罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)属专性异型发酵菌种，能发酵糖产生CO₂、乳酸、乙酸和乙醇。在人体和动物肠道、发酵食品中广泛存在。大量研究表明L. reuteri在人体及动物中具有多种益生特性，如可长期定殖于肠道中；调节宿主免疫系统；分泌广谱的抗菌化合物^[1]；预防腹泻和结肠炎^[2]；降低婴儿急性腹痛患病率等^[3]。因此，L. reuteri在功能性食品和医疗行业具有非常高的潜在应用价值。

L. reuteri已作为标准模型来描述脊椎动物肠道共生体生态及进化机制^[4]。因此脊椎动物肠道内L. reuteri的生长代谢及进化机制已被广泛研究。Oh等^[5]应用扩增片段长度多态性和多位点序列分析(MLSA)技术对分离自杂食动物(人，大鼠，小鼠，猪，鸡和火鸡)肠道或体内的L. reuteri进行了系统发育和群体遗传结构分析。结果显示不同宿主来源的L. reuteri基因特征不同，并且形成多个系统发育分支。Wegmann等^[6]应用比较基因组学对来源于猪体内的L. reuteri进行了系统发育及进化历程分析。结果表明其基因组具有宿主专一性，其中编码细胞表面蛋白的基因具有宿主特异性，这可能是导致形成两类系统发育分支的原因。Zheng等^[7]应用比较基因组学方法对4株面团分离株与12株分离自人类、猪、啮齿动物、家禽的L. reuteri探究其生境适应性机制。实验表明基于核心基因组和基因含量分别构建的系统发育树拓扑结构不同，此外约有10%的核心基因处于正向选择压力下，主要与能量转换与碳水化合物代谢有关。

同种菌的比较基因组学研究可以更深入地了解基因的改变、缺失或获得，这些变化会促使菌株在不同生态位中进化及增强环境适应性^[8]。目前为止，可在数据库中获得120多株L. reuteri (人类，猪，鸡，大鼠，小鼠，面团和食草动物)的全基因组信息，但分离自发酵食品L. reuteri全基因组信息甚少。故本文通过比较基因组学与高通量测序结合，将分离自内蒙古地区发酵食品中11株L. reuteri与NCBI上23株食草动物来源L. reuteri进行比较，研究其基因多样性及生境适应性，从基因层面揭示L. reuteri在肠内生境及肠外生境适应能力机制，为L. reuteri优良菌株的开发提供理论基础。

1 材料和方法 1.1 菌株选取

本研究依托内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库(LABCC)中分离自内蒙古自治区传统酸马奶及酸粥的11株L. reuteri，并从NCBI网站GenBank数据库中获取16株源于食草动物^[9] (5株山羊、4株绵羊、4株牛、3株马肠道分离株)、7株酸面团的L. reuteri全基因组信息。

1.2 菌株活化及基因组DNA提取

将真空冷冻干燥保藏的11株L. reuteri在脱脂乳中37 ℃培养24 h活化后，在MRS液体培养基(CM0359B，OXOID)中继代培养。离心收集菌体后采用TIANGEN细菌基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，操作步骤参考试剂盒说明书。

1.3 DNA质控及基因组重测序

完成基因组DNA抽提后，采用微量分光光度计测定DNA液的浓度，质量合格送交上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因测序。确定为目标菌株后进行全基因组重测序。测序平台为Illumina HiSeq 2000平台，选取150 bp的DNA片段构建Pair-end测序文库，高质量数据平均覆盖度在500X左右。

1.4 基因组拼接组装

获取的原始数据首先进行质量评估，过滤后运用软件包SOAPdenovo v1.06对高质量的reads进行拼接，并选取合适的kmer值对过滤后的数据进行拼接组装和单碱基校正^[10]。以基因组大小、Scaffold数量、N50长度、N90长度、GC含量值为指标对组装结果进行评估。

1.5 基因注释

将34株菌株蛋白序列与COG^[11] (Clusters of orthologous groups，直系同源基因簇数据库)进行BLASTp (E-value < 1e–10，identity值≥40%)比对，完成蛋白序列功能注释。

1.6 泛-核心基因集及系统发育分析

首先将34株L. reuteri的基因序列用Prokka v1.12软件^[12]进行基因注释，获得GFF格式文件(用于计算核心基因组和泛基因组)。使用Roary软件^[13]计算核心基因组和泛基因组数量。除此之外，基于核心基因利用MEGA7软件构建邻接树(Neighbor-joining tree，NJ)。参数Bootstrap值设为1000。使用Venny 2.1软件绘制了韦恩图，展现宿主特异性基因。使用KEGG数据库进行特殊基因所参与的代谢通路注释^[14]。

1.7 碳水化合物活性酶分析

下载并安装hmmer软件包^[15]以及下载CAZyme (Carbohydrate-Active Enzymes)数据库；对基因组序列进行碳水化合物活性酶的注释；最后，根据结果在网页上(http://www.cazy.org/)查询详细的碳水化合物活性酶家族信息。

1.8 数据统计分析

用t检验比较两两菌株之间的基因组大小和编码基因数量差异。采用Mann whitney检验不同来源菌株功能基因差异。

2 结果和分析 2.1 11株发酵食品L. reuteri基因组特征

通过Illumina HiSeq高通量测序平台获得了11株来源于酸马奶和酸粥的L. reuteri全基因组信息，其基因组大小为1.90–2.95 Mb，平均为2.14 Mb；GC含量大小为38.69%–38.82%，平均含量为38.77% (表 1)。

2.2 泛基因组、核心基因组及宿主特异性基因分析

应用比较基因组学对34株不同分离源的L. reuteri进行了泛基因组和核心基因组注释。泛基因组共包含7242个基因家族，核心基因组包含969个基因家族。除此之外，34株L. reuteri共包含4430个附属基因(图 1-B)，此类基因为泛基因集中去掉核心及稀有基因(存在频率小于0.05的基因)后的基因，可显示菌株基因组之间的特异性。可从图 1-A看出34株L. reuteri附属基因的存在与缺失。为了解969个核心基因所涉及的功能，进行了COG功能基因注释。结果显示约37.04%的基因编码与代谢有关的蛋白质，除了未知功能的基因，34株L. reuteri核心基因组主要与翻译、核糖体结构和生物发生(J)(11.07%)、氨基酸转运和代谢(E)(10.36%)、复制、重组和修复(L)(7.10%)、碳水化合物转运和代谢(G)(6.42%)等相关功能有关(图 2)。

依据来源将34株L. reuteri分为食草动物、酸马奶、酸粥和酸面团4组，并基于4类菌株的核心基因绘制了Venn图(图 3)。结果显示酸马奶、酸粥、酸面团和食草动物分离株分别有459、450、253、404个特异性基因。经KEGG数据库注释后发现酸马奶分离株459个特异基因主要参与丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、脂肪酸降解、精氨酸生物合成等代谢通路。酸粥分离株450个特异基因主要参与群体感应、泛酸盐和辅酶A生物合成、双组分系统等代谢通路有关。酸面团分离株253个特异基因主要参与精氨酸生物合成、蛋白运输等代谢通路有关。食草动物分离株404个特异性基因主要参与卟啉和叶绿素代谢、叶酸生物合成、阿特拉津降解、氮代谢等代谢通路有关。这些结果表明不同来源的L. reuteri基因功能较为广泛且具有宿主特异性。

2.3 系统发育分析及不同分支特异基因比较

为了确定34株L. reuteri的系统发育关系，根据核心基因组构建了系统发育树(图 4-A)。结果表明食草动物分离株更靠近根部，可能是其他分离株的祖先，且相同来源的菌株距离较近。这些结果表明自然环境不同导致形成不同的系统发育分支。

为了找出各分支的特异基因，按系统发育关系分为a、b、c、d四组，其中，a分支包含7株酸马奶分离株和4株酸粥分离株；b、c分支分别包含3株面团分离株；d分支包含13株食草动物分离株。对其进行两两之间宿主特异基因的比较。基于核心基因组构建了Venn图(图 4-B)，从图中可知a、b、c、d分别有288、265、350、531个特异基因，共有基因为653个，表明各分支间基因种类差异较大。其中a分支中主要与半乳糖代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢等代谢途径有关。b分支主要与丙酮酸代谢、abc转运蛋白等代谢途径有关。c分支主要与酵母自噬、群体感应、糖酵解/糖异生、α-亚麻酸代谢等途径有关。d分支主要参与卟啉和叶绿素代谢、阿特拉津降解、新生霉素代谢、色氨酸代谢等途径。各来源菌株的代谢途径均能体现各宿主所处环境特征。

2.4 不同分支编码营养代谢物质基因的比较

2.4.1 编码碳水化合物相关基因:

通过对a、b、c、d分支中碳水化合物比较发现，a分支(酸马奶、酸粥)中糖酵解/糖异生途径[15(参与酶的数量)]、磷酸戊糖途径(14)、半乳糖代谢途径(10)、淀粉和蔗糖代谢途径(7)、TCA循环(6)中基因所编码的酶数量最多(图 5)。

L. reuteri属于专性异型发酵菌，能发酵糖产生CO₂、乳酸、乙酸和乙醇。在糖酵解/糖异生途径中，a分支编码相关酶的基因数量最多为15个，b、c、d分支分别有3个、5个、6个，但a分支菌株糖酵解/糖异生途径并不完整，缺少磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)。糖酵解的产物丙酮酸，可被乳酸脱氢酶还原成乳酸。a分支有2个编码D-乳酸脱氢酶(1dhD-1和1dhD-7)，因此能产生D型乳酸。除了乳酸脱氢酶外，还具有2个编码丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.4.1) (pdhA_1和pdhB_1)基因，可催化丙酮酸转化生成乙酰CoA，用于之后的三羧酸循环及磷酸戊糖代谢途径。b分支中有2个编码D-乳酸脱氢酶基因(group_338和ldhA)；c、d分支中各有一个分别为group_337和group_3714。以上结果表明不同生存环境导致菌株利用糖类物质的不同。

编码蛋白质和氨基酸相关基因：a分支共有12类与氨基酸合成代谢相关途径，参与酶类的数量达66个。主要有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，赖氨酸生物合成，谷胱甘肽代谢等。b分支共有4类7个与氨基酸合成代谢途径相关基因：丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。c分支共有6类11个与氨基酸合成代谢途径相关基因，主要为赖氨酸生物合成、酪氨酸代谢、缬氨酸等；d分支共有7类20个与氨基酸合成代谢途径相关基因：组氨酸代谢，赖氨酸生物合成，酪氨酸代谢等。结果显示酸马奶、酸粥分离株氨基酸代谢通路数量与种类最多，表明该分离源菌株具有较强利用氨基酸的能力，可能与其处于丰富营养物质的环境有关。

2.4.2 其他代谢途径:

除上述代谢途径外，34株L. reuteri基因组中还具有编码丁酸代谢途径相关的酶，其中a分支相关酶数量最多，这可能表明酸马奶及酸粥中L. reuteri具有潜在代谢丁酸的能力。另外，仅在a分支中发现了二甲苯降解、二恶英降解、萘降解、氯代烷烃和氯烯烃降解相关途径的酶。在抗生素耐药性方面，仅在a、d分支中出现了β-内酰胺抗性基因和万古霉素耐药性基因。

2.4.3 碳水化合物活性酶分析:

为在基因组水平上了解不同来源L. reuteri对碳水化合物的利用能力，本研究通过碳水化合物活性酶数据库(CAZy)分析了34株L. reuteri的碳水化合物活性酶功能基因。34株L. reuteri共注释到五大类碳水化合物活性酶的51个小类基因家族，主要以GHs和GTs酶类的含量最为丰富(图 6)。其中有20个GH家族(20/152)，GH3和GH43只出现在酸马奶、酸粥和食草动物分离株中，GH42、GH65、GH68在酸马奶、酸粥分离株中较多，GH23、GH25、GH66、GH73、GH109在食草动物分离株中较多。仅在酸马奶、酸粥和食草动物分离株中出现的为GH3、GH43。酸面团分离株中GH家族数量及种类都不及另两类分离株多。

GT家族中共有9个家族(9/105)，GT8、GT28在酸马奶、酸粥分离株中数量较多；GT8在酸面团分离株中较多；GT2、GT4、GT19、GT51在食草动物组中较多。GT2和GT4酶类(与蔗糖等二糖以及脂多糖、纤维素、壳聚糖的合成相关)在34株L. reuteri中含量较丰富，可能与菌株所处环境有关，并且表明具有较强的糖合成能力。

CE家族中共有9个家族(9/16)，比较后发现CE9和CE13是酸马奶、酸粥分离株中特有的；食草动物分离株中CE10数量较多。CBM家族中注释到11个家族(11/83)，其中CBM27、CBM32、CBM47是酸马奶、酸粥分离株所独有的，而CBM50在食草动物分离株中最多，平均数量为21个，且CBM5、CBM22只出现在食草动物组中；CBM16和CBM37只在酸马奶、酸粥和食草动物分离株中存在。AA家族共有2个家族(2/14)，AA3是酸马奶、酸粥分离株所特有的。以上结果显示了不同来源的L. reuteri碳水化合物活性酶种类多样且具有宿主特异性。

3 讨论

本文研究了4种来源共34株L. reuteri的基因特征及生境适应性。比较了来源于酸马奶、酸粥、酸面团和食草动物L. reuteri的基因组特征，泛基因集和核心基因集分别包含7242、969个基因家族，且各类宿主特异性基因种类及数量差异较大，主要编码与蛋白质代谢(37.04%)相关蛋白，表明这些基因在基因组中处于不可或缺的位置，在菌株生长和繁殖过程中发挥重要作用。基因组大小、G+C含量表明不同来源的L. reuteri具有广泛的基因多样性。11株酸马奶、酸粥分离株的G+C含量比酸面团和食草动物分离株略有偏高，这可能与自然选择、变异、生活方式及所处环境等众多因素有关^[16]。34株L. reuteri系统发育关系表明相同分离源具有较近的亲缘关系，表明不同生存环境对L. reuteri的进化发挥重要的作用。故本文初步推断基因多样性可能与生存环境有关。

功能注释方面发现在酸马奶、酸粥分离株中具有较多与半乳糖代谢相关基因，这可能因为马乳中的乳糖含量高于牛乳、牦牛乳、羊乳，且具有较多种类的氨基酸合成代谢途径，说明这些菌株处于营养丰富的环境并没有使其丧失一些物质的合成能力。此外，b、c分支均为面团分离株，面团中蛋白质主要为麦醇溶蛋白和麦谷蛋白，其中麦醇溶蛋白主要由非极性氨基酸组成，在b、c分支中具有相关基因。d分支为食草动物分离株，其特异性基因为与卟啉、叶绿素代谢及氨基酸生物合成相关基因。叶绿素是绿色植物中的主要物质，研究发现光合细菌有叶绿素合成代谢基因^[17]，但在乳酸菌中还未曾报道。因为食草动物主要摄入树叶、草和其他植物，只能利用非蛋白氮合成氨基酸、肽和蛋白质^[18]，因此为了满足食草动物的营养需求，L. reuteri可能参与食草动物肠道内氨基酸的生物合成。在抗生素耐药性方面，a、d分支中出现了β-内酰胺抗性基因和万古霉素耐药性基因。这些特殊基因可能是由于宿主肠道抗生素耐药性菌群基因的水平转移导致的。抗生素滥用导致了不同环境的严重污染，对微生物产生了越来越大的选择性压力，从而导致抗生素耐药性增强^[19]。这些结果也反映出不同宿主L. reuteri的功能基因在各自宿主中的生存方式。

碳水化合物是生命细胞结构的主要成分及主要供能物质，并且有调节细胞活动的重要功能。本文经比较了酸马奶、酸粥、酸面团和食草动物分离株碳水化合物活性酶相关基因，结果表明34株L. reuteri共注释到51个碳水化合物活性酶家族，其中共有20个GH家族，9个GT家族，9个CE家族，9个CBM家族，2个AA家族，具有较为广泛的多样性。Sun等^[20]基于213株乳杆菌模式菌株的比较基因组学研究表明目前已发现的所有乳杆菌基因组中，共编码48个糖苷水解酶，本研究中仅L. reuteri一个物种就具有其中的20种，足以说明L. reuteri的糖苷水解酶含量之丰富。GH3和GH43只出现在酸马奶、酸粥和食草动物分离株中。GH3编码β-葡萄糖苷酶；木聚糖酶1, 4-β-木糖糖苷酶等，其广泛分布于细菌、真菌和植物中，具有纤维素生物量降解、能量代谢和病原体防御等多种功能^[21]。GH43主要编码β-木糖酶、α-l-阿拉伯呋喃基葡糖苷酶、木聚糖酶等，木聚糖是半纤维素的组成成分，广泛分布于高等植物细胞壁中；GH25、GH73 (主要编码溶菌酶类，有抗菌、消炎、抗病毒等作用)在食草动物分离株中数量较多的原因可能为食草动物长期与外界环境接触导致致病菌增多，此类菌株为抵抗病原菌入侵而作出的进化选择；GH42、GH65、GH68在酸马奶、酸粥分离株中较多，其中GH42主要编码低聚半乳糖和乳糖酶类，作用底物主要为乳糖和乳果糖，可用于降低UHT奶中乳糖含量^[22]；GH68编码果聚糖蔗糖酶、β-呋喃果糖苷酶、菊粉蔗糖酶，以蔗糖或果糖为底物产生菊糖或低聚果糖^[23]，具有多种有益功能如甜味取代剂、低卡路里、增加对致病菌的抵抗力等。GH66只存在于食草动物组中，主要编码右旋糖酶，是细菌和真菌中主要酶类，是从植物中分离出来的^[24]，食草动物的长期植物饮食可能导致了肠道中L. reuteri菌株的特异性。AA3仅在发酵食品分离株中存在，其主要为氧化还原酶类，细菌在氧气环境中生长，细胞内会产生部分还原的活性氧包括过氧化氢、超氧自由基和羟基^[25]。这些活性氧会引起DNA、脂类和蛋白质的氧化，对细胞造成致命的损伤，表明发酵食品分离株抗氧化能力较强。Su等^[26]研究表明发酵食品中乳酸菌最初来源于肠道，而GH3、GH43、CBM16、CBM37是发酵食品和食草动物肠道分离株所共有的，说明这类来源的L. reuteri在适应肠外环境时仍然保留了部分肠道环境的特征；AA3和GH66分别是发酵食品和食草动物所特有的，这也说明菌株在适应过程中可能水平获得了某些适应性基因以此来更好地适应环境。

综上，这些结果表明不同来源L. reuteri具有广泛的基因多样性，且与其生存环境密切相关，可利用发酵食品作为模型来研究更为复杂的肠道环境。未来，随着在其他环境中L. reuteri菌株的分离，还可以比较更多不同环境中L. reuteri与其他宿主菌株的基因组差异，这将有力地说明影响其基因多样性及生境适应性的因素，为L. reuteri优良菌株的开发提供理论基础。