微生物学报  2020, Vol. 60 Issue (7): 1496-1511   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200047.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20200047
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
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文章信息

屈香, 杨梓纯, 许炎辉, 王娅玲, 喻婷, 樊毛迪, 王航, 高清清, 高崧, 刘秀梵. 2020
Qu Xiang, Yang Zichun, Xu Yanhu, Wang Yaling, Yu Ting, Fan Maodi, Wang Hang, Gao Qingqing, Gao Song, Liu Xiufan. 2020
lpxLlpxM基因对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌毒力的影响
Effect of lpxL and lpxM genes on virulence of avian pathogenic Escherichia coli belonging to O1 and O78 serogroups
微生物学报, 60(7): 1496-1511
Acta Microbiologica Sinica, 60(7): 1496-1511

文章历史

收稿日期:2020-01-20
修回日期:2020-04-07
网络出版日期:2020-05-27
lpxLlpxM基因对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌毒力的影响
屈香 , 杨梓纯 , 许炎辉 , 王娅玲 , 喻婷 , 樊毛迪 , 王航 , 高清清 , 高崧 , 刘秀梵     
江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 农业部禽用生物制剂创制重点实验室, 扬州大学兽医学院, 江苏 扬州 225009
摘要[目的] 为探究脂多糖对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)致病作用的影响。[方法] 选取负责脂质A生物合成相关基因lpxLlpxM,利用λ噬菌体的Red同源重组系统分别构建APEC E516(O1血清型)和APEC E522(O78血清型)缺失株E516ΔlpxL、E516ΔlpxM、E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxL、E522ΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxM,并通过体内外试验对其生物学特性及致病性进行研究。[结果] 各菌株生长速度基本一致。E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxM的抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11吞噬能力较野生株显著下降,而缺失株E516ΔlpxM、E522ΔlpxL与野生株相比无明显差异;半数致死剂量测定结果显示,除E516ΔlpxM、E522ΔlpxL外,各缺失株毒力降低1000倍左右;SPF鸡体内动态分布试验结果显示,各缺失株在鸡体内定殖能力较野生株显著下降,但回补株的毒力未能恢复至野生株水平。[结论] lpxLlpxM基因与O1血清型APEC E516株和O78血清型APEC E522株的毒力有关,但是lpxLlpxM基因对E516和E522菌株毒力的影响存在差异。
关键词禽致病性大肠杆菌    类脂A    缺失株    致病力    
Effect of lpxL and lpxM genes on virulence of avian pathogenic Escherichia coli belonging to O1 and O78 serogroups
Qu Xiang , Yang Zichun , Xu Yanhu , Wang Yaling , Yu Ting , Fan Maodi , Wang Hang , Gao Qingqing , Gao Song , Liu Xiufan     
Key Laboratory of Avian Bioproducts Development, Ministry of Agriculture, Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China
Abstract: [Objective] To explore the role of lipopolysaccharide in Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). [Methods] By using λ-phage Red recombination system, we generated the lipid A biosynthesis associated genes lpxL and lpxM mutants E516ΔlpxL, E516ΔlpxM, E516ΔlpxLΔlpxM, E522ΔlpxL, E522ΔlpxM and E522ΔlpxLΔlpxM. We conducted a series of in vivo and in vitro assays to investigate their biological characteristics and pathogenicity. [Results] The growth rate of the strains was basically the same. The ability of resistance to serum and killing by chicken macrophages were significantly impaired, E516ΔlpxL, E516ΔlpxLΔlpxM, E522ΔlpxM and E522ΔlpxLΔlpxM were significantly attenuated than those of the wild-type strains, and E516ΔlpxM and E522ΔlpxL had no obvious difference in relation to their parent strains. LD50 results show that the pathogenicity of mutants was significantly attenuated than those of the wild-type strains. The colonization and survival model demonstrated that the loads of mutants were significantly decreased compared with those of the wild-type strains in all bloods and organs tested in chickens. The ability of mutants to enter and survive in chicken macrophage HD-11 is significantly reduced compared with those of the parent strains. [Conclusion] These results indicated that lpxL and lpxM genes are critical to the pathogenicity of APEC E516 and E522, lpxL had a more significant effect on virulence of APEC E516, and lpxM gene on virulence of APEC E522.
Keywords: Avian pathogenic Escherichia coli    lipid A    mutant    pathogenicity    

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可以引起多种禽类发病,形成局部或全身典型的感染症状,严重影响禽的正常生长和饲料转化,给养殖业造成了巨大损失[1]。APEC是引起禽大肠杆菌病最重要的病原体,与人类肠外致病性大肠杆菌(如新生儿脑膜炎大肠杆菌NMEC、尿道性大肠杆菌UPEC)共有部分毒力基因[23]。APEC抗原结构复杂多样,主要由菌体抗原(O抗原)、菌毛抗原(F抗原)、鞭毛抗原(H抗原)等组成,其中O抗原常作为APEC血清型分型依据,且以O1、O2、O78等优势致病血清型为主[4]

大肠杆菌细胞壁表面的主要组分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是APEC致病的重要毒力因子[5],LPS分子的合成和运输是细菌正常生存的必需条件,其由脂质A、核心多糖和O抗原单位等不连续的结构区域组成[6]。研究表明,脂质A与致病力密切相关,是LPS分子中内毒素活性的基团[5, 7]。当致病性大肠杆菌侵入动物机体后,菌体表面的LPS分子释放脂质A,激活了机体的脂质A受体,随之通过系列免疫反应,激活宿主的先天免疫系统,产生多种促炎性细胞因子[8]。在革兰氏阴性菌的感染中,脂质A是动物体先天免疫应答的有效刺激物[9],对多种病理生理变化起着重要作用。

脂质A的合成和转运步骤复杂,主要在细胞内膜和细胞质中完成,共涉及13个反应[10]。酰基转移酶在脂质A合成的后期发挥着重要作用,其特异性位置关系到细菌LPS与宿主细胞的特异性结合和免疫反应[11]。酰基转移酶LpxL和LpxM主要负责在由2个氨基葡萄糖和4个脂肪酸链构成的兼性分子DSMP上分别加上月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈烯酸替代月桂酸[1214],而LpxL和LpxM则分别由lpxL (htrB)和lpxM (msbB)基因编码[15]。本文为了探讨脂多糖合成基因lpxLlpxM与APEC O1和O78血清型菌株致病性的关系,通过构建lpxLlpxM基因缺失株,进行相关生物学特性的研究,分析脂多糖对于APEC生物学特性、致病性的影响,以及lpxLlpxM基因在APEC O1和O78血清型中的影响有无差异,从而进一步探讨APEC的致病机理奠定基础。

1 材料和方法 1.1 试验动物、菌株、质粒和细胞

420羽1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡和180羽21日龄的SPF鸡由北京梅里亚种蛋自行孵化后于隔离器内饲养,自由采食、饮水。APEC E516 (O1)和APEC E522 (O78)菌株均为本实验室由临床发病鸡中分离的鸡源强毒株[16],本研究所用的菌株、质粒和细胞见表 1

表 1. 本研究中使用菌株、质粒和细胞 Table 1. Bacterial strains and plasmids and cell used in this study
Strains or plasmids Characteristics Source or reference
Strains
  E516 Wild-type avian pathogenic E. coli serotype O1 [16]
  E522 Wild-type avian pathogenic E. coli serotype O78 [16]
  E516ΔlpxL Lauroyl transferase-deficient strain This study
  E516ΔlpxM Myristoyl transferase-deficient strain This study
  E516ΔlpxLΔlpxM Both lauroyl transferase and myristoy transferase deficient strain This study
  E522ΔlpxL Lauroyl transferase-deficient strain This study
  E522ΔlpxM Myristoyl transferase-deficient strain This study
  E522ΔlpxLΔlpxM Both lauroyl transferase and myristoy transferase deficient strain This study
  DH5α Cloning strain Invitrogen
Plasmids
  pMD®19-T Vector TA Cloning Vector, Amp+ TaKaRa
  pACYC184 Complementary vector, Cam+ Gift from Professor Zhu Guoqiang of Yangzhou University
  pKD46 Amp+, expresses λ-phage Red recombinase [17]
  pKD3 cat+ gene, template plasmid [17]
  pCP20 Cm+, Amp+, yeast Flp recombinase gene, FLP [17]
Cell
  HD-11 Chicken macrophage line, chicken myelomonocytic cell transformed by the Myc-encoding MC29 virus Gift from Professor Jiao Xi’an of Yangzhou University

1.2 酶类和相关试剂

Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNase I (RNase-free)、DNA Ladder Mix marker、DNA限制性内切酶、Agarose Gel DNA纯化试剂盒、PCR纯化试剂盒、RNAiso Plus、PrimeScript RT-PCR Kit和DNA marker购自大连TaKaRa公司;庆大霉素(Gentamicin)、氨苄青霉素(Ampicillin)和氯霉素(Chloramphenicol)购自上海生物工程技术服务有限公司;L-阿拉伯糖购自BioBasic公司。

1.3 缺失株的构建

1.3.1 引物设计:

根据GenBank公布的APEC O1、O78的序列,分析启动子区域显示基因lpxL (htrB)、lpxM (msbB)拥有独立的单个开放阅读框,分别含有921、972 bp,基因序列在大肠杆菌中高度保守。lpxL基因的上下游基因分别为yceEyceA (图 1-A),lpxM基因的上下游基因分别为pykAmepM (图 1-B)。本研究引物按照表 2设计,由上海生物工程技术服务有限公司合成。

图 1 lpxLlpxM在APEC E516、E522基因组中的位置及缺失的位点 Figure 1 Position and mutation site of lpxL and lpxM genes in the APEC E516, E522 genome. Primers presented in Table 2.

表 2. 本研究中缺失株构建使用的引物 Table 2. Primers used in this study
Primers Sequences (5′→3′) Target genes
LLA CTCTCTAGATGGTGCCATCATGATGCA (Xba I) lpxL
LLB CTCGAGCTCATTGTGCATCGCAACCTG (Sac I) lpxL
LLC CTCGAATTCCGGTCGAGCATCGATTTA (EcoR I) lpxL
LLD CTCGATATCGCACCGGATCATGATTAC (EcoR V) lpxL
LLE CCAGTTTATAGGGGTGTC lpxL
LLF GGTTGTGTAACACTGGCA lpxL
LMA CTCTCTAGACGCGCAATCGTATGATCA (Xba I) lpxM
LMB CTCGAGCTCCAAAGTTCCGTGATCCCA (Sac I) lpxM
LMC CTCGAATTCTTATGGAACATCGCTGCC (EcoR I) lpxM
LMD CTCGATATCCGTCTGCATGCGAGAAAT (EcoR V) lpxM
LME CCACGCGTATTTTAACGG lpxM
LMF CGCAGCTACGGTTTGATT lpxM
CFEV CTCGATATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCT (EcoR V) pKD3
CRVI CTCGAATTCATGGGAATTAGCCATGGTCC (EcoR I) pKD3
RelpxL-184-F CGTAGGTATACTTTCAACATTGCTCGCAGGT (Sna I) pACYC184
RelpxL-184-R CGCCGAGTACTTAATAGCGTGAAGGAACGC (Sca I) pACYC184
RelpxM-184-F CTAATTCCGCGGTGTTGATTTTGCCATGCCAC (Sca II) pACYC184
RelpxM-184-R CGGCCCAGTACTTTATTTGAAGGGATAAAGAT (Sca I) pACYC184
pACYC184-F GGTAAACCGAAAGGCAGG lpxL, lpxM
pACYC184-R GGCTATTTAACGACCCTG lpxL, lpxM
lpxL-F ATGACGAATCTACCCAAGT lpxL
lpxL-R TTAATAGCGTGAAGGAACG lpxL
lpxM-F GCGAATACATTCCTGAGT lpxM
lpxM-R GATCTTTGCGCTTATACG lpxM

1.3.2 重组质粒pMD19-T-lpxL和pMD19-T-lpxM的构建:

用全菌裂解法制备DNA模板[18]。PCR扩增目的基因lpxLlpxM,将目的片段与克隆载体pMD19-T Simple Vector连接,构建重组质粒pMD19-T-lpxL和pMD19-T-lpxM,并测序验证。

1.3.3 重组质粒pMD19-T-lpxLcat和pMD19-T-lpxMcat的构建:

使用引物LLC/LLD、LMC/LMD分别以重组质粒pMD19-T-lpxL和pMD19-T-lpxM为模板PCR反向扩增lpxLlpxM基因;使用引物CFEV/CRVI以质粒pKD3为模板PCR扩增氯霉素基因片段,上述扩增片段经EcoR I、EcoR V双酶切,连接后转化至大肠杆菌DH5α,鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD19-T-lpxLcat和pMD19-T-lpxMcat

1.3.4 E516和E522株lpxLlpxM基因缺失株的构建:

按高清清等[19]的方法,应用λ噬菌体的Red同源重组系统构建E516、E522株lpxLlpxM单基因缺失株,分别命名为E516ΔlpxL、E516ΔlpxM、E522ΔlpxL、E522ΔlpxM;在此基础上,分别构建双缺失株E516ΔlpxLΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxM;最终通过λ噬菌体的Red同源重组系统中的辅助质粒去除所有单、双缺失株的氯霉素抗性后作为后续试验菌株。

1.3.5 E516和E522株lpxLlpxM基因回补株的构建:

设计引物RelpxL-184-F/R和RelpxM-184-F/R (表 2)分别扩增lpxLlpxM基因及其可能的启动子,并将其克隆到质粒pACYC184中。启动子预测分析使用http://www.fruitfly.org/seq_tools/启动子的预测程序工具进行。由此构建出重组质粒p184-lpxL和p184-lpxM,电转入缺失株E516ΔlpxL、E516ΔlpxM、E522ΔlpxL和E522ΔlpxM生成回补株,分别命名为ReE516ΔlpxL、ReE516ΔlpxM、ReE522ΔlpxL和ReE522ΔlpxM

1.4 遗传稳定性分析及电镜观察

1.4.1 遗传稳定性分析:

将获得的缺失株和回补株分别进行连续传20代,通过PCR鉴定及测序验证,分析其遗传稳定性。

1.4.2 生长曲线测定:

将待测菌株在基础培养基(minimal medium,MM)中的初始浓度调节为OD600=0.05,在37 ℃恒温摇床中以220 r/min摇振培养10 h,其间每隔1 h测定培养物的OD600值,并绘制各菌株的生长曲线。

1.4.3 电镜观察:

参考文献[20]方法进行。将新鲜的细菌培养液离心,去上清,以磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬,调整菌液至适当的浓度滴于铜网上,磷钨酸染色后在透射电镜(Tecnai 12,荷兰Philips公司)下观察。

1.5 RNA提取和逆转录RT-PCR分析

取野生株、缺失株及回补株单菌落于液体LB培养基中过夜振荡培养,培养物洗涤后悬浮于PBS中。使用RNAiso Plus试剂盒提取总RNA。使用gDNA Eraser (TaKaRa,中国大连)去除样品中可能残留的DNA,再使用PrimeScript RT (TaKaRa,中国大连)试剂盒进行cDNA合成。在目的基因lpxLlpxM两端设计引物(表 2),以菌株的DNA、RNA、cDNA为模板分别进行PCR鉴定。

1.6 血清补体杀菌试验

将浓度调至108菌落形成单位(colony forming units,CFU)/mL。用PBS缓冲液分别稀释SPF鸡血清至0.5%、2.5%、5%、12.5%、25%,上述浓度的血清以及25%补体灭活血清(56 ℃金属浴30 min)分别作为试验用血清。取10 μL菌液分别混合190 μL不同浓度的血清悬液和灭活血清中,于37 ℃静置培养30 min,取100 μL培养物在LB平板上进行细菌计数,18 h后观察结果。

1.7 1日龄鸡的半数致死量(LD50)测定

菌株在37 ℃恒温条件下静置培养至对数期,收获后4 ℃离心,野生株和回补株用15%甘油PBS缓冲液洗涤、悬浮并稀释至108、107、106、105和104 CFU/mL,缺失株分别稀释为1011、1010、109、108、107和106 CFU/mL。每个稀释度取0.1 mL菌液气囊接种7羽1日龄SPF鸡,攻毒后连续观察7 d记录雏鸡存活情况。LD50的计算采用SPSS统计软件(IBM SPSS statistics 22,IBM公司,美国)进行。

1.8 21日龄SPF鸡体内定居试验

180羽21日龄的SPF鸡分为12组,每组15羽分别经左胸气囊接种含108 CFU的野生株、缺失株或回补株细菌悬液,感染24 h后扑杀,无菌采集心脏血液100 µL及称取肝脏、脾脏、肺脏和肾脏各0.25 g研磨,用含15%甘油PBS缓冲液连续稀释后,用固体LB培养基进行细菌计数,以确定在各内脏器官中的细菌数量。

1.9 鸡巨噬细胞感染试验

1.9.1 HD-11细胞的吞噬试验:

将2×105个/孔的细胞接种至24孔细胞培养板,用含10% FBS的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养获得单层细胞,用PBS洗涤培养至对数期的细菌,按moi为100:1的比值将细菌加入细胞中。室温1000 r/min离心5 min,使细胞的吞噬作用同步。37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤细胞3次,加入含10% FBS和100 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基,37 ℃孵育1.5 h,杀灭胞外细菌。PBS洗涤细胞3次,加入1 mL 0.1% Triton X-100溶液裂解细胞。取100 μL加入到900 μL的PBS,依次稀释。每个稀释度的稀释液取100 μL,涂布LB平板进行细菌计数。每次重复3个孔。细胞对细菌的内吞率= (吞入细胞的细菌数÷每孔接种的细菌数)×100%。

1.9.2 胞内存活试验:

细菌感染细胞至庆大霉素杀灭胞外菌过程同1.9.1,加入含10% FBS和100 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基,37 ℃孵育1.5 h,此时计为0 h。用PBS洗涤细胞3次,加入含10% FBS和10 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基,用于抑制胞外细菌的生长增殖。自加入10 μg/mL庆大霉素DMEM培养基时开始计时,分别在细菌增殖4、8和12 h时,加入1 mL 0.1% TritonX-100溶液裂解细胞进行胞内细菌涂板计数。以0 h时细胞内的细菌数作为基数1,计算各菌的胞内存活率。细菌在胞内的存活率=在一定时间内胞内计数的细菌数÷每孔0 h时间点细胞内吞的细菌数。

1.10 数据处理

采用GraphPad Prism软件程序(GraphPad Prism软件程序,版本7.00,美国)分析组间差异的显著性。所有数据均采用Mann-Whitney检验进行分析。

2 结果和分析 2.1 缺失株和回补株的构建及稳定性研究

将筛选到的lpxL基因单缺失株、双缺失株和野生株用鉴定引物LLE/LLF扩增后分别得到1420 bp、1466 bp和1371 bp的单一条带(图 2,1–6道),测序结果显示基因序列正确,即成功构建缺失株E516ΔlpxL、E522ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxMlpxM基因单缺失株、双缺失株和野生株用鉴定引物LME/LMF扩增后得到大小约为1300 bp的单一条带(图 2,7–12道),测序结果显示基因序列正确,即成功构建缺失株E516ΔlpxM、E522ΔlpxM、E516ΔlpxLΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxM

图 2 基因lpxLlpxM缺失株的PCR鉴定 Figure 2 Identification of lpxL- and lpxM-deletion strains by PCR. M: DNA marker; lanes 1–6: the amplified of lpxL fragment of gene-deletion strains (E516ΔlpxL, E522ΔlpxL, E516ΔlpxLΔlpxM and E522ΔlpxLΔlpxM) and wild-type strains (E516 and E522) by primer LLE/LLF; lanes 7–12: the amplified of lpxM fragment of gene-deletion strains (E516ΔlpxM, E522ΔlpxM, E516ΔlpxLΔlpxM and E522ΔlpxLΔlpxM) and wild-type strains (E516 and E522) by primer LME/LMF.

将构建的互补重组质粒p184-lpxL、p184-lpxM测序正确后分别电转到lpxL基因缺失株和lpxM基因缺失株,用鉴定引物pACYC184-F/R扩增后分别得到大小约为1900 bp和1800 bp的单一条带(图 3),测序结果显示回补株的lpxL、lpxM基因序列正确,即成功构建回补株ReE516ΔlpxL、ReE522ΔlpxL、ReE516ΔlpxM和ReE522ΔlpxM。将缺失株、回补株连续传20代后,PCR鉴定未发生回复突变,序列测序结果无突变,表明其具有良好的遗传稳定性。

图 3 基因lpxL, lpxM回补株的PCR鉴定 Figure 3 Identification of lpxL- and lpxM- complementary strains by PCR. M: DNA marker; lanes 1–4: complemented strains ReE516ΔlpxL, ReE522ΔlpxL, ReE516ΔlpxM and ReE522ΔlpxM; lane 5: pACYC184.

2.2 电镜观察

在透射电镜下,E516ΔlpxL (图 4-C)、E522ΔlpxM (图 4-F)、E516ΔlpxLΔlpxM (图 4-G)和E522ΔlpxLΔlpxM (图 4-H)缺失株与野生株相比,细胞外膜及表面结构层明显变薄,局部表面结构甚至不完整,而E516ΔlpxM (图 4-D)、E522ΔlpxL (图 4-E)的表面结构相对完整;回补株细胞表面结构与E516ΔlpxL、E522ΔlpxM、E516ΔlpxLΔlpxM和E522ΔlpxLΔlpxM缺失株相比,稍有恢复,但并未完全恢复至野生株表面结构的完整性(图 4-IJKL)。

图 4 APEC E516、E522野生株、缺失株及回补株的电镜观察 Figure 4 Observation of APEC E516, E522, gene-deletion strains and their complementary strains under the electron microscope. A: E516; B: E522; C: E516ΔlpxL; D: E516ΔlpxM; E: E522ΔlpxL; F: E522ΔlpxM; G: E516ΔlpxLΔlpxM; H: E522ΔlpxLΔlpxM; I: ReE516ΔlpxL; J: ReE516ΔlpxM; K: ReE522ΔlpxL; L: ReE522ΔlpxM.

2.3 生长曲线测定

生长曲线测定结果表明,野生株E516、E522及其缺失株、回补株在MM培养基中的生长速度基本一致(图 5)。

图 5 野生株、缺失株和回补株在MM中的生长曲线 Figure 5 Growth curves of wild-type strains, gene-deletion strains and complementary strains in MM at 37 ℃ and their optical densities checked at different times.

2.4 RNA提取和逆转录RT-PCR分析

RT-PCR结果显示,lpxLlpxM基因缺失株去除氯霉素基因后,lpxLlpxM基因同源臂与FRT位点残基形成意外转录子[20](图 6图 7)。所谓“意外转录子”,是指缺失株中残留的缺失基因同源臂与氯霉素去除时遗留的FRT临时组成新的转录本正常转录,产生的转录序列称为“意外转录子”[21]。在lpxL缺失株中,删除了lpxL开放阅读框中的55 bp片段,保留了105 bp FRT残基,因此E516ΔlpxL、E522ΔlpxL意外转录子大小为971 bp,E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM意外转录子大小为1021 bp,大于lpxL基因的921 bp (图 6)。在lpxM缺失株中,删除了lpxM开放阅读框中的58 bp片段,保留了105 bp FRT残基,因此E516ΔlpxM,E522ΔlpxM意外转录子大小为979 bp,E516ΔlpxLΔlpxM,E522ΔlpxLΔlpxM意外转录子大小为1029 bp,大于lpxM基因经设计引物扩增的片段932 bp (图 7)。

图 6 lpxL基因相关野生株、缺失株和回补株的RT-PCR鉴定 Figure 6 Identification of lpxL gene in wild-type strains, gene-deletion strains and complementary strains by RT-PCR. M: DNA marker; A: E516; B: E522; C: E516ΔlpxL; D: E522ΔlpxL; E: E516ΔlpxLΔlpxM; F: E522ΔlpxLΔlpxM; G: ReE516ΔlpxL; H: ReE522ΔlpxL. Sample identities: lane 1: genomic DNA from strains; lane 2: total RNA from strains, ReE522ΔlpxL without RT after genomic DNA was removed; lane 3: cDNA derived from the total RNA of strains.

图 7 lpxM基因相关野生株、缺失株和回补株的RT-PCR鉴定 Figure 7 Identification of lpxM gene in wild-type strains, gene-deletion strains and complementary strains by RT-PCR. M: DNA marker; I: E516; J: E522; K: E516ΔlpxM; L: E522ΔlpxM; M: E516ΔlpxLΔlpxM; N: E522ΔlpxLΔlpxM; O: ReE516ΔlpxM; P: ReE522ΔlpxM. Sample identities: lane 1: genomic DNA from strains; lane 2: total RNA from strains without RT after genomic DNA was removed; lane 3: cDNA derived from the total RNA of strains.

2.5 血清补体杀菌试验结果

在浓度为12.50%和25.00%的SPF鸡血清中,E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM部分死亡,与野生株相比差异显著(P < 0.05)。低于12.50%的SPF鸡血清以及灭活血清对所有菌株的生长无明显影响。结果表明,在APEC E516菌株中,lpxL基因对APEC E516抵抗血清补体杀菌能力有明显影响,在APEC E522菌株中,lpxM基因对APEC E522抵抗血清补体杀菌能力有明显影响(图 8)。

图 8 APEC野生株、缺失株和回补株血清补体杀菌试验 Figure 8 Influence of the lipid A on serum resistance of wild-type strains E516 and E522, gene-deletion strains and complementary strains. Bacteria were incubated in different concentrations serum obtained from SPF chicks. The graph shows means standard errors. *: P < 0.05.

2.6 APEC E516、E522野生株、缺失株和回补株对1日龄SPF鸡的半数致死量(LD50)测定结果

1日龄SPF鸡LD50结果显示,与野生株相比,除E516ΔlpxM、E522ΔlpxL外,各缺失株毒力降低1000倍左右,回补株的毒力仅部分恢复。具体测定结果见表 4

表 4. E516和E522野生株、缺失株和回补株LD50的测定 Table 4. The LD50 of wild-type strains, gene-deletion strains and complementation strains of APEC E516 and E522
Strains LD50
E516 104.722
Re516ΔlpxL 108.056
Re516ΔlpxM 106.015
E516ΔlpxL 109.604
E516ΔlpxM 107.549
E516ΔlpxLΔlpxM 1010.388
E522 106.571
Re522ΔlpxL 107.141
Re522ΔlpxM 107.601
E522ΔlpxL 107.369
E522ΔlpxM 109.328
E522ΔlpxLΔlpxM 109.375

2.7 SPF鸡体内动态分布试验

24 h体内动态分布试验结果表明,与野生株E516相比,缺失株E516ΔlpxL、E516ΔlpxM、E516ΔlpxLΔlpxM在血液、脏器中的带菌量极显著下降,毒力被高度致弱(P < 0.0001),回补株ReE516ΔlpxL、ReE516ΔlpxM毒力部分恢复,但未恢复到野生株水平(图 9)。

图 9 E516及其缺失株、回补株体内动态分布结果 Figure 9 Colonization and persistence of the wild-type strain E516 (●), E516ΔlpxL (◆), E516ΔlpxM (▲), E516ΔlpxLlpxM (▼), ReE516ΔlpxL (■) and ReE516ΔlpxM (★) during systemic infection. A: blood; B: liver; C: spleen; D: lung; E: kidney. Data were presented as log10 (CFU/mL) of heart blood or log10 (CFU/g) of tissues. Horizontal bars indicated the mean values. Each data represented a sample from an individual chicken. Statistically significances as determined by the Mann-Whitney test were indicated by asterisks. **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001.

与野生株E522相比,缺失株E522ΔlpxL在血液、脏器中的带菌量显著下降(P < 0.001),缺失株E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM的带菌量极显著下降,毒力被高度致弱(P < 0.0001),回补株ReE522ΔlpxL、ReE522ΔlpxM毒力部分恢复,也未恢复到野生株水平(图 10)。

图 10 E522及其缺失株、回补株体内动态分布结果 Figure 10 Colonization and persistence of the wild-type strain E522 (○), E522ΔlpxL (◇), E522ΔlpxM (Δ), E522ΔlpxLlpxM (▽), ReE522ΔlpxL (□), and ReE522ΔlpxM (⊙) during systemic infection. A: blood; B: liver; C: spleen; D: lung; E: kidney. Data were presented as log10 (CFU/mL) of heart blood or log10 (CFU/g) of tissues. Horizontal bars indicated the mean values. Each data represented a sample from an individual chicken. Statistically significances as determined by the Mann-Whitney test were indicated by asterisks. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001.

2.8 细胞感染试验结果

2.8.1 HD-11细胞吞噬试验:

HD-11细胞吞噬试验结果显示,缺失株E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM对HD-11细胞的抗吞噬能力极显著低于野生株E516 (P < 0.0001),回补株Re516ΔlpxL抗吞噬能力部分恢复,其余菌株与野生株E516相比无显著差异(图 11-A)。缺失株E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM对HD-11细胞的抗吞噬能力极显著低于野生株E522 (P < 0.0001),回补株Re522ΔlpxM抗吞噬能力部分恢复,其余菌株与野生株E522相比无显著差异(图 11-B)。

图 11 鸡巨噬细胞HD-11细胞吞噬试验 Figure 11 Ingestion assays of bacteria by HD-11. Asterisks indicate statistically significant differences. ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001.

2.8.2 细菌胞内存活率:

细菌胞内存活试验结果显示,菌株在感染后8 h,胞内存活的细菌量达到最大值。感染8 h、12 h时,缺失株E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM在HD-11细胞内的存活率与野生株E516相比极显著下降(P < 0.0001),互补株Re516ΔlpxL的存活能力部分恢复,其余菌株与野生株E516相比无显著差异(图 12-A)。缺失株E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM在HD-11细胞内的存活率与野生株E522相比极显著下降(P < 0.0001),互补株Re522ΔlpxM的存活能力部分恢复,其余菌株与野生株E522相比无显著差异(图 12-B)。

图 12 APEC野生株、缺失株和回补株胞内存活试验 Figure 12 Intracellular survival of bacteria in chicken macrophage HD-11 cells. Asterisks indicate statistically significant differences. **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001.

3 讨论

APEC的致病机理比较复杂,涉及到诸多因子的相互作用,其中毒力相关因子尤为重要。LPS是毒力因子之一,其中的类脂A是维持革兰氏阴性细菌细胞外膜渗透性屏障作用的主要组分[20]。APEC中常见引起禽大肠杆菌病的血清群是O1、O2、O78,目前类脂A合成过程中发挥作用的两个后期酰基转移酶所编码的基因lpxLlpxM,在禽致病性大肠杆菌优势血清型O2菌株的生物学特性中的作用已有研究,类脂A结构的完整性影响APEC O2的血清杀菌、致病性等一系列生物学特性[20]。而这两个基因对于APEC O1 E516和APEC O78 E522菌株功能的影响尚不清楚。

在生长曲线测定中,各菌株在MM培养基中的生长速度虽然比较缓慢,但是生长速度基本一致,表明lpxLlpxM基因的缺失对菌株吸收基础碳酸盐等营养成分无明显影响。许慧卿等[19]对APEC O2的血清型E058株lpxLlpxM基因缺失株类脂A进行了糖组分分析,类脂A中月桂酸酯(C12:0)和肉豆蔻酸酯(C14:0)的脂肪酸组成分别由大肠杆菌后期酰基转移酶LpxL和LpxM催化,与野生株相比,lpxL缺失株的Lipid A失去了一条次级月桂酸链(C12:0),lpxM缺失株的Lipid A失去了一条次级豆蔻酸链(C14:0),双缺失株的Lipid A的两条次级脂肪酸链(C12:0和C14:0)均丢失。虽然我们未进行缺失株的糖代谢反应组分分析,但是,电镜观察结果清楚地表明,血清O1型E516株lpxL基因缺失、血清O78型E522株lpxM基因缺失对细菌表面结构的完整性影响明显;而回补株也不能将其表面结构恢复至野生株水平(图 4)。巧合的是,这一结果,与我们观察到的缺失株多数生物学特性的改变相吻合,再次证明了lpxLlpxM基因对APEC维持其生物学特性、致病性十分重要。人和动物的血液中存在补体等成分,宿主在抗病原菌感染中的第一道防线是血清补体系统的杀菌作用,血清补体抗性是APEC的一个毒力参数[2223]。本研究中部分缺失株类脂A的酰基链缺失后,对血清补体杀菌的抵抗能力也相应发生了变化,可能由于类脂A次级酰基链的缺失致使外膜孔道发生改变,通透性增加,从而提高了缺失株对血清中补体和其他杀菌因子的敏感性。幸运的是,我们的电镜观察结果较好地支持了这一推测。

APEC感染宿主时,往往需要抵御宿主巨噬细胞的吞噬作用,而在巨噬细胞内的定殖可帮助APEC菌株逃避宿主免疫系统的清除、杀伤作用[24]。有研究表明大肠杆菌已经进化出一些复杂的逃逸防御机制,其中之一便是抵御宿主巨噬细胞的吞噬作用[25]。HD-11巨噬细胞吞噬和存活试验结果显示,E516ΔlpxL、E516ΔlpxLΔlpxM、E522ΔlpxM、E522ΔlpxLΔlpxM缺失株的抗吞噬能力和细胞内定殖、存活能力较野生株显著下降,回补株存活能力有所提高。

在细菌致病性研究中,动物感染试验往往是直观评价病原菌毒力因子致病作用的“金标准”。LD50是评价APEC对鸡致病性的一个重要指标,本研究LD50测定结果显示,与野生株相比,缺失株已基本丧失毒力,而回补株的毒力未恢复至野生株水平。体内动态分布试验有助于判定菌株在鸡体脏器中的定殖能力,试验结果显示,缺失株在感染鸡各脏器的定殖能力与野生株相比下降显著,回补株未恢复至野生株水平。上述结果均证实,类脂A作为APEC的一种重要毒力因子,在细菌的致病过程中发挥了不可或缺的作用。致病菌感知环境信号,通过控制毒力基因的转录、表达发挥致病作用[26]。λ噬菌体的Red重组系统因其简便性和高效率而适合构建APEC缺失株,但有研究发现,该系统具有局限性。将氯霉素抗性基因从缺失株删除后,原本目的基因的启动子驱使缺失基因的上下游同源臂及残留的FRT位点进行正常转录,这一转录的序列,称为“意外转录子”,而且“意外转录子”的转录会影响缺失株的致病力[21]。本研究中,我们再次证实,当去除氯霉素抗性基因后,缺失株确实产生了“意外转录子”,但存在“意外转录子”的缺失株与氯霉素抗性去除之前的缺失株相比,致病性有无变化,本文尚未涉及。

综合本研究,lpxLlpxM基因对O1血清型APEC E516菌株致病性的影响与APEC O2 E058株相似,即lpxL基因影响程度大于lpxM基因;而lpxLlpxM基因在O78血清型APEC E522菌株致病性中发挥的作用出现明显差别,即lpxM基因影响程度大于lpxL基因,这一结果出乎预料。有研究发现,同一基因由于表达量的高低不同,在不同基因型菌株中发挥的作用有所不同,从而导致了菌株的毒力强弱的变化[27]。根据本研究结果,lpxLlpxM对不同血清型菌株生物学特性的影响程度不同,对其毒力和致病性的影响也不尽相同。然而,具体机制还需要更进一步的深入研究。

References
[1] Wang XM, Liao XP, Zhang WJ, Jiang HX, Sun J, Zhang MJ, He XF, Lao DX, Liu YH. Prevalence of serogroups, virulence genotypes, antimicrobial resistance, and phylogenetic background of avian pathogenic Escherichia coli in south of China. Foodborne Pathogens and Disease, 2010, 7(9): 1099-1106. DOI:10.1089/fpd.2010.0542
[2] Johnson TJ, Wannemuehler Y, Johnson SJ, Stell AL, Doetkott C, Johnson JR, Kim KS, Spanjaard L, Nolan LK. Comparison of extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains from human and avian sources reveals a mixed subset representing potential zoonotic pathogens. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(22): 7043-7050. DOI:10.1128/AEM.01395-08
[3] Tivendale KA, Logue CM, Kariyawasam S, Jordan D, Hussein A, Li GW, Wannemuehler Y, Nolan LK. Avian-pathogenic Escherichia coli strains are similar to neonatal meningitis E. coli strains and are able to cause meningitis in the rat model of human disease. Infection and Immunity, 2010, 78(8): 3412-3419. DOI:10.1128/IAI.00347-10
[4] Tuntufye HN, Lebeer S, Gwakisa PS, Goddeeris BM. Identification of avian pathogenic Escherichia coli genes that are induced in vivo during infection in chickens. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(9): 3343-3351. DOI:10.1128/AEM.07677-11
[5] Triantafilou M, Triantafilou K. Receptor cluster formation during activation by bacterial products. Journal of Endotoxin Research, 2003, 9(5): 331-335. DOI:10.1177/09680519030090051001
[6] Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67(4): 593-656. DOI:10.1128/MMBR.67.4.593-656.2003
[7] Sandford EE, Orr M, Balfanz E, Bowerman N, Li XY, Zhou HJ, Johnson TJ, Kariyawasam S, Liu P, Nolan LK, Lamont SJ. Spleen transcriptome response to infection with avian pathogenic Escherichia coli in broiler chickens. BMC Genomics, 2011, 12: 469. DOI:10.1186/1471-2164-12-469
[8] Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T, Sanjo H, Takada H, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of Gram-negative and Gram-positive bacterial cell wall components. Immunity, 1999, 11(4): 443-451. DOI:10.1016/S1074-7613(00)80119-3
[9] Babinski KJ, Raetz CRH. Identification of a gene encoding a novel Escherichia coli UDP-2, 3-diacylglucosamine hydrolase. The FASEB Journal, 1998, 12(8): A1288.
[10] Raetz CRH. Biochemistry of endotoxins. Annual Review of Biochemistry, 1990, 59: 129-170. DOI:10.1146/annurev.bi.59.070190.001021
[11] Hittle LE, Powell DA, Jones JW, Tofigh M, Goodlett DR, Moskowitz SM, Ernst RK. Site-specific activity of the acyltransferases HtrB1 and HtrB2 in Pseudomonas aeruginosa lipid A biosynthesis. Pathogens and Disease, 2015, 73(8): ftv053. DOI:10.1093/femspd/ftv053
[12] Raetz CRH, Reynolds CM, Trent MS, Bishop RE. Lipid A modification systems in Gram-negative bacteria. Annual Review of Biochemistry, 2007, 76: 295-329. DOI:10.1146/annurev.biochem.76.010307.145803
[13] Carty SM, Sreekumar KR, Raetz CRH. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli:induction at 12 ℃ of an acyltransferase specific for palmitoleoyl-acyl carrier protein. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(14): 9677-9685. DOI:10.1074/jbc.274.14.9677
[14] Vorachek-Warren MK, Carty SM, Lin SH, Cotter RJ, Raetz CRH. An Escherichia coli mutant lacking the cold shock-induced palmitoleoyltransferase of lipid A biosynthesis:absence of unsaturated acyl chains and antibiotic hypersensitivity at 12 degrees C. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(16): 14186-14193. DOI:10.1074/jbc.M200408200
[15] Clementz T, Bednarski JJ, Raetz CRH. Function of the htrB high temperature requirement gene of Escherichia coli in the acylation of lipid A:htrB catalyzed incorporation of laurate. The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271(20): 12095-12102. DOI:10.1074/jbc.271.20.12095
[16] Gao S, Liu XF, Zhang RK, Jiao XA, Wen QY, Wu CX, Tang YM, Zhu XB, Li C, Chen J, Cui Lb, Cui HP. The isolation and identification of pathogenic Escherichia coli isolates of chicken origin from some regions in China. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 1999, 30(2): 164-171. (in Chinese)
高崧, 刘秀梵, 张如宽, 焦新安, 文其乙, 吴长新, 唐一鸣, 朱晓波, 李琮, 陈娟, 崔力兵, 崔洪平. 我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定. 畜牧兽医学报, 1999, 30(2): 164-171. DOI:10.3321/j.issn:0366-6964.1999.02.015
[17] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(12): 6640-6645. DOI:10.1073/pnas.120163297
[18] Schilling B, Hunt J, Gibson BW, Apicella MA. Site-specific acylation changes in the lipid A of Escherichia coli lpxL mutants grown at high temperatures. Innate Immunity, 2014, 20(3): 269-282. DOI:10.1177/1753425913490534
[19] Xu HQ, Ling JL, Gao QQ, He HB, Mu XH, Yan Z, Gao S, Liu XF. Role of the lpxM lipid A biosynthesis pathway gene in pathogenicity of avian pathogenic Escherichia coli strain E058 in a chicken infection model. Veterinary Microbiology, 2013, 166(3/4): 516-526.
[20] Xu HQ. Construction, pathogenicity and immune characterization of lpxLlpxM and lpxP mutants of avian pathogenic Escherichia coli E058. Doctor Dissertation of Yangzhou University, 2013. (in Chinese)
许慧卿.禽致病性大肠杆菌E058株lpxLlpxMlpxP基因突变株构建及致病性、免疫特性研究.扬州大学博士学位论文, 2013.
[21] Liu JH, Mu XH, Wang XB, Huan HX, Gao QQ, Chen J, Qiao PZ, Jiang LY, Gao S, Liu XF. Unexpected transcriptome pompT contributes to the increased pathogenicity of a pompT mutant of avian pathogenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology, 2019, 228: 61-68. DOI:10.1016/j.vetmic.2018.11.011
[22] Gao QQ, Xia L, Liu JH, Gao S, Liu XF. Dual deletion of the kpsE and kpsD genes reduced the bacterial virulence of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(10): 1571-1582. (in Chinese)
高清清, 夏乐, 刘娟华, 高崧, 刘秀梵. kpsEkpsD双基因缺失显著降低肠道外致病性大肠杆菌的毒力. 微生物学报, 2016, 56(10): 1571-1582.
[23] La Ragione RM, Woodward MJ. Virulence factors of Escherichia coli serotypes associated with avian colisepticaemia. Research in Veterinary Science, 2002, 73(1): 27-35. DOI:10.1016/S0034-5288(02)00075-9
[24] Fetherston JD, Kirillina O, Bobrov AG, Paulley JT, Perry RD. The yersiniabactin transport system is critical for the pathogenesis of bubonic and pneumonic plague. Infection and Immunity, 2010, 78(5): 2045-2052. DOI:10.1128/IAI.01236-09
[25] Brubaker RR. Interleukin-10 and inhibition of innate immunity to yersiniae:roles of yops and lcrV (V antigen). Infection and Immunity, 2003, 71(7): 3673-3681. DOI:10.1128/IAI.71.7.3673-3681.2003
[26] Gao QQ, Xu HQ, Wang XB, Zhang DB, Ye ZQ, Gao S, Liu XF. RfaH promotes the ability of the avian pathogenic Escherichia coli O2 strain E058 to cause avian colibacillosis. Journal of Bacteriology, 2013, 195(11): 2474-2480. DOI:10.1128/JB.02074-12
[27] Du DC, Yu YF, Ma CF, Yao HC, Lu CP, Zhang W. Genotype of mrp and its relationship with the virulence of Streptococcus suis serotype 2. Microbiology China, 2016, 43(1): 147-155. (in Chinese)
杜德超, 于岩飞, 马彩凤, 姚火春, 陆承平, 张炜. 猪链球菌2型不同mrp基因型与毒力的关系. 微生物学通报, 2016, 43(1): 147-155.