中国科学院微生物研究所,中国微生物学会,中国菌物学会
文章信息
- 龚婷, 黄书伦, 查晶晶, 孙普, 马雪青, 白兴文, 袁红, 曹轶梅, 李坤, 张婧, 卢曾军, 刘在新, 李平花. 2020
- Gong Ting, Huang Shulun, Zha Jingjing, Sun Pu, Ma Xueqing, Bai Xingwen, Yuan Hong, Cao Yimei, Li Kun, Zhang Jing, Lu Zengjun, Liu Zaixin, Li Pinghua. 2020
- 一株O型口蹄疫病毒在C57BL/6小鼠和原代细胞的传代及其全序的测定和分析
- Passage of a type O foot-and-mouth disease virus in mice and cell and analysis of its complete sequence
- 微生物学报, 60(7): 1413-1420
- Acta Microbiologica Sinica, 60(7): 1413-1420
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文章历史
- 收稿日期:2019-09-23
- 修回日期:2019-12-16
- 网络出版日期:2020-05-26
2. 河南牧业经济学院, 河南 郑州 450000
2. Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus,FMDV)引起猪、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播迅速、发病率高,我国规定为一类动物传染病。该病的暴发和流行严重危害家畜的生产力和畜产品质量,影响发病地区的经济发展、国际贸易和社会稳定。因此,100多年来该病一直是全世界兽医学家关注的焦点。
国际兽医卫生组织规定FMD疫苗效力的有效性评估必须在猪和牛等靶动物上进行。但该方法存在非免疫的猪、牛等纯净动物来源困难、试验成本高、难以操作等一系列问题。因此,FMDV实验动物模型的研究越来越受到人们的关注。20世纪30年代,研究者发现一些FMDV接种豚鼠后能引起和猪、牛感染相似的临床症状,在趾部、舌面和唇部出现水泡性组织病变,至此,人们将豚鼠作为FMDV研究的一种模型动物,用于病毒致病性及疫苗免疫效力的评估[1–3]。但是,到目前为止,豚鼠遗传学和免疫系统等方面还不完全清楚,且一些FMDV毒株不易在豚鼠体内引起激发性病变而受到应用的限制[4]。相比豚鼠,近年来的研究发现,一些FMDV(C1 C-S8c1、SAT1、Asia1 Shamir和A/Arg/01)对C57BL/6小鼠是非常敏感的,它们均可导致该品系小鼠出现典型的临床症状和死亡[4–6],而一些对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV,如O/Jincheon/SKR/2014、A/Malaysia/97和Asia1/MOG/2005,通过在C57BL/6小鼠和原代细胞(新生山羊舌上皮细胞ZZ-R)的多次适应传代,也能引起C57BL/6小鼠发病和死亡[7]。自此,C57BL/6小鼠也逐渐被作为一种实验动物模型,用于FMDV疫苗效力和致病性等的研究[8–9]。但到目前为止,有关FMDV株感染C57BL/6小鼠动物模型的研究仍鲜有报道。因此,本研究通过FMDV在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞的循环传代,试图建立FMDV的实验感染模型,从而为FMDV致病分子机制和新型疫苗的开发奠定基础。
1 材料和方法 1.1 病毒、细胞、动物不能引起C57BL/6小鼠出现临床症状的FMDV O/HK/CHA/99第4代乳鼠毒(O/HK/CHA/99 MF4)和胎猪肾原代细胞FPK由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队分离保存。8周龄C57BL/6小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所动物厂。
1.2 FMDV的传代FMDV O/HK/CHA/99 MF4鼠毒12000 r/min离心10 min,取上清后脚掌皮下接种8周龄C57BL/6小鼠(n=10),0.1 mL/只。接种48 h后小鼠眼眶采血、分离血清并过滤。过滤后的所有血清接种单层长满的FPK细胞。当约95%以上FPK细胞出现细胞变圆时,收集病变细胞,反复冻融3次后,12000 r/min离心10 min,取上清以1/10体积的病毒接种量再次接种至单层长满的FPK细胞,约95%以上FPK细胞出现细胞病变后,如上收集病毒,再接种C57BL/6小鼠进行循环传代。C57BL/6小鼠和FPK细胞的循环传代重复9次(传代详情见图 1)。其中将病毒在FPK细胞上第2次传代收集的病毒标记为循环的代次(Cn),如第5轮循环在FPK细胞上第2次传代的病毒,标记为O/HK/CHA/99 MF4C5。整个循环传代过程中同时设立对照小鼠,接种PBS,0.1 mL/只。为了检测FMDV在未出现临床症状小鼠体内的复制情况,将小鼠体内分离的血液用RNAasy Mini Kit提取细胞总RNA,用FMDV 3D特异的引物(RQ1 CAAACCTGTGATGGCTTCGA,RQ3 CCGGTAC TCGTCA/TGGTCCA)和探针(FAM-CTCTCCTTT GCACGCCGTGGGAC-BHQ) RT-PCR实时荧光定量检测接种的FMDV在小鼠体内RNA的拷贝数。
1.3 FMDV蚀斑表型和一步生长曲线
为了比较分析循环传代引发C57BL/6小鼠出现临床症状和死亡的FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5和传代前病毒O/HK/CHA/99 MF4的生物学特性,我们对这2个病毒的蚀斑表型和一步生长曲线进行分析。将O/HK/CHA/99 MF4C5和O/HK/CHA/99 MF4两个FMDV分别作10倍系列稀释,然后将不同稀释度病毒按照文献报道的方法做蚀斑表型分析,并计算每个病毒的噬斑形成单位(PFU)[10]。将106 PFU/mL的两病毒分别接种到长满的单层BHK-21细胞(25 mL培养瓶,约106个细胞),吸附1 h后弃病毒液,用PBS洗3次,加5 mL MEM基础培养基,并置于CO2培养箱继续培养。于接种后4、8、12、16 h分别收取感染细胞,反复冻融2次后在BHK-21单层细胞上按照常规方法测定病毒的滴度(PFU/mL),并绘制病毒的一步生长曲线。
1.4 FMDV对乳鼠的致病性为了检测FMDV O/HK/CHA/99 MF4和O/HK/CHA/99 MF4C5对乳鼠的致病性,将两病毒用PBS缓冲液(pH=7.6)进行10倍系列稀释,取10–4–10–8稀释度的病毒液皮下接种2日龄乳鼠,0.2 mL/只,每个稀释度接种4只,设2个空白对照。接种后每日观察乳鼠的发病和死亡情况,连续观察1周,并记录,用Reed-munch法计算病毒对乳鼠的LD50。
1.5 FMDV对C57BL/6小鼠的致病性为了检测传代病毒O/HK/CHA/99 MF4C5和O/HK/CHA/99 MF4C9对C57BL/6小鼠的致病性,我们将两病毒用PBS缓冲液(pH=7.6)进行10倍系列稀释,取10–1–10–5稀释度分别脚后掌皮下接种8周龄C57BL/6小鼠,每个稀释度接种5只,0.1 mL/只,对照小鼠接种PBS。连续观察7 d,根据小鼠的发病情况,用Reed-Munch法计算两FMDV对C57BL/6小鼠的LD50。
1.6 FMDV基因组全序列的测定和编码氨基酸的比对分析为了比较分析循环传代过程中FMDV编码氨基酸的差异,收集不能引起C57BL/6小鼠出现临床症状的突变株(O/HK/CHA/99 MF4和O/HK/ CHA/99 MF4C3)以及致C57BL/6小鼠出现临床症状和死亡的FMDV(O/HK/CHA/99 MF4C5和O/ HK/CHA/99 MF4C9),用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)提取细胞总RNA,然后用合成的引物(表 1)对其进行RT-PCR,扩增每个病毒5个重叠的DNA片段。扩增片段经凝胶纯化回收后送西安奥科生物技术有限公司进行序列测定。测定的病毒全基因序列用软件MegAlign比较分析。
Primer | Primer sequence (5′→3′) | Fragment |
HK1F | TTGAAAGGGGGCGCTAGGGT | HK1 |
HK1R | GGGGGGGGGGGGTGAAAGGCGGGCTTC | |
HK2F | TCGACGATAAAGGGCTGTGACC | HK2 |
HK2R | GGTCAGCCGTCTTTGGGTCAGT | |
HK3F | ACCGCTACGACCAGTACAAGGTAC | HK3 |
HK3R | TGGCGAATATGTCATTGATGTCAC | |
HK4F | ATCATGCTGGCTGACACCGGTCTT | HK4 |
HK4R | CTGTCTTCCCGTCGAGTATGAGCT | |
HK5F | AGAGACCTCTGAAAGTGAGAGCCA | HK5 |
HK5R | T18GAATAGAGGAAACGGGAAAAGC |
2 结果和分析 2.1 FMDV的传代
FMDV O/HK/CHA/99 MF4前3轮循环传代接种的C57BL/6小鼠,在48 h内看不到任何明显的精神沉郁、行动迟缓、毛发直立、运动失调的临床症状和死亡,但实时荧光定量的结果表明接种的FMDV在小鼠体内进行了有效地复制。循环传代至第4轮时,在48 h内有3只小鼠出现精神沉郁、行动迟缓、毛发直立、运动失调等症状,传至第5轮时,在48 h内,1/2以上的小鼠出现不同程度的临床症状,且有1只小鼠死亡。继续循环传代至第9轮,48 h内全部接种小鼠均出现典型的临床症状,并有2只小鼠发生死亡,且第1只小鼠出现死亡的时间比第5轮循环中出现死亡的时间缩短了10 h (表 2)。而所有接种PBS的小鼠在整个实验过程中未出现任何FMDV的临床症状和死亡。这些结果表明对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV,可以通过在体内和体外的多次循环传代引起小鼠出现典型FMD临床症状和死亡,而且随着传代次数的增加,FMDV对小鼠的致病力也逐渐增强。
Passage number | Clinical symptoms | Viremia | Mice with clinical symptoms | Dead mice | Time of the first mice died/h |
Cycle 1 | – | Y | 0 | 0 | |
Cycle 2 | – | Y | 0 | 0 | |
Cycle 3 | – | Y | 0 | 0 | |
Cycle 4 | + | Y | 3 | 0 | |
Cycle 5 | + | Y | 5 | 1 | 46 |
Cycle 6 | ++ | Y | 7 | 1 | 46 |
Cycle 7 | +++ | Y | 7 | 1 | 45 |
Cycle 8 | +++ | Y | 8 | 2 | 40 |
Cycle 9 | +++ | Y | 10 | 2 | 36 |
+: Clinical symptoms were observed in 48 h post-inoculated; ++: Severe clinical symptoms were observed in 48 h post-inoculated; +++: Very severe clinical symptoms were observed in 48 h post-inoculated; Y: Emergence of viremia. |
2.2 蚀斑表型和一步生长曲线
用常规方法分别对FMDV O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5进行了蚀斑表型和一步生长曲线分析。结果表明,适应前和适应后病毒FMDV均可在BHK-21细胞上形成蚀斑,且蚀斑形态大小相同(图 2-A)。一步生长曲线也表明2个病毒FMDV和BHK-21细胞上具有相似的复制能力。说明FMDV O/HK/CHA/99 MF4通过在体内和体外的循环适应并没有改变其蚀斑表型和病毒的复制特性。
2.3 FMDV对乳鼠的致病性
将FMDV O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5不同稀释度病毒分别接种2日龄乳鼠,其中FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5 10–3至10–7接种的乳鼠在40 h内全部死亡,而接种FMDV O/HK/CHA/99 MF4 10–3至10–6的小鼠在接种后48 h内全部死亡。剩余乳鼠和对照乳鼠连续观察1周均未出现任何FMD临床症状和死亡。统计乳鼠的死亡情况,计算O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5对乳鼠的LD50,分别为106.5和107.5。结果说明FMDV O/HK/CHA/99 MF4经体内和体外循环传代后,对乳鼠的致病力明显增强,这可能是传代适应的FMDV致C57BL/6小鼠出现临床症状和死亡的原因。
2.4 FMDV对C57BL/6小鼠的致病性选取循环适应传代的第5和第9轮FMDV,检测其对C57BL/6小鼠的致病性。结果测得适应5轮和9轮后的FMDV对C57BL/6小鼠的LD50分别为102.8和105.1,表明增加FMDV在小鼠和原代细胞中的循环传代次数,能够增强FMDV对C57BL/6小鼠的致病力。两病毒接种C57BL/6小鼠后死亡情况见图 3。
2.5 FMDV全序的测定和编码氨基酸的比对分析
循环传代前和循环适应后第3、5和9代FMDV进行核苷酸序列的测定,结果表明第3代病毒发生2个核苷酸(VP3 C123T,2C C278T)的突变,第5代病毒发生了6个核苷酸的突变(VP4 G189A,VP2 C309T,VP3 C123T+C294T,VP1 G37A+C168G,2C C278T),第9代FMDV发生了7个核苷酸的突变(VP4 G189A,VP2 C309T,VP3 C123T+C294T,VP1 G37A+C168G,2C C278T)。利用MegAlign分子生物学软件对测定FMDV的编码氨基酸进行比对分析,结果表明第3代病毒发生了1个氨基酸(2C A93T)的突变,第5代和第9代病毒均获得了2个氨基酸的突变(VP1 A13T和2C A93T)。传代病毒核苷酸和氨基酸的变化详情见表 3。循环传代病毒核酸的变化主要发生在结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1和2C区域,而氨基酸的变化仅发生在VP1和2C蛋白上。这些氨基酸的变化是否导致FMDV对小鼠致病力的增强有待进一步研究。
Gene | (O/HK/CHA/99 MF4C3) | (O/HK/CHA/99 MF4C5) | (O/HK/CHA/99 MF4C9) | |||||||
Nucleotide | Amino acid | Nucleotide | Amino acid | Nucleotide | Amino acid | |||||
VP4 | – | – | G189A | – | G189A | – | ||||
VP2 | – | – | C309T | – | C309T | – | ||||
VP3 | C123T | – | C123T | – | C123T | – | ||||
– | – | C294T | – | C294T | – | |||||
VP1 | – | – | G37A | A13 T | G37A | A13 T | ||||
C168G | ||||||||||
2C | C278T | A93T | C278T | A93T | C278T | A93T |
3 讨论
实验动物模型在各种病毒疫苗的研究中具有重要的作用,利用动物模型可对疫苗的安全性、免疫原性以及保护效力进行评估。因此,寻求一种经济、方便、操作简单和来源充足的FMDV动物模型备受研究者的关注。对于FMDV来说,除豚鼠和乳鼠动物模型外[5–6],C57BL/6小鼠模型一直未能建立。推测可能是因为许多的FMDV株不能引起C57BL/6小鼠发病[5–6]。直到2016年,韩国学者发现一些不引起C57BL/6小鼠发病的FMDV (O Jincheon/SKR/2014、A Malaysia 97和Asia1 MOG/2005),通过在C57BL/6小鼠体内(1次)+胎新生山羊舌上皮细胞(ZZ-R)传代(2次),共5轮循环传代后,3个病毒均可引起C57BL/6小鼠出现典型的FMDV临床症状和死亡,但其机制仍不清楚。另外他们也发现C57BL/6模型动物对FMDV疫苗效力的评价结果与在靶动物上取得的结果一致。因此,他们认为应用C57BL/6小鼠可以有效地评估FMDV疫苗的效力[7]。
为了在本实验室成功建立FMDV的C57BL/6小鼠模型,用于低成本、简单、有效评估FMD疫苗的效力以及一些病毒致病机制的探索,本研究选取一株不引起C57BL/6小鼠发病的FMDV O/HK/CHA/99的第4代乳鼠毒(O/HK/CHA/99 MF4),在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞之间循环适应传代。结果我们成功获得一株能够引起C57BL/6小鼠发病和死亡的FMDV突变株。该突变株随着传代次数的增加,对小鼠的致病力也逐渐增强(如相比第5轮传代病毒,第9轮传代病毒对C57BL/6小鼠的LD50增加了约100倍)。我们的结果说明,对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV,可以通过在C57BL/6小鼠体内和体外细胞的循环传代而引起C57BL/6小鼠发病和死亡,且随着传代次数的增加,病毒的毒力也逐渐增强。但传代FMDV对C57BL/6小鼠致病力的增强与病毒在细胞上的复制没有直接的相关性。
为了未来揭示传代前和传代后FMDV对C57BL/6致病性差异的分子机制,我们对传代前和传代后第3、5和9代病毒的编码氨基酸进行了比对分析,发现第3轮传代病毒获得1个氨基酸的突变(2C A93T),第5轮和第9轮病毒均获得2个氨基酸(VP1 A13T和2C A93T)的突变。这与韩国学者的报道相似,O/Jincheon/SKR/2014、A/Malaysia/97经过5轮循环传代也获得了多个氨基酸的突变,但Asia1 MOG/2005经过5轮循环传代只发生了1个核苷酸的变化,没有氨基酸的突变[7]。但至今为止,无论是韩国学者还是本研究,对于传代病毒致病性发生改变的机制仍不清楚,是否由于传代过程中获得氨基酸突变所致,还是可能存在其他未知的机制,有待未来进一步的研究。
本研究通过在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞的多轮循环传代,成功建立了FMDV的C57BL/6小鼠模型,为未来FMD疫苗效力的评估和病毒致病机制的研究奠定了基础。
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