海洋沉积物中生活着大量种类繁多的微生物，它们因受海水环境、pH值、温度等影响而显现出不同的特征^[1]。潮间带初级生产力程度高，矿物质含量丰富，比外海有更高的沉降率，潮间带沉积物底泥中微生物的数量会比海水中的数量明显增多^[2]。2016年，王怡婷等进行胶州湾沉积物可培养细菌的多样性及其抑菌活性研究^[3]。中国南海作为世界上第三大陆缘海，也是中国最大和最深的海。东海岛位于其北端，其独特的海洋环境蕴藏着丰富的微生物资源，但目前关于南海东海岛微生物资源的研究和开发程度较低，这有待进一步进行科学研究和开发利用。由于东海岛临港工业发展等因素，潮间带的面积在迅速减少，潮间带微生物的多样性受到不同程度的破坏，因此对潮间带微生物进行调查有一定的研究意义^[4]。

近年来，细菌对抗生素的耐药性不断增强，导致了全球健康危机，能否快速筛选到具有新结构、新活性的微生物天然产物已成为开发新药研究迫切解决的难题。微生物抑菌活性次生代谢产物主要分为聚酮类和肽类化合物。聚酮类化合物是由一类广泛存在于自然界的聚酮合酶(polyketidesynthetase，PKS)催化产生，广泛分布于真菌、细菌、放线菌和植物中，包括四环素类、内酯类、聚醚类以及蒽环类4大类^[5]。PKS主要分为三类，分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型^[6]。PKSI主要负责大环内酯类、聚醚类和多烯类化合物的催化合成^[7]，如红霉素(erythromycin)、利福霉素(rifamycin)、西罗莫司(sirolimus)等，其合成的抗生素在抗感染、抗肿瘤及免疫抑制等方面有着巨大的应用价值^[8]。近年来，枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为一种生物安全菌株，其PKS基因簇代谢产物发掘及其生物活性的研究有所增加，如杨杰^[9]和Komaki^[10]进行PKS基因生物合成异香豆素类化合物细菌素和Amicoumacin类抗生素研究等^[11]；从Bacillus velezensis基因组挖掘分析和体外抗菌活性研究等^[12-14]；以及丝状真菌产生次级代谢产物PKSI研究^[15]，如叶美金等进行渐绿木霉基因组中PKS和NRPS基因的多样性分析^[16]。目前从海洋微生物中筛选PKS基因的工作发展迅速^[17]，而从东海岛微生物中筛选PKS基因的报道鲜少。

本文从南海东海岛沉积物样品中分离纯化细菌，采用抑菌活性筛选与PKSI基因筛选相结合的方法，快速评估分离细菌抑菌活性及产聚酮类化合物的潜力。对活性菌株及发酵液进行抑菌活性稳定性研究，有助于后续对抑菌化合物的开发利用。初步探讨东海岛沉积物中细菌抑菌活性及产聚酮类化合物的潜力，以此进一步了解东海岛沉积物细菌的利用价值和发展前景^[18]。

1 材料和方法 1.1 样品

2017年10月22号早上6点半，从我国南海的东海岛海域（沿海岸线2 km左右，东经110°32′22″，北纬21°0′56″）采集海泥沉积物一份。

1.2 培养基

1.2.1 改良2216E培养基:

蛋白胨5 g、酵母膏1 g、琼脂15 g、陈海水1 L。

1.2.2 牛肉膏蛋白胨培养基:

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0-7.2。

1.2.3 肉汤培养基:

蛋白胨20 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，pH 7.5±0.1。

1.3 主要仪器和试剂

蛋白酶、Mighty Amp^TMDNA Polymerase、引物等购于广州瑞真生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京Solarbio科技有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；WFH-201B紫外透射反射仪(上海精科实业有限公司)；A300基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)。

1.4 细菌菌株的分离和鉴定

1.4.1 分离纯化:

称取海泥沉积物1 g，加入9 mL无菌海水，取0.1 mL逐级稀释为10^-2-10^-6浓度涂布于平板培养基，在30 ℃生化培养箱里培养。根据菌落形态、大小等特征挑取单菌落，划线分离纯化3次后，直至获得纯细菌培养物。

1.4.2 形态鉴定:

观察菌体细胞革兰氏染色特性和菌落形态特征。记录菌株的菌落大小、颜色、透明度、边缘特征、湿润度、菌落突起或凹陷等特征。

1.4.3 生理生化鉴定:

对所筛选的菌株进行生理生化检验^[19]：酶促试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、甲基红试验、三糖铁琼脂试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、分解酪蛋白试验、产脂肪酶试验、褐藻酸的降解检测。

1.5 16S rRNA基因扩增和序列测定

按照PCR扩增试剂盒操作说明提取基因组。以提取的基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rRNA序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

1.6 系统发育学分析

将测序得到的16S rRNA序列在NCBI进行BLAST比对，选取与分离菌株相似度最高的标准株，用MEGA6.0软件构建系统发育树，选择Neighbor-Joining法，Bootstrap设为1000次，分析其系统发育地位。

1.7 抑菌活性测定

将菌株接种到装有改良2216E液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养24 h后，将发酵液12000 r/min离心10 min，取上清液备用。指示细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)接种牛肉膏蛋白胨液体培养基、肉汤液体培养基，在37 ℃摇床培养1 d待用。利用分光光度计法测定OD₆₀₀估算菌液浓度，使指示菌终浓度为10⁷个细胞/mL。采用滤纸片法检测待测上清液抑菌活性，平板配制混合指示菌培养基15 mL，在滤纸片上滴加5 μL待测上清液，以无菌蒸馏水为阴性对照，硫酸链霉素(1 mg/mL)为阳性对照。将制好的平板放4 ℃使其扩散2 h后，再置于37 ℃恒温培养箱中培养1 d，观察并通过十字交叉法记录抑菌圈大小。

1.8 PKSI基因筛选

1.8.1 PSKI基因扩增:

PSKI基因扩增引物为KSF(5′-GCGATGGATCCNCAGCAGCG-3′)和KSR (5′-GTGCCGGTNCCGTGNGYYTC-3′)^[20]。扩增程序分别为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，68 ℃ 1.5 min，共35个循环；68 ℃延伸10 min。

1.8.2 PKSI系统发育学分析:

将测序得到的PKSI基因序列所对应的氨基酸序列进行BLAST比对，选取相似度最高的标准株序列，用MEGA6.0软件构建系统发育树，选择Neighbor-Joining法，Bootstrap设为1000次，分析其序列相似性。

1.9 菌株耐受性及其抑菌物质的稳定性实验

1.9.1 生长温度范围实验:

挑取单菌落划线接种于改良2216E斜面培养基上，分别置于4、15、30、40和50 ℃恒温条件下培养，培养1-4 d后观察并记录菌体生长情况。

1.9.2 耐盐实验:

在改良2216E培养基的基础上，分别添加浓度为0%、1%、3%、5%、7%、9%、10%的NaCl；挑取单菌落于配制好的不同NaCl浓度的液体培养基内，培养1-3 d，观察并测量紫外分光光度值OD₆₀₀。

1.9.3 耐酸碱实验:

配制不同pH值(3.0，5.0，7.0，9.0，11.0)的改良2216E培养基，挑取单菌落接种于配制好的培养基内培养1-3 d，观察并测量紫外分光光度值OD₆₀₀。

1.10 抑菌物质热稳定性实验

取等量菌株DHD-15发酵液，12000 r/min离心10 min取上清液，分别置于4、30、50、70 ℃中2 h、100 ℃煮沸30 min，然后均冷却到室温，以枯草杆菌作为指示菌检测抑菌活性，以30 ℃培养未水浴处理的发酵上清液作为对照。

2 结果和分析 2.1 东海岛细菌的分离纯化

将东海岛沉积物样品处理、稀释后涂布平板培养1-15 d，根据菌落形态、湿润度、是否凸起、是否产色素等特征，分离得到共25个不同的细菌菌落。

2.2 形态鉴定

如表 1所示，从东海岛沉积物中分离到菌体和菌落的形态特征丰富多样的细菌：菌落多较小；多呈白色，少数为黄色或米黄色，质地均匀，表面多光滑湿润，易挑起；菌体多为短杆状和短棒状，部分为球状和椭圆形；大部分为革兰氏阳性菌，少数为革兰氏阴性菌。

2.3 生理生化鉴定

如表 2所示，在酶触试验中，仅有4株细菌菌株具有过氧化氢酶活性。大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，以保护细菌不被伤害，而其他21株不具有过氧化氢酶活性的菌株，可能是其过氧化氢酶的合成过程被阻断；在枸橼酸盐试验中，5株菌株能以铵盐为唯一氮源，能利用枸橼酸盐，分解枸橼酸盐，因而在枸橼酸盐培养基上生长；在吲哚试验中，有17株菌株结果呈阳性，表明这些菌株含有色氨酸酶，能分解色氨酸为吲哚；在甲基红试验中，有20株菌株的甲基红试验呈阳性，表明所筛选的菌株大部分能产生丙酮酸，并转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性物质，使培养基pH < 4.5；在三糖铁试验中，11株菌株发酵葡萄糖，呈阳性，14株菌株能利用乳糖，呈阴性；在明胶试验中，有18株菌株结果呈阳性，表明这18株菌株具有明胶酶能将明胶水解为多肽、氨基酸，使明胶失去凝胶性质而液化；在淀粉水解试验中，9株菌株具有合成淀粉水解酶的能力，能将淀粉水解为麦芽糖或者葡萄糖，从而利用其分解物；在酪蛋白试验中，仅有2株菌株结果呈阳性，表明这2株菌株能分解酪蛋白为小分子进行利用，而所检测的其他16株菌株对酪蛋白的利用能力差；在脂肪酶试验中，有8株菌株结果呈阳性，表明这8株菌株含有脂肪酶，能分解脂肪并进行利用；所检测的24株菌株均没有褐藻酸降解酶，不能降解褐藻酸。所筛选的东海岛细菌大部分能分解利用明胶、葡萄糖或乳糖，部分能分解利用淀粉、脂肪，但不具有分解褐藻酸的能力。

2.4 菌株16S rRNA序列和系统发育学分析

将菌株16S rRNA基因序列测序结果与NCBI数据库内序列比对(表 3)，结果表明，筛选菌株与数据库中的模式菌株都具有一定的相似性，相似度在98%-100%，分属于9个属13种：芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、微球菌属(Micrococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、海单胞菌属(Oceanimonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和海杆菌属(Marinobacter)，表明东海岛沉积物有较为丰富的微生物资源。

各属细菌所占比例见图 1，其中芽孢杆菌属为优势属，有10株，占分离细菌总数的40%；嗜冷杆菌属、假交替单胞菌属、海单胞菌属、葡萄球菌属、海杆菌属种类最少，仅占分离细菌总数的4%。可以看出所有细菌共分成3个分类单元：变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)。放线菌门有1个属(微球菌属)，1个种；厚壁菌门有2个属(芽孢杆菌属和葡萄球菌属)，5个种；变形菌门共有6个属，7个种。

2.5 抑菌活性分析

由表 4可知，有3个菌株发酵液至少对一种指示菌表现出抑菌活性(图 2)。3株菌株(DHD-2、DHD-15、DHD-L)发酵产物具有抗大肠杆菌生长的活性，6株菌株(DHD-2、DHD-12、DHD-13、DHD-15、DHD-a、DHD-L)发酵产物具有抗枯草芽孢杆菌生长的活性，4株菌株(DHD-12、DHD-13、DHD-15、DHD-L)发酵产物具有抗金黄色葡萄球菌生长的活性。结果表明，通过抑菌活性测定筛选出6株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有拮抗作用的菌株，阳性率为24%，均为芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.6 功能基因PKSI检测分析

在25株细菌PKSI功能基因检测中，12株菌株DHD-2、DHD-8、DHD-10、DHD-12、DHD-13、DHD-15、DHD-20、DHD-a、DHD-e、DHD-i、DHD-L、DHD-n均可扩增出PKSI基因片段(图 3)。其中DHD-8、DHD-10、DHD-i、DHD-n的亮带相对较暗。

通过BLAST比对，DHD-2、DHD-12、DHD-13、DHD-L扩增得到PKSI核苷酸序列所对应的氨基酸序列与GenBank上的Bacillus subtilis标准菌株Polyketide synthase序列的相似性达到98%以上(表 5)。而DHD-15(Bacillus velezensis)、DHD-a(Bacillus tequilensis)与相似度最高的标准菌聚酮合酶序列对比，显示其相似性分别仅达86.44%、92.00%，推测其有可能含有新颖的I型PKS结构。

2.7 DHD-15、DHD-L菌株耐受实验

选取对3种指示菌都有抑菌活性的菌株DHD-15和DHD-L进行温度、盐和酸碱的耐受实验。

2.7.1 生长温度范围:

由表 6可知，DHD-15、DHD-L菌株在4 ℃均不生长，在15 ℃、30 ℃、40 ℃温度下都可以生长，但在50 ℃培养条件下菌株生长非常缓慢且生长量较少，基本处于不生长状态。

2.7.2 耐盐范围:

由图 4数据可知，DHD-15、DHD-L菌株在添加0%-10% NaCl浓度范围内均可生长。但随着NaCl浓度逐渐增大，DHD-15菌株生长呈现逐渐降低的趋势，DHD-L菌株生长明显下降；在NaCl浓度为10%时，两菌株均生长缓慢。

2.7.3 耐酸碱范围:

根据图 5可知，在pH 5时，DHD-15、DHD-L两菌株生长速度较快，其中DHD-L菌株生长速度明显高过DHD-15菌株。通过比较不同pH培养条件下菌株的生长情况，结果表明DHD-15和DHD-L菌株生长最适pH范围为5-6，且耐pH 3和pH 11的酸碱条件。

2.8 抑菌物质的稳定性实验

发酵上清液抑菌活性稳定性的研究有助于对抑菌化合物性质的了解，从而为后期研究提供基础依据。因此，研究抑菌活性稳定性是非常必要的。本实验选取菌株DHD-15作为代表菌用于实验研究。

2.8.1 热稳定性:

由图 6可知，DHD-15菌株抑菌物质具有较高的热稳定性。DHD-15菌株抑菌物质经过50 ℃处理2 h后，抑菌圈直径高达为5.0 mm，具有较高的抑菌活性；在100 ℃处理30 min后，抑菌活性明显降低，但依然有抑菌活性。

2.8.2 酸碱稳定性:

从图 7中可以看出，DHD-15菌株抑菌物质对酸敏感，耐碱，pH耐受范围为7-11。DHD-15菌株抑菌物质在pH 9条件下，抑菌活性效果较好；在pH 2-6条件下，无抑菌活性；在pH 11时，仍有抑菌活性。

3 结论和讨论

(1) 通过形态观察、生理生化及16S rRNA分子鉴定得到东海岛沉积物可培养细菌25株，其分属于9个属：不动杆菌属(Acinetobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、海洋单胞菌属(Oceanimonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、海杆菌属(Marinobacter)，其中芽孢杆菌属(Bacillus)为该环境优势可培养类群，这一结果与其他研究者对南海沉积物可培养细菌的结果一致^[21-24]。原因可能是由于芽孢杆菌属的细菌为好氧异养型，容易在营养较丰富的表层沉积物中繁殖而占据优势，同时表明该环境中有机质比较丰富。

此外，不同海域环境分离的海洋沉积物中细菌有不同的类群，不同海域生物样品中各优势细菌类群也会有所不相同。如张丽珉等^[25]从南极罗斯海的海洋沉积物样品分离细菌，嗜冷杆菌属(Psychrobacter)为优势类群。王桢^[26]从北极海洋沉积物中分离纯化细菌，以希瓦氏菌属细菌最多, 其次为假交替单胞菌属。姜钊^[27]从印度洋分离的细菌纯培养物中，除了芽孢杆菌属，还有红球菌属、微杆菌属、节细菌属、葡萄球菌属等9种菌属为优势类群。孙丽^[28]对从南大西洋沉积物分离可培养细菌，其中Marinobacter、Halomonas两个属是优势菌属。

(2) 在抑菌活性研究中，检测出6株芽孢杆菌属菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3种指示菌有不同程度的拮抗作用，均有抗枯草芽孢杆菌活性，其中菌株DHD-15和DHD-L有抗大肠埃希菌活性的作用。

即使是在同一片海域环境，不同的采样地点所筛选的海洋细菌的抗菌能力有所不同，但芽孢杆菌属(Bacillus)具有显著的抑菌活性。芽孢杆菌在海洋中广泛存在，从近海沉积物到深海沉积物，可能更易获得活性菌株。薛珊珊等^[29]从硇洲岛和徐闻筛选出抗枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性作用的优势菌株均为芽孢杆菌属，但无芽孢杆菌属抗大肠埃希菌活性。田良玉等^[30]从南海深海沉积物中筛选出具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活性物质的菌株，8株为芽孢杆菌属(Bacillus)，其中7株芽孢杆菌菌株对大肠杆菌有抑菌作用，4株芽孢杆菌菌株对金黄色葡萄球菌有抑菌活性。于清武^[22]从南海深海沉积物培养筛选出对4种指示菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌)均有抑制作用的细菌，其中芽孢杆菌属菌株就有8株。

(3) 在PKSI功能基因检测中，12株菌株检测出有该基因片段。通过BLAST比对，推测DHD-15(Bacillus velezensis)和DHD-a(Bacillus tequilensis)可能含有新颖的I型PKS结构。本文首次证明了东海岛沉积物细菌中存在PKSI基因，证明了东海岛细菌产生聚酮类化合物的潜力，为南海东海岛产生聚酮类化合物的微生物筛选以及聚酮类化合物的发酵制备奠定了基础。

(4) DHD-15、DHD-L菌株不仅具有高抑菌活性，在15-40 ℃均可正常生长，可耐受10% NaCl高盐以及pH 3和pH 11的酸碱条件，但不耐高温；菌株DHD-15抑菌物质可耐受4 ℃低温和100 ℃高温，对酸敏感，但可耐受pH 11的碱性条件，其稳定性较好。

中国南海东海岛独特的海洋环境蕴藏着丰富的微生物资源，而且目前的研究和开发程度较低，鲜有研究，因此对东海岛沿海区沉积物微生物资源的调查对今后具有重要的指导意义，同时开发微生物资源并挖掘出新型抗菌药或先导物有潜在的巨大价值。