甲霜灵[N-(2, 6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯]是一种重要的乙酰苯胺类杀菌剂，它对病原真菌中的卵菌纲(Oomycetes)病菌有特殊的杀灭能力。对由卵菌引起的霜霉病、疫霉病、白锈病等均有很好的防治作用^[1]。甲霜灵含有一个手性C原子，有两个对映体，其抗真菌活性主要来源于R-对映体^[2]。R-和S-对映体具有相同的作用方式，但它们在达到受体或与受体结合方面表现出相当大的差异。生物体外试验显示R-对映体的活性大约是S-对映体的1000倍，在体内R-对映体仍然是S-对映体的3–10倍^[3]。目前市售的甲霜灵产品有普通甲霜灵(外消旋体)和精甲霜灵(R体为主)两种。光学纯产品取代外消旋产品不仅可以提高单位药效，而且减少了非活性异构体对非靶标生物以及土壤的潜在副作用，因此预料未来精甲霜灵将逐渐取代普通甲霜灵成为市场的主流产品。

现阶段精甲霜灵(R-甲霜灵为主)生产方法主要是以手性原料作前体的化学合成法^[4]。利用生物催化剂进行生物拆分生产R-甲霜灵已有一些报道，采用的生物催化剂主要是脂肪酶^[5-11]或含有脂肪酶的微生物细胞^[12]，但它们拆分的底物都是生产普通甲霜灵的中间体R, S-N-(2, 6-二甲基苯基)丙氨酸甲酯(R, S-MAP)，而R-MAP还需一步反应才能生成R-甲霜灵，这步反应会降低精甲霜灵产品的手性纯度。本文作者近期报道了一株直接水解拆分R, S-甲霜灵生产R-甲霜灵的菌株Albibacters sp. zjut528^[13]，它的手性选择性极高。利用该菌株细胞作催化剂直接拆分R, S-甲霜灵，可以生产手性纯度极高的精甲霜灵产品。同时，通过盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析从Albibacters sp. zjut528菌株的胞内液中得到了纯化的目标酯酶蛋白，并测得N端的10个氨基酸序列为NH₂-Ala-Ala -Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。

本研究将从菌株Albibacters sp. zjut528的基因组中找出目标酯酶的基因序列，然后将该基因在大肠杆菌中进行克隆表达，研究重组酶的性质和酶基因的蛋白进化关系。

1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 试剂:

普通甲霜灵(R, S-甲霜灵)由某厂赠送，其他化学试剂均为国药分析纯。限制性内切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ、DNA Marker DL5000、DNA Marker DL10000购于TaKaRa公司；基因组抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA少量抽提试剂盒购于Axyprep公司。

1.1.2 培养基:

种子培养基和发酵摇瓶培养基，参见文献[13]。

1.2 甲霜灵的分析方法

采用高效液相色谱(HPLC)^[13]。

1.3 酯酶基因的扩增和重组菌的构建

以Albibacters sp. zjut528的基因组DNA为模板，扩增脂酶基因的引物为：RMest-F (5′-CGGGA TCCACGCCGATAGAGGGTCAAAG-3′，BamH Ⅰ)和RMest-R (5′-CCGCTCGAGCGTTTATAGCCTG CCAC-3′，Xho Ⅰ)。PCR扩增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；65 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增的条带和pET-28a(+)用限制性内切酶进行酶切，并用T4连接酶连接，转化E. coli BL21Gold(DE3)，构建的重组菌命名为RMest- pET-28a(+)-E. coli BL21 Gold(DE3)。挑单菌落，提取质粒，进行质粒PCR验证和DNA序列测序。

1.4 酯酶基因RMest的表达和SDS-PAGE分析

将重组菌在含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37 ℃培养至菌液OD₆₀₀约为0.5–0.8，分别标记为诱导组和非诱导组。在空载体(宿主菌中)组和诱导组中添加IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，25 ℃、180 r/min诱导培养10 h。未诱导组和诱导组菌液，4 ℃、8000 r/min离心10 min后弃上清液，细胞悬浮于100 mmol/L的pH 8.0 Tris-HCl缓冲液中，4 ℃下高压匀浆破碎，12000 r/min离心20 min取上清液(粗酶液)，进行SDS-PAGE分析。

1.5 重组蛋白的纯化

使用10倍体积的缓冲液(50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L imidazole)与Ni²⁺亲和层析介质平衡，取适当粗酶液与亲和层析介质结合30 min，用2倍体积的清洗缓冲液(50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，50 mmol/L imidazole)清洗3次，再用2倍体积的洗脱缓冲液(50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 8.0，0.3 mol/L NaCl，200 mmol/L imidazole)洗脱，重复3次。收集洗脱样品，进行SDS-PAGE分析。将含目的蛋白的样品用透析缓冲液(25 mmol/L磷酸缓冲液，pH 8.0，0.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole) 4 ℃过夜透析除去咪唑后，贮存在–20 ℃。

1.6 重组酶RMesterase的酶学性质

1.6.1 酶的立体选择性:

取2 mL重组菌胞内粗酶液，0.2 g R, S-甲霜灵为底物，一定量的磷酸缓冲液(100 mmol/L，pH 8.0)，总反应体系为20 mL，37 ℃、180 r/min摇床中反应10、30 min和2、6、12 h，取样分析底物消耗和产物生成。

1.6.2 温度和pH对酶的活性和稳定性的影响:

取适量纯化酶液(pH 8.0)分别在20、30、40、50、60 ℃下测定酶活，测定方法见1.6.1；另将酶液分别放在上述不同温度的水浴中保温4 h，测定残存酶活考察温度稳定性。37 ℃下，将酶液在100 mmol/L不同的pH缓冲液中(pH 4.0、5.0、6.0为柠檬酸钠缓冲液，pH 7.0、8.0、9.0为巴比妥钠- HCl缓冲液，pH 10.0为Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液)测定酶活。另外，将酶液在上述不同pH条件下，4 ℃下保温48 h，测定剩余酶活考察pH稳定性。

1.6.3 酶反应动力学测定:

方法参见文献[13]。

1.6.4 甲醇浓度对酶活的影响:

取适量纯化酶液分别在浓度为0、10、25、50、100 mmol/L甲醇浓度下测定酶活，测定方法见1.6.1。

2 结果和分析 2.1 在Albibacters sp. zjut528菌株基因组中寻找目标酯酶基因

本文作者曾报道^[13]，通过盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析从Albibacters sp. zjut528菌株的胞内液中得到了纯化的目标酯酶蛋白，并测得N端的10个氨基酸序列为NH₂-Ala-Ala-Lys-Ala- Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。作者另将菌株的基因组DNA送交某生物公司测序，虽然未得到基因组完成图，但得到基因组框架图(包括198个长度不等的核苷酸序列片段)。从其中一个核苷酸序列片段中找到了和N端10个氨基酸序列完全一致的核苷酸序列(仅此一处)，从而找到了相应的酶基因序列。该基因以GCT (氨基酸A)开始，终止于TAG，全长969 bp，编码322个氨基酸，推测该基因即目标酯酶基因，将其命名为RMest，并将该基因在Albibacters sp. zjut528中表达的酶蛋白表示为RMest。

2.2 目标酯酶基因RMest的克隆和表达

以Albibacters sp. zjut528菌株的基因组DNA为模板，根据酯酶基因RMest上下游适当位置的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增，扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，如图 1，可以看出，1000–1500 bp有一个明显条带，无非特异性条带，与预期大小相符合。使用胶回收试剂盒回收目的DNA片段，将该片段与pET-28a(+)经双酶切、T4连接酶连接后得到重组质粒，然后转化到E. coli BL21 Gold(DE3)，获得重组菌RMest-pET-28a(+)-E. coli BL21 Gold(DE3)。随机挑取平板上的两个单菌落，LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)过夜富集培养。提取重组质粒，进行质粒PCR验证(图 2)。将重组质粒送样测序，测序结果表明，重组大肠杆菌构建成功。

分别取宿主菌(含空载体)、未诱导和诱导的重组菌胞内液(发酵液离心获菌体，超声破碎后，离心取上清液)进行SDS-PAGE分析，如图 3可知，经IPTG诱导，重组大肠杆菌有目的蛋白表达，大小约为46 kDa，与预期相符，表明酯酶基因RMest在大肠杆菌RMest-pET-28a(+)-E. coli BL21 Gold(DE3)成功异源表达。

2.3 重组蛋白的纯化

用Ni²⁺亲和层析介质纯化重组蛋白。选用200 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，从图 4可以看出，纯化后目的蛋白的纯度大幅提高(泳道2)。在第一次洗脱过程中，已经将大部分的目的蛋白洗脱下来(泳道2)。第二次和第三次洗脱下来的蛋白几乎没有了(泳道3和4)。

2.4 重组酯酶RMesterase的酶学性质

2.4.1 酶的立体选择性:

将重组菌破壁，离心取上清酶液，用获得的粗酶液催化水解R, S-甲霜灵，底物终浓度为10 g/L (35.8 mmol/L)。若甲霜灵水解，产物是甲霜灵酸和甲醇。在反应初始(如图 5-A)，S-甲霜灵和R-甲霜灵各占一半，保留时间分别在11 min和35.7 min。反应6 h (如图 5-B)，R-甲霜灵的峰完全消失，底物的转化率达到了49.8%；而产物仅为R-甲霜灵酸(16.9 min)，产物的ee_p值为99.3%，表明酶的对映体选择性为严格R型。当反应再进行6 h (总时间到12 h)，如图 5-C所示，在10.07 min出现了一个较小的S-甲霜灵酸的产物峰，相应地，S-甲霜灵的峰(11 min)有所下降。这时底物的转化率达到了56.5%，产物的ee_p值降到82.9%。因此，对该酯酶来说，只有当R型底物降解完之后，才会缓慢降解S型底物。

2.4.2 温度和pH对酶活性及稳定性的影响:

取适量纯化重组酶液，分别测定不同温度下的酶活，以最高酶活为100%，结果如图 6。该酯酶在40 ℃时酶活最高，在60 ℃时几乎完全失活。将酶在不同温度下保温4 h后，20–40 ℃下剩余酶活仍保留85%以上(图 6-A、6-B)，50 ℃下剩余酶活迅速下降，60 ℃已经很难检测到活性，表明该酶在50 ℃及以上不稳定。

分别测定不同pH下的酶活，以最高酶活为100%，如图 7-A所示，酶在pH为9.0时酶活最高，pH为10.0时仍有80%以上的酶活；随着酸性的增加该酶酶活迅速下降，在pH为4.0时，只有最大活性的8%。pH稳定性研究表明，该酶在4 ℃、pH 5.0–10.0下保温48 h，剩余酶活仍保留90%以上(图 7-B)，而在pH 4.0下，剩余酶活只为初始的40%，表明该酶在pH 4.0及以下不稳定。

2.4.3 甲醇浓度对酶活性的影响:

甲醇是甲霜灵水解的产物之一。取适量纯化重组酶液分别在0、10、25、50、100 mmol/L的甲醇浓度下测定酶活，结果如图 8。图中显示甲醇浓度在0–25 mmol/L时，随着甲醇浓度的升高，酶活迅速降低，当甲醇浓度为25 mmol/L时酶活只有无甲醇时的约20%，但高于25 mmol/L时，甲醇对酶活的抑制不再随浓度的升高而增加。上述结果表明，甲霜灵的酶水解存在较严重的产物(甲醇)抑制。该性质将对酶催化水解拆分R, S-甲霜灵生产R-甲霜灵造成不利影响。

2.4.4 重组酶的酶反应动力学:

用纯化的重组酶测定了不同甲霜灵浓度下的酶反应速度，结果见图 9，反应速率和底物浓度的关系符合米氏方程。再用Lineweaver-Burk双倒数作图(见图 9小图)，求得V_max=0.114 mmol/(L·min)，K_m=2.04 mmol/L。测定时反应体系中酶(蛋白)浓度[E]=0.156×10^–3 mol/L，由k_cat=V_m/[E]，得k_cat=0.73 min^–1。

2.5 酯酶RMest与其他蛋白的序列比对

2.5.1 酯酶RMest与数据库中其他蛋白的氨基酸序列比对及进化树的构建:

在EBI网站采用Blast+对酯酶RMest进行氨基酸序列比对，选择的数据库是Uniprot KB (include UnitProt KB/Swiss-Prot and uniProt KB/TrEMBL)，其他参数为缺省值。在返回的前50个最匹配的条目中，去掉“uncharaterized protein”的条目，剩下23个条目。表 1中列出了这23个条目中的前3个和最后一个。从表中可知，与RMest同源性最高的蛋白是来自Hyphomicrobium sp.的AB hydrolase-1 domain-containing protein (AB指Alpha/Beta)，E值为2.4E-69，序列一致性40.2%，相似性57.3%。表中第23个匹配的蛋白是来自Ramlibacter sp. WS9的Lysophospholipase，E值是3.8E-51，序列一致性36.9%，相似性52.7%。而E值< 0.01就能用来可靠地推断同源性。

对这23个条目，用MEGA7.0软件构建蛋白系统发育树。先对它们进行Clustal W多重比对，然后采用邻近法建立进化树，得图 10。由图知，树中的祖先蛋白共分出4个蛋白谱系。第一个谱系是上部的Lysophospholipases，共14个成员；第三个谱系是中下部的AB hydrolase-1 domain-containing proteins，共3个成员；第四个是下部的Esterases，共6个成员；而本文的酯酶RMest为第二个谱系，只有自己1个成员。由于这些Lysophospholipases、AB hydrolase-1 domain-containing proteins和Esterases同属Alpha/Beta水解酶家族，所以酯酶RMest是一种Alpha/Beta水解酶，它最可能的功能是Lysophospholipase或Esterase。另外，由于酯酶RMest是树中第二个蛋白谱系的唯一成员，它与树中的其他蛋白均存在较大的进化距离，表明它是一个相对独立进化的Alpha/Beta水解酶(本文证明它是一个酯酶)。

2.5.2 酯酶RMest与EHest (水解甲霜灵中间体MAP)的氨基酸序列比对和催化性质比较:

将酯酶RMest (对甲霜灵有R-选择性水解活性)与酯酶EHest^[14](对甲霜灵中间体MAP有良好R-选择性水解活性，本实验室报道)的氨基酸序列进行比对，结果显示(图 11)二者存在较大差异。同大多数丝氨酸水解酶一样，两种酯酶均含有α/β水解酶家族的五肽保守区域(Gly-x-Ser-x-Gly)。酯酶RMest的五肽保守区域为GHSAG与EHest的GHSFG有一个氨基酸不同(图 11黑框处)。

甲霜灵[N-(2, 6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯]与甲霜灵中间体MAP [N-(2, 6-二甲基苯基丙氨酸甲酯)]的结构相比，只在N原子上多了一个“2-甲氧基乙酰基”支链。两种重组酯酶RMesterase和EHesterase对这两种外消旋底物的催化性质见表 2。首先，两种酯酶都对MAP有强水解活性，说明两者的活性中心结构有一定的相似之处。上文提到，两者氨基酸序列的差异较大，因此对底物MAP的水解而言，两者是一个异源同功的关系。另一方面，RMesterase对R, S-MAP无立体选择性，而EHesterase对它却有较强的R-选择性，说明它们的底物结合口袋的结构有一定的差异性。其次，RMesterase对甲霜灵有较强的活性和极高的R-选择性，说明RMesterase的底物结合口袋与R-甲霜灵的结合具有很强的专一性。而EHesterase对甲霜灵无活性，可能是甲霜灵结构中多出的支链造成了EHesterase与其结合的巨大障碍，这也反映了两种酶底物结合口袋结构的差异性。

3 讨论

将本文获得的重组酯酶RMesterase和文献[13]报道的组成型酯酶(分离于Albibacters sp. zjut528胞内液)的主要酶学性质进行比较，结果如下：(1)两者分子量大小一致。本文报道的重组酯酶的分子量约46 kDa (图 3)，文献[13]报道的组成型酯酶的分子量约40 kDa。首先，在构建重组菌时，因酶切位点的选择问题以及His标签的添加等，重组酶N端多了33个氨基酸，分子量多了4 kDa多。此外，两个分子量均来自SDS-PAGE图，有一定的估计误差。(2)两者立体选择性一致。本文用重组酯酶水解外消旋甲霜灵，底物转化率49.8%时，主产物为R-甲霜灵酸，ee_p > 99.3%。文献[13]报道，用含组成型酯酶的菌株Albibacters sp. zjut528水解外消旋甲霜灵，产物收率47.1% (约等于底物转化率)时，主产物为R-甲霜灵酸，ee_p > 99.9%；(3)温度和pH对两者的活性和稳定性的影响一致。温度和pH对重组酶和组成型酯酶的活性和稳定性的影响曲线完全类似，两种酯酶的最优温度和pH完全相同，均为40 ℃和pH 9.0。(4)两者的酶反应动力学一致。重组酶和组成型酯酶反应动力学均符合米氏方程。重组酶的米氏常数K_m (2.04 mmol/L)与组成型酶(2.29 mmol/L)相当，而重组酶的k_cat值(0.73 min^–1)小于组成型酶(0.85 min^–1)，可能原因是纯化的重组酯酶的纯度不如组成型酶。通过以上比较可以确定：本文研究的酯酶基因RMest就是使Albibacters sp. zjut528菌具有R, S-甲霜灵水解拆分活性的组成型酯酶的基因。

本文报道了一种酯酶的基因序列RMest，该基因来自于Albibacters sp. zjut528的基因组，是该菌株具有R, S-甲霜灵拆分能力的根本原因。本研究的新意主要表现在以下两点：(1)具有本文性能的酯酶基因在国内外属首次报道，该报道对生物拆分法生产精甲霜灵(R体为主)具有很大的应用价值，对进一步研究该酶结构和活性关系也具有重要的意义。(2)通过与Uniprot KB数据库中其他蛋白质的氨基酸序列进行比对，结果显示酯酶RMest与某些Lysophospholipases、AB hydrolase-1 domain-containing proteins和Esterases的同源性较高，它与同源性最高的AB hydrolase-1 domain- containing proteins的氨基酸序列一致性只有40.2%，序列相似性只有57.3% (表 1)，表明该酶是一种序列特异性强的新酯酶蛋白。

4 结论

本文从Albibacters sp. zjut528的基因组中找到一种可以高选择性水解R-甲霜灵的脂酶基因RMest，全长969 bp，编码322个氨基酸残基，属于α/β水解酶家族。本文成功构建了重组菌RMest- pET-28a(+)-E. coli BL21 Gold(DE3)，它能表达大小约为46 kDa的重组酶蛋白。用胞内重组酶液催化水解外消旋甲霜灵，当底物转化率为49.8%时，产物(甲霜灵酸)的ee_p为99.3%，对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性，并且只有当R型底物水解完之后，才会缓慢水解S型底物。该酶最适温度和pH分别为40 ℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。与Uniprot KB数据库中其他蛋白质的氨基酸序列进行比对，采用邻近法构建蛋白系统发育树，结果显示酯酶RMest与某些Lysophospholipases、AB hydrolase-1 domain- containing proteins和Esterases的同源性最高，但是与它们均存在较大的进化距离，表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶蛋白。