2016年新疆阿克苏市和温宿县的枣园中出现一种新的枣树病害，发病的枣树植株叶有黄斑、卷曲、皱缩，枝条呈黄绿色、弯曲，结果少、果实畸形皱缩、皱缩处不着色。发病的枣果口感差，甜度下降，失去了商业价值。2016年只在阿克苏市郊和温宿县的果园中零星发现感病枣树；而到了2017年，上述两地发病规模进一步扩大的同时，在阿克苏地区的新和县、库车县也发现了感病的枣树；在2018年，除阿克苏地区之外，病害还扩散到了相邻的和田地区、喀什地区。在阿克苏地区，发病面积已占枣园总面积的10%以上，其中发病严重的地块病害率高达100%，枣果完全绝收。此外，不同品种的枣树，如骏枣、灰枣等，均有发病现象，且发病状况无差异。目前，新疆枣树种植面积高达670余万亩，红枣产业现已成为新疆区域经济发展的主要支柱产业之一。从被发现至今，该病害显露出快速传播的特征，已经对新疆的红枣产业安全构成了严重威胁。

我们在发病的枣树植株内鉴定到一种新的欧洲山梣环斑病毒属(Emaravirus)病毒，鉴定其为可能的病原体，并将其命名为中国枣树花叶伴随病毒(CDMaV)。Emaravirus为2012年以来发现的一个新的植物病毒属，生物学分类为Negarnaviricota门，Polyploviricotina亚门，Ellioviricetes纲，Bunyavirales目，Fimoviridae科。该属病毒呈球形，外有糖蛋白包膜，基因组通常含有4-8条负义单链RNA，以该属病毒的命名种European mountain ash ringspot-associated virus为例：该病毒含有4条负义单链RNA，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRp)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)、包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein，GP)和运动蛋白^[1-2]。本论文通过对CDMaV的全基因组测序，证明其为Emaravirus属新成员；在枣树寄生虫枣瘿螨体内检测到了CDMaV基因组，符合该属病毒由瘿螨科传播的特征^[3-6]。

1 材料和方法 1.1 枣树样品的取材与保存

枣树(Ziziphus jujuba)叶片和枣果于2017年9月和2018年9月取自阿克苏市郊果园，剪下整个枝条后用湿纸巾包住切口运输。材料在-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.2 小RNA测序与RNAseq

小RNA测序在百迈克生物科技有限公司完成，样品为发病枣树的叶片，表面消毒除菌后提取植物总RNA。测序平台为Illumina HiSeq 4000高通量测序仪，测序读长为单端50 nt。将原始数据保留长度为18-35 nt的序列，去除接头和长度异常的序列，通过velvet软件^[7]和PFOR2^[8]将短序列拼接成较长的contigs，使用BLAST算法在GenBank Virus RefSeq等数据库中比对，从而注释序列信息。RNAseq在华大基因进行，样品为发病枣树的叶片，经表面消毒和除菌提取总RNA。测序平台为Illumina HiSeq2000高通量测序仪，读长为200 nt。去除rRNA构建特异性文库，原始数据去除低质量序列后，使用Tophat和Cufflinks软件构建转录本，使用BLAST进行比对。最后将注释为新病毒的序列拼接，获取全基因组信息。

1.3 引物设计

参照小RNA测序和RNAseq的结果，设计引物扩增CDMaV，其中扩增基因组时RNA2-RNA5采取全长扩增的方法，RNA1采取分段扩增，引物设计主要依据扩增片段的长度。所用引物见表 1。

1.4 植物总RNA的提取

取0.5 g枣树叶片或果肉，液氮充分研磨后转移至1.5 mL离心管中，加入600 μL PureLink Plant RNA Reagent (Cat#12322012，Invitrogen，USA)，轻微振荡后室温放置5 min对细胞进行裂解；离心(12000 r/min，2 min)去除沉淀，在上清中依次加100 μL 5 mol/L NaCl和300 μL氯仿，离心去除蛋白杂质，取上层清液并加入等体积异丙醇沉淀核酸，于4 ℃、12000 r/mim离心10 min收集沉淀，用1 mL 75%乙醇洗涤后，将沉淀风干，溶于无RNase污染的ddH₂O并贮存于-80 ℃备用。

1.5 反转录PCR (RT-PCR)与PCR

提取发病植株叶片的总RNA，通过SuperScript Ⅲ反转录酶(Cat#18080044，Invitrogen，USA)及其反应体系，按照该反转录酶的操作说明进行反转录，获得包括病毒基因组RNA在内的cDNA产物，然后通过PCR对目的病毒片段进行扩增、测序及拼接。其中病毒基因组的cDNA合成所用引物包括随机引物或病毒基因组RNA末端特异性引物RT1和RT2的等比例混合。PCR通过KOD Plus (Cat#KOD-201，TOYOBO，Japan)及其反应体系进行，所用引物见表 1，退火温度按照不同引物进行设定，延伸时间由扩增序列的长度决定，每1 kb延伸1 min。

1.6 抗体制备

将CDMaV RNA2编码的GP蛋白片段进行原核表达并纯化重组蛋白产生特异性抗体。表达载体为pET-30a(+)，宿主菌为BL-21菌株。通过双引物GP2FBamI/GP2RECORI从病叶总cDNA中扩增相应的GP基因片段，克隆至pET-30a(+)，转化DH5α感受态细胞，对阳性克隆通过T7通用引物进行测序验证，将测序正确的重组质粒转化BL-21表达菌株。

将携带GP基因表达质粒的BL-21培养至OD₆₀₀=0.5，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG于16 ℃、160 r/min过夜诱导，通过SDS-PAGE分别检测GP蛋白在菌体可溶或不可溶蛋白组分中的含量。由于该蛋白被证明主要存在于包涵体中，将诱导表达后的细胞裂解并弃去上清，将沉淀溶解在8 mol/L尿素中(含0.1 mmol/L PMSF、0.1 mol/L NaH₂PO₄、0.01 mol/L Tris-HCl)，通过变性法进行亲和纯化，纯化的蛋白通过凝胶电泳检测纯度，目的蛋白的含量超过总蛋白的95%，将纯化的GP蛋白免疫家兔获得抗血清(中国科学院遗传与发育学研究所实验动物中心)。

1.7 Western杂交

取5 g叶片或枣果，液氮充分研磨后加入5 mL 0.02 mmol/L Na₂SO₄，离心去除杂质，将800 μL上清转移至1.5 mL离心管，加入200 μL 5× SDS-loading，蛋白煮沸变性，通过SDS-PAGE凝胶(10%)分离蛋白，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。将PVDF膜于封闭液[TBST(Tris-buffered saline-Tween)+5%脱脂奶粉]中对非特异性蛋白进行封闭；室温1 h后，去除封闭液，加入1:2000稀释于封闭液的抗GP蛋白的兔血清(一抗)，室温反应1 h；去除一抗，使用TBST清洗3遍，加入1:10000溶于封闭液的羊抗兔抗血清，室温孵育1 h；TBST洗3遍后通过增强化学发光法(ECL)进行显色。

1.8 媒介昆虫的收集和RNA提取

使用小毛刷轻扫新鲜枣树叶片的正反面，在体视显微镜下可以看到被扫下的枣瘿螨(Epitrimerus zizyphagus Keifer)和枣蓟马(Frankliniella intonsa)。枣瘿螨体长约0.10-0.15 mm，梭型，全身呈乳白色，可缓慢爬行；枣蓟马约0.8-1.5 mm，细长，若虫淡黄色，成虫黄褐色，两对翅。用针头挑起小虫置入细胞裂解液中进行RNA的提取。提取每个RNA样本，所用枣瘿螨和枣蓟马的数量分别为300只和40只。

2 结果和分析 2.1 枣树病症

发病植株采集自新疆阿克苏市阿依库勒镇5大队4村枣树果园，该村周边既有成片发病的骏枣和灰枣果园，也有无枣树发病的骏枣和灰枣果园。田间健康枝条呈自然弯曲、浅绿色，叶片较饱满、深绿色，上表面一致朝上(图 1-A)；发病早期的枝条弯曲程度与健康枝条无明显可见差异、颜色泛黄，叶片轻微内卷、叶脉开始呈现浅黄色，有些叶片下表面翻转朝上(图 1-B)；发病晚期的枝条重度弯曲、颜色更近黄色，叶片严重卷曲皱缩、有马赛克样黄斑，上下表面的朝向混乱无规则(图 1-C)。病发无品种差异，新疆常见的骏枣、酸枣等均感病。病害对于枣果的大小和总体形态没有明显的影响，但是发病的枣果区域性畸形、皱缩，总体着色不充分，皱缩处完全不着色(图 1-D和E)。

2.2 枣树病叶的小RNA测序揭示了Emaravirus属新病毒

首先通过小RNA测序对该枣树病害的病原体进行鉴定^[9-10]，结果发现多条Raspberry leaf blotch virus (RLBV)的同源序列(表 2)：包括与RdRp同源的序列53条，与包膜糖蛋白、核衣壳蛋白、P4蛋白同源的序列12或13条，与P8a同源的1条。目前Emaravirus属病毒在枣树中尚未见报道，该病毒是一种新发枣树病毒。由于该病毒在枣树上鉴定，我们将其命名为中国枣树花叶伴随病毒，简称为CDMaV。

2.3 通过RNAseq对CDMaV全基因组测序

通过RNAseq对该枣树病毒的全基因组序列进行测定和拼接(图 2)。CDMaV基因组共含有5条RNA，其中RNA1全长7160 nt，编码271 kDa的RdRp，其核酸序列与RLBV的RNA1同源性为83%；RNA2-RNA5全长分别为2224、1230、1493、971 nt，与RLBV相应基因组RNA的核酸序列同源性分别为65%、54%、69%和22%^{[6, 11]}，依次编码75.9 kDa的包膜糖蛋白、33.1 kDa的核衣壳蛋白以及两个大小分别为42.5 kDa和33 kDa的未知功能蛋白。CDMaV与RLBV具有最高的序列同源性，但基因组比RLBV少3条RNA。CDMaV的所有5条RNA在首尾两端含有约15个核苷酸的反向互补区域，与Emaravirus属的其他成员的特征吻合^{[1, 6]}。

2.4 RT-PCR检测CDMaV

为了确保高通量测序的准确性，使用RT-PCR的方法将病毒基因组克隆测序。为确保病毒cDNA的完整性，我们尝试了多种反转录酶和引物的组合，最终确定了两种反转录方案：除Superscript RT Ⅲ反转录酶和随机引物的组合之外，我们设计了Superscript RT Ⅲ和RT1、RT2引物的等比混合反转录体系。如表 3所示，CDMaV的5条RNA在首尾两端均有约15个核苷酸的反向互补区段，但5条RNA的反向互补区段不完全相同，主要区别在于第8和第9位核苷酸，RNA1、3、4的第8、9位核苷酸是AA，而RNA2、5的第8、9位核苷酸是TT。RT1和RT2的设计正是基于CDMaV的这种特征，其中RT1的第8、9位核苷酸选择了TT，RT2选择了AA，当两条引物等比混合时，进行的反转录可以获得完整的病毒cDNA。这两种方案反转录获得的病毒全基因组信息，通过各基因组RNA的特异性引物进行全长扩增，或分段扩增并拼接全长，扩增引物见表 1。其中RNA2-RNA5均可以通过首末端引物获得全长，而RNA1由于序列太长，采用分段扩增的方式，分五段扩增并对序列进行拼接后获得全长。

2.5 在发病植株中检测CDMaV的病毒蛋白

为了进一步在发病植株中确证CDMaV，我们设计合成了该病毒的GP蛋白的抗体，Western杂交发现CDMaV的GP蛋白在不同时期发病的枣树叶片和果实中均能检测到，而在健康枣树中则检测不到(图 3)。该结果进一步验证了CDMaV与发病枣树的相关性。

2.6 CDMaV可能通过枣瘿螨在枣树之间传播

由于Emaravirus属多种病毒以瘿螨(Eriophyid mites)为媒介进行传播，我们从枣园中收集枣瘿螨和枣蓟马，通过RT-PCR检测虫体内是否携带CDMaV。以发病枣树的总RNA作为阳性对照，我们对RNA1-RNA3三条RNA的部分片段进行扩增(引物序列见表 1)。结果发现，3个CDMaV特异性RNA片段均能从枣瘿螨中检测到，而在枣蓟马中检测不到(图 4)，表明枣瘿螨可能是CDMaV潜在的传播介体。

3 讨论

本研究中我们鉴定了新疆阿克苏地区新发枣树病害的病原体，命名为中国枣树花叶伴随病毒CDMaV，完成CDMaV的全基因组测序，并鉴定枣瘿螨为CDMaV可能的传播媒介。

Emaravirus属成员的基因组通常由多条RNA组成，CDMaV基因组符合该基因组特征，由5条单链RNA组成。除RNA1与其他Emaravirus属病毒相应序列高度保守之外，其余4条RNA与近亲种RLBV的核酸序列同源性为22%-69%，表明这是一种新的Emaravirus属病毒。根据2018年ICTV第10次报告，Emaravirus属病毒已有9个正式种^[12-14]，CDMaV为该属的第10个正式种。

我们通过多种实验对Emaravirus属病毒CDMaV与新疆新发枣树病害之间的关联性进行证明，包括通过小RNA测序证明发病枣树中存在一种新发Emaravirus属病毒；通过全基因组测序在发病枣树中获得了CDMaV全序列；通过Western杂交证明CDMaV的蛋白选择性地存在于发病的枣树中。未来还需要将病毒接种到健康的枣树植株，并获得相应的病害表型，来确定CDMaV是否该枣树病害的病原体。本研究鉴定枣瘿螨为可能的传播介体，除了为病害防治提供灭虫指导之外，还将为病毒侵染健康的枣树植株提供有效的接种手段。

我们考察枣园时注意到，尽管该病害扩散能力很强、速度很快，仍会在发病严重的地块附近看到完全不感病的地块，两块枣园相隔约1 km，气候环境完全相同，差别在于，未感病的枣园合理密植，且始终在专家指导下定期喷洒杀虫剂和除草剂。该现象一方面表明现有的种植和灭虫手段可以暂时阻止该病害扩散，另一方面也表明了合理种植和有效灭虫在防控该病害中的重要作用。从根本上防控该病害的发生和发展，则需要建立在明确的病毒生活史、病毒传播路径和侵染机制的基础上。