋白的荧光强度百分比。结果显示,在25 ℃条件下,Cdc5蛋白在芽颈处的荧光强度出现双峰(图 2-C),提示Cdc5蛋白从母细胞通过芽颈处进入子细胞后,再次在芽颈处发生聚集。而在37 ℃条件下,Cdc5蛋白在芽颈处的荧光强度出现单峰及短暂的平台期(图 2-D),提示Cdc5蛋白从母细胞通过芽颈处进入子细胞后,亦在芽颈处发生聚集。结果表明,37 ℃条件下,酿酒酵母的分裂时间加快。在25 ℃条件下,Cdc5蛋白从-42 min时在芽颈处开始聚集且聚集时间为(13.5±4.4) min,而在37 ℃条件下,Cdc5蛋白从-18 min时开始在芽颈处聚集,但Cdc5蛋白的聚集时间极显著缩短(P < 0.01),为(3.8±1.3) min (图 3)。该结果首次展示了在酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白处于芽颈处的聚集时间及荧光强度,结果表明,25 ℃条件下细胞中Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间长,37 ℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处聚集时间短,两条件下Cdc5蛋白的聚集时间存在显著差异;但在两个温度下,细胞中Cdc5蛋白的荧光强度并没有显著性差异。该结果提示,温度会影响Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间,但不影响其表达量。

图 3 在25 ℃和37 ℃条件下在酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白处于芽颈处的聚集时间(n=12) Figure 3 The accumulation time of Cdc5 at the bud neck of budding yeast during mitosis at 25 ℃ and 37 ℃ (n=12). *: significant difference at P < 0.05; **: significant difference at P < 0.01.

为探究Cdc5蛋白在完成其使命后的降解过程中的动力学变化,以隔蛋白Septin双环断裂为时间节点(隔蛋白Septin双环断裂前时间为“-”,隔蛋白Septin双环断裂后时间为“+”),本实验分别统计了Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞的前2 min直到分裂完成过程中Cdc5蛋白的荧光强度(n=12)。结果显示,25 ℃条件下,在-40至-24 min期间,子细胞中的Cdc5蛋白荧光强度高于其在母细胞中的荧光强度,在-38 min时子细胞中Cdc5蛋白荧光强度最强,为36 AU,而母细胞中Cdc5蛋白在-40 min时荧光强度最强,为31 AU (图 4-A);而在37 ℃条件下,在-22至-14 min期间,子细胞中的Cdc5蛋白荧光强度亦高于其母细胞中的荧光强度,-18 min时子细胞中Cdc5蛋白荧光强度最强为40 AU,而母细胞中Cdc5蛋白在-22 min时荧光强度最强,为34 AU (图 4-B)。在细胞分裂结束前,两种温度下母细胞和子细胞中的Cdc5蛋白的荧光强度趋于一致并开始降解。该统计结果显示,在2个温度条件下,Cdc5蛋白进入子细胞直至降解过程中,母细胞中的Cdc5蛋白的荧光强度平均值均高于其在子细胞中的荧光强度。值得注意的是,在25 ℃条件下,Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中的荧光强度平均值分别为29 AU和26 AU,而在37 ℃条件下,其在母细胞与子细胞中的荧光强度平均值分别为27 AU和26 AU,由此可见不同温度下Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中的荧光强度平均值没有显著性差异(图 4-C,D)。

图 4 25 ℃ (A、C)与37 ℃ (B、D)条件下酿酒酵母有丝分裂中母细胞与子细胞中Cdc5蛋白的荧光强度统计图和荧光强度百分比统计图(n=12) Figure 4 Statistical chart of fluorescence intensity and percentage of fluorescence intensity of Cdc5 protein in mother cells and daughter cells of budding yeast during mitosis at 25 ℃ (A, C) and 37 ℃ (B, D) (n=12).

为了更加明确Cdc5蛋白在降解过程中的精细动力学变化,以Cdc5蛋白进入子细胞时的荧光强度为基准,定量统计了Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞的前2 min直到分裂完成过程中Cdc5蛋白的荧光强度百分比。结果显示,不同温度条件下,Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞后,均维持一段时间后才开始发生降解。25 ℃条件下,子细胞中Cdc5蛋白的荧光强度分别在-54、-46、-38 min出现峰值(图 4-C),而37 ℃条件下,子细胞中Cdc5蛋白的荧光强度分别在-22 min和-24 min出现峰值(图 4-D)。值得注意的是,在25 ℃和37 ℃条件下,母细胞中Cdc5蛋白的荧光强度分别在-42 min和-22 min出现了一个小峰。该结果首次展示了Cdc5蛋白降解过程中在母细胞与子细胞中的动力学变化。结果表明,温度会影响Cdc5蛋白在降解过程中的动力学行为,包括Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中出现的次数和时间,值得注意的是,虽然在胞质分裂过程中,不同温度下母细胞中Cdc5蛋白的荧光强度平均值均高于子细胞中Cdc5蛋白的荧光强度平均值,但温度并不影响Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中的表达量。在25 ℃条件下,Cdc5蛋白从胞质分裂开始至降解的时间为(33.5±8.0) min且酿酒酵母从胞质分裂至分裂完成的时间为(58.5±10.3) min,而37 ℃条件下,Cdc5蛋白的持续时间与酵母分裂时间都极显著(P < 0.01)缩短了,分别为(13.8±2.0) min与(24.7±2.5) min (图 5)。结果提示,升高温度会影响Cdc5蛋白在胞质分裂过程中的持续时间。

图 5 25 ℃与37 ℃条件下酿酒酵母有丝分裂过程中Cdc5蛋白从胞质分裂至降解(A)与胞质分裂至分裂完成(B)的时间(n=12) Figure 5 The time of Cdc5 protein from cytokinesis to degradation (A) and from cytokinesis to division completion (B) during mitosis of Saccharomyces cerevisiae at 25 ℃ and 37 ℃ (n=12). *: significant difference at P < 0.05; **: significant difference at P < 0.01.

2.2 不同温度对酿酒酵母形态及生长影响

为了探究酿酒酵母宏观的分裂情况与微观的Cdc5蛋白的分子动力学变化的一致性,本实验分别在25 ℃及37 ℃条件下检测了酿酒酵母的生长曲线(图 6-A)。结果表明,在25 ℃和37 ℃条件下,0-2 h酿酒酵母生长速度差别不明显;2 h后,酿酒酵母在两温度下的生长速度加快,其生长斜率分别为0.2392和0.2882;37 ℃条件下,酿酒酵母在6 h时进入平台期,其OD595为0.839,而25 ℃条件下,酿酒酵母在8 h时才进入平台期,其OD595为0.768。这一结果表明,37 ℃条件下酿酒酵母的生长速度较快。但从形态上看(图 6-B),不同温度下,处于对数生长期的酿酒酵母形态均为椭圆形和类椭圆形,这与Dominguez等的研究结果一致[20]。前面,我们统计了Cdc5蛋白从胞质分裂开始到降解的时间,结果表明,升高温度会使Cdc5蛋白从胞质分裂开始到降解的持续时间发生显著性缩短,且胞质分裂开始至分裂完成的时间也发生显著性缩短。以上结果提示,酿酒酵母单一细胞分裂周期的变化,影响了其宏观的细胞生长。

图 6 酿酒酵母在25 ℃和37 ℃条件下的生长曲线(A)及细胞形态学(B) Figure 6 Growth curve (A) and cell morphology (B) of budding yeast at 25 ℃ and 37 ℃. a1-a3: The cell morphology of budding yeast during budding, cytokinesis and division at 25 ℃; b1-b3: The cell morphology of budding yeast during budding, cytokinesis and division at 37 ℃.

为了进一步探究酿酒酵母子细胞大小变化与分裂情况的关系,通过激光共聚焦扫描,统计了胞质分裂时及分裂末期时酿酒酵母子细胞的长宽比(n=10)。结果表明(图 7),25 ℃条件下,酿酒酵母细胞开始进入胞质分裂时的子细胞的长宽比为(1.190±0.083),分裂完成时子细胞的长宽比为(1.256±0.089)。而在37 ℃条件下,酿酒酵母细胞开始进入胞质分裂时的子细胞的长宽比为(1.091±0.095),分裂完成时子细胞的长宽比为(1.144±0.069)(图 7)。和25 ℃条件相比,37 ℃条件下,进入胞质分裂时的子细胞的长宽比减小了0.099,差异具有显著性(P < 0.05),而分裂完成时子细胞的长宽比减小了0.112,差异极显著(P < 0.01)。以上结果提示,温度越高,Cdc5蛋白从胞质分裂开始到降解的持续时间发生显著性缩短,酵母分裂速度越快,子细胞长宽比越小。

图 7 25 ℃和37 ℃条件下酿酒酵母子细胞的长宽比值(n=10) Figure 7 The aspect ratio of daughter cells at 25 ℃ and 37 ℃ (n=10). A: the statistical results of aspect ratio of daughter cell when entering cytokinesis; B: measurement of daughter cells when entering cytokinesis at 25 ℃; C: measurement of daughter cells when entering cytokinesis at 37 ℃; D: the statistical results of aspect ratio of daughter cell at the end of cell division; E: measurement of daughter cells at the end of cell division at 25 ℃; F: measurement of daughter cells at the end of cell division at 37 ℃. Blue indicates the aspect ratio of the daughter cell at 25 ℃, red indicates the aspect ratio of the daughter cell at 37 ℃. *: significant difference at P < 0.05; **: significant difference at P < 0.01.

2.3 酿酒酵母细胞周期分析

为了进一步探究酿酒酵母在不同温度下生长周期的变化情况与Cdc5蛋白的分子动力学变化的关系,将处于对数生长期的酿酒酵母细胞经过PI染色后,用流式细胞仪检测,用FlowJo_V10处理分析酿酒酵母细胞周期,通过FSC/SSC设门的方法确定原始细胞群(图 8-A),通过FL3-A/FL3-H设门,去除粘连体,进行细胞周期分析(图 8-B),得到25 ℃与37 ℃条件下细胞周期直方图(图 8-C)。结果表明,在25 ℃条件下,酿酒酵母细胞周期中各期的细胞数量比分别为G0/G1 (58±0.72)%、S (7.04±0.83)%、G2/M (28.43±2)%,而在37 ℃条件下,细胞周期中各期的细胞数量比分别为G0/G1 (46.83±1.89)%、S (16.6±0.72)%、G2/M (25.87±0.84)% (图 9)。37 ℃较25 ℃条件下,处于G0/G1的细胞数量降低了11.17%,差异具有显著性(P<0.05),而S期的细胞数量增加了9.56%,差异极显著(P<0.01),同时,虽然G2/M的细胞数量降低了2.56%,但统计结果显示没有显著性差异。以上结果提示,37 ℃条件下,Cdc5蛋白的动力学变化与酿酒酵母细胞周期变化一致,Cdc5蛋白在芽颈处聚集的时间和在胞质分裂过程中的持续时间缩短,酿酒酵母细胞周期发生改变,从G0/G1期进入S期细胞数量增加,细胞分裂加速。

图 8 酿酒酵母在25 ℃和37 ℃条件下细胞周期变化情况 Figure 8 Cell cycle changes of budding yeast at 25 ℃ and 37 ℃.

图 9 酿酒酵母在25 ℃和37 ℃条件下细胞周期统计结果(n=3) Figure 9 Statistical results of cell cycle of budding yeast at 25 ℃ and 37 ℃ (n=3). *: significant difference at P < 0.05; **: significant difference at P < 0.01.

3 讨论

Cdc5蛋白在酿酒酵母的细胞分裂中具有调节有丝分裂起始、染色体分离、调节细胞核的形状、有丝分裂退出途径以及胞质分裂等方面有重要作用[21-22]。以往的研究表明Cdc5蛋白主要通过触发Cdc14有丝分裂后期的早期释放途径(Cdc14 early anaphase release,FEAR)以及有丝分裂退出途径(mitotic exit network,MEN)促进有丝分裂的完成。同时,Cdc5能够使Rho1、GEF、Tus1和Rom2磷酸化来促进肌动蛋白收缩环(CAR)的装配,从而将其定位于芽颈[22]。温度会影响Cdc5蛋白的活性,从而影响纺锤体功能的正常进行,与23 ℃相比,37 ℃条件下Cdc5蛋白C端Polo-box结构域诱变得到的温度敏感突变株Cdc5-11的纺锤体形态出现异常[23]。随着温度从37 ℃降低到10 ℃,微管的聚合速率与解聚速率均会降低,但是解聚的速率比聚合的速率更慢,且微管解聚前的长度随着温度的降低而趋于减小[24]。我们的结果首次明确了在酿酒酵母细胞有丝分裂过程中Cdc5蛋白在芽颈处的动力学变化。结果表明,25 ℃条件下细胞中Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间长,37 ℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处聚集时间短,两者间存在显著差异;但在两个温度下,细胞中Cdc5蛋白的荧光强度没有显著性差异。该结果提示,温度虽然会影响Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间,但不影响其荧光强度。我们的结果还首次展示了Cdc5蛋白降解过程中在母细胞与子细胞中的动力学变化。结果表明,温度也会影响Cdc5蛋白在降解过程中的动力学行为,包括Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中荧光强度峰值出现的次数和时间,且在胞质分裂过程中,不同温度下子细胞中Cdc5蛋白的荧光强度均高于母细胞中Cdc5蛋白的荧光强度,但温度并不影响Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中的表达量。以上结果表明,温度会对Cdc5蛋白的动力学产生影响,为进一步研究其在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。

目前,学者们已经研究鉴定出数百种Cdc5蛋白的底物[25],但其中许多底物尚待充分表征。Lepore等的研究表明[16],Cdc5蛋白在胞质分裂过程中还会使芽颈处的Sec4磷酸化,从而阻止Sec4与下游效应子Sec15相互作用,并阻止芽颈处的膜转运作用,最终调节芽殖分裂的细胞大小。Zakhartsev等的研究结果表明[26],与26.3 ℃条件下出芽酵母子细胞的直径相比,37.5 ℃条件下子细胞的直径更小。我们的结果首次表明,37 ℃条件下胞质分裂时及分裂完成时的子细胞的长宽比均小于25 ℃条件下的子细胞的长宽比,这也验证了Lepore等对芽殖分裂的细胞大小的研究。

Cdc5蛋白是从S期到胞质分裂中细胞周期的高度保守的关键调控因子[27]。酿酒酵母细胞周期结果表明,37 ℃与25 ℃相比,处于G0/G1的细胞数量减少,处于S期的细胞数量增多。同时激光共聚焦显示,37 ℃条件下的酵母细胞分裂的速度远快于25 ℃下的酵母细胞。这表明37 ℃条件下,酿酒酵母细胞周期发生改变,在这期间,Cdc5蛋白在芽颈处聚集的时间和在胞质分裂过程中的持续时间缩短,酿酒酵母细胞从G0/G1期进入S期细胞数量增加,细胞分裂加速。

本研究首次揭示了酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的精细分子动力学变化及酿酒酵母宏观生长情况与Cdc5蛋白的分子动力学变化的关系,为进一步研究其在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。

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