2020, Vol. 60中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
文章信息
- 刘爱霖, 吴志国, 江鑫, 赵明源, 杨宗政. 2020
- Ailin Liu, Zhiguo Wu, Xin Jiang, Mingyuan Zhao, Zongzheng Yang. 2020
- Cr(VI)还原菌Microbacterium sp.BD6的分离鉴定及还原特性
- Isolation, identification and characterization of Cr(VI) reducing bacterium Microbacterium sp. BD6
- 微生物学报, 60(1): 95-105
- Acta Microbiologica Sinica, 60(1): 95-105
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文章历史
- 收稿日期：2019-03-14
- 修回日期：2019-05-13
- 网络出版日期：2019-10-17
引用本文 |
2. 天津科技大学化工与材料学院, 天津 300457;
3. 天津市卤水化工与资源生态化利用重点实验室, 天津 300457
2. College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China;
3. Tianjin Key Laboratory of Brine Chemical Engineering and Resource Eco-utilization, Tianjin 300457, China
铬广泛应用于电镀、皮革鞣制、纺织印染、金属加工等行业[1]，自然界中铬的化合物多以Cr(Ⅲ)和Cr(VI)两种形式存在[2]。Cr(VI)具有强氧化性、高水溶性和不易吸附的特点，对生物的毒性方面主要是能通过硫酸盐转运蛋白进入细胞，与蛋白质和核酸结合，从而对细胞产生破坏性的影响[3-5]。Cr(Ⅲ)是生物所必需的微量元素，相对难溶于水，其穿入细胞要比Cr(VI)慢约1000倍，毒性为Cr(VI)的1/100[2]。利用各种物理、化学和生物方法将Cr(VI)富集和还原是应对Cr(VI)污染的解毒方式。一些传统的物理和化学处理过程虽然简单、快速，但许多处理过程无法克服运营成本高和二次污染物产生的问题[6-8]。此外，大多数物理和化学方法只有在Cr(VI)浓度较高的情况下才能很好地工作，而且它们的效率还受干扰剂的限制[8]。微生物修复技术因具有低成本、无二次污染等优点，被普遍认可为一种经济、有效、生态友好的Cr(VI)解毒方法[9]。
Cr(VI)污染的微生物修复技术主要有生物吸附和生物还原。微生物细胞表面有多种能与Cr(VI)发生反应的活性基团，通过络合或螯合作用将Cr(VI)吸附沉淀在细胞表面。Srinath等[11]利用Bacillus coagulans和Bacillus megaterium的死细胞对溶液中的Cr(VI)进行吸附，pH=2.5时吸附量达到最大，分别为39.9 mg/g和30.7 mg/g。Ozdemir等[12]利用Ochrobactrum anthropi的冻干细胞对Cr(VI)进行吸附，溶液pH=2.0时达到最佳吸附量57.8 mg/g。以上研究表明，生物吸附能去除溶液中的Cr(VI)，但最佳吸附pH一般较低，此外其他金属离子的干扰、吸附剂复杂的制备过程以及吸附后存在二次废物处理等问题，对实际应用都造成诸多限制[11-13]。利用微生物将Cr(VI)还原为Cr(Ⅲ)是降低Cr(VI)污染的更有效途径。Chatterjee等[14]利用Brevibacillus agri将100 mg/L的Cr(VI)在48 h内还原85%。杨宇等[15]利用Bacillus pumilus G12以甘油为电子供体60 h能完全还原50 mg/L的Cr(VI)。范琴等[16]利用Exiguobacterium sp. YM7对100 mg/L的Cr(VI)还原率为60%。可见多种种属的微生物菌株都能有效还原Cr(VI)。目前，筛选具有高效Cr(VI)耐受和还原能力的菌株仍是研究的热点。
本研究从某电镀厂下水道的淤泥中分离出一株对Cr(VI)具有较高耐受和还原能力的菌株BD6，对该菌株进行了鉴定，并对其生长以及还原特性进行了研究，以期为实际的污染修复过程提供高效的菌种资源和应用指导。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源: 分离自福建省厦门市某电镀厂下水道的淤泥。 1.1.2 培养基: LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，若为固体培养基添加1.5%–2.0%的琼脂。所有培养基121 ℃高压湿热灭菌20 min后使用。含Cr(VI)培养基：LB培养基灭菌后放至室温，根据所需添加相应的Cr(VI)标准溶液来配制。 1.1.3 Cr(VI)标准溶液: 采用杨宇等[15]的方法用重铬酸钾配制10 g/L Cr(VI)的标准溶液，用0.22 μm的滤膜过滤，置于4 ℃的冰箱中备用。 1.1.4 种子液的制备: 参考李倩等[17]的方法制备浓度为3×108 CFU/mL的菌悬液备用。 1.1.5 重金属母盐溶液: 参考黄程等[18]的方法用NiCl2、ZnCl2、CuCl2、CdCl2、MnCl2分别配制重金属母盐溶液。 1.2 菌株分离、纯化与筛选称取10 g淤泥加入90 mL LB液体培养基的三角瓶中，置于180 r/min、30 ℃的摇床中振荡培养48 h，将培养液以10倍梯度稀释，取100 μL涂布在含50 mg/L Cr(VI)的固体LB平板上，30 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h，用接种针挑取不同形态的菌落划线纯化，直至得到纯培养的菌株[15-16]。
将纯化后的菌株分别接种在含50 mg/L Cr(VI)的液体LB培养基中，于180 r/min、30 ℃的摇床中振荡培养，用二苯碳酰二肼分光光度法测量Cr(VI)[16]，选取还原能力较好的菌株作为实验菌株。
1.3 菌株的鉴定生理生化实验参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)。16S rRNA的序列扩增和系统发育树的构建：菌株BD6的DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，以菌株BD6的总DNA为模板，利用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR产物由苏州金唯智生物科技有限公司完成测序。所得序列采用MEGA 7.0软件构建系统发育树。
1.4 菌株BD6的培养特性将筛选、纯化的菌株BD6用LB培养基培养，考察不同温度、初始pH值、盐浓度、重金属离子对其生长的影响，测定了Cr(VI)对菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。
(1) 温度对菌株生长的影响：将液体LB培养基的pH调节为7.0，分别取98 mL加入到250 mL的三角瓶中，按5% (V/V)的接种量接种，摇床转速设为180 r/min，分别在10、15、20、25、30、35、40、45 ℃条件下培养。
(2) pH对菌株生长的影响：按上述方法将菌株BD6的菌悬液分别转接到初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的LB液体培养基中，在最适温度、180 r/min恒温摇床中培养。
(3) 盐浓度对菌株生长的影响：按上述方法将菌悬液分别转接至NaCl浓度为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的LB液体培养基中，在最适温度、最适初始pH、180 r/min恒温摇床中培养。
(4) 重金属离子对菌株生长的影响：按上述方法将菌悬液分别转接至含50 mg/L Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+的LB培养基中，培养方式同上。
以上实验均设置3个重复，每隔6 h测定菌液的光密度值OD600。
(5) Cr(VI)对菌株的MIC测定：配制Cr(VI)浓度在100–3000 mg/L的固体LB平板，吸取50 μL菌液涂布在平板上，设3组重复，在30 ℃的恒温培养箱中倒置培养48 h，观察菌落的生长情况[18-19]。
1.5 电子供体的选择以及菌株还原能力的测定(1) 分别在LB培养基中添加5 g/L的乳酸钠、甲酸钠、丙酸钠、果糖、乳糖、葡萄糖、甘油、丙酮酸钠、柠檬酸钠等作为电子供体，按5%的接种量接种，设置每种电子供体添加条件下的不接菌对照，每隔48 h取样测定培养基中Cr(VI)的含量。
(2) 选择最佳的电子供体，测定了菌株BD6在不同温度、pH、盐浓度、重金属离子添加等条件下对Cr(VI)的还原。实验方法同1.4，间隔一定时间测量Cr(VI)的含量。
2 结果和讨论 2.1 菌株的鉴定菌株BD6呈短杆状，长1.0–1.5 μm，宽0.3– 0.5 μm，不运动，革兰氏染色为阳性，单个菌落呈圆形，直径3–4 mm，边缘齐整，中间凸起，浅黄色，表面湿润，有光泽。菌株BD6的扫描电镜照片及具体的菌落形态如图 1所示。
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| 图 1 菌株BD6的扫描电镜照片(10000×) (A)及菌落形态图(B) Figure 1 SEM photograph (10000×) (A) and colony morphology of strain BD6 (B). |
菌株BD6的部分生理生化反应结果：硝酸盐还原、甲基红和接触酶实验为阳性，V-P反应、产H2S、吲哚实验以及过氧化氢酶实验为阴性，能利用葡萄糖、乳糖、果糖，不能利用淀粉。
以菌株BD6的DNA为模板，利用通用引物扩增得到1363 bp的16S rRNA基因片段。通过在基因序列数据库中的比对分析发现其与Microbacterium paraoxydans NBRC 103076的同源性达99.56%。将BD6与微杆菌菌株进行系统发育分析如图 2所示，菌株BD6的16S rRNA基因序列GenBank登陆号为MK611086。
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| 图 2 菌株BD6基于16S rRNA基因序列的系统发育分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of strain BD6 based on the 16S rRNA gene sequence. |
通过以上生理生化测试和系统发育分析初步将菌株BD6鉴定为微杆菌属(Microbacterium sp.)，暂命名为Microbacterium sp. BD6。
2.2 菌株BD6的生长特性不同温度、pH、盐浓度、重金属离子对菌株BD6生长的影响，如图 3所示。
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| 图 3 不同培养条件对菌株BD6生长的影响 Figure 3 Effects of different culture conditions on the growth of strain BD6. A: temperature; B: pH; C: sodium chloride concentration; D: metal ions. |
菌株BD6在20–40 ℃的温度范围内生长较好，30 ℃获得了最佳生长，属于中温菌(图 3-A)。在6.0–10.0的pH范围内菌株均生长良好，pH 7.0条件下菌株获得最佳生长，pH 4.0–5.0的条件下不利于菌株生长，在pH 11.0的条件下菌株仍有一定的生长，说明菌株BD6适宜在中性偏碱性的环境中生存(图 3-B)。在生产实践中，高盐度含铬废水的出现要求功能菌株有一定的耐盐能力[20]。经考察菌株BD6在含有50.0 g/L NaCl的LB培养基中依然能够达到一定的生长浓度(图 3-C)，说明其具有一定的耐盐特性。菌株BD6分别在50 mg/L的Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+条件下均能生长，与对照组相比Mn2+对菌株的生长产生了明显的抑制作用，Ni2+、Zn2+、Cd2+的抑制作用较为轻微，Cu2+则有一定的促进作用，这一特性与其他文献报道的相似[21]，为今后将该菌应用于复杂金属离子条件下，特别是重金属条件下的Cr(VI)还原提供了可能(图 3-D)。
随着对细菌Cr(VI)耐受和还原机理认识的不断深入，学者们普遍认为细菌对Cr(VI)的耐受和还原能力是两种独立的机能[8, 22]，但一株高效Cr(VI)还原菌能够发挥作用的前提是具备良好的Cr(VI)耐受能力。通过大量实验获得了Cr(VI)对菌株BD6的MIC为1700 mg/L，仅从Cr(VI)耐受能力方面考虑，菌株BD6完全满足一般工程实例中对Cr(VI) (浓度在20–300 mg/L)的处理需求[23-25]。
2.3 添加不同电子供体对菌株BD6还原Cr(VI)的影响LB培养基中，生长中的菌株96 h内对50 mg/L、100 mg/L以及200 mg/L Cr(VI)的还原率分别为89.79%、67.63%、29.18%。对大量的实验总结发现，在无电子供体添加的条件下，LB培养基中菌株BD6对初始浓度为100 mg/L的Cr(VI)还原率维持在60%–80%，这可能受制于LB培养基中作为Cr(VI)还原电子供体的底物限制[22]。有证据表明，具有Cr(VI)还原能力的菌株，在没有合适电子供体添加的情况下，对Cr(VI)的还原能力减弱[26-27]。因此，通过对文献的总结，选取乳酸钠、甲酸钠、丙酸钠、果糖、乳糖、葡萄糖、甘油、丙酮酸钠、柠檬酸钠等物质，其中包括糖类、有机酸、脂类、醇类，以期为菌株BD6还原Cr(VI)提供最佳的电子供体。在LB培养基中添加不同电子供体对菌株BD6还原Cr(VI)的影响，如图 4所示。
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| 图 4 添加不同电子供体对菌株BD6还原Cr(VI)的影响 Figure 4 Effects of adding different electron donors on the reduction of Cr(VI) by strain BD6. A: blank control; B: inoculation of BD6. |
未加菌条件下在LB培养基中添加电子供体对Cr(VI)的还原没有作用(图 4-A)，可以排除因添加电子供体而使Cr(VI)直接得到还原的可能。与菌株BD6在LB中的还原相比，添加乳酸钠对还原的作用不明显，添加甲酸钠、柠檬酸钠、丙酸钠对菌株的还原有不同程度的抑制，添加果糖、乳糖、葡萄糖、甘油、丙酮酸钠对还原的促进作用较好，其中添加了果糖、甘油、丙酮酸钠的实验组48 h内对Cr(VI)的还原率均达到了100% (图 4-B)。Cr(VI)还原菌对不同电子供体利用能力的差异[21, 28-31]，使得在添加电子供体时应加以选择。
本研究中对菌株BD6还原Cr(VI)促进较好的果糖、甘油、丙酮酸钠差别不大，从经济性和实际应用考虑选择甘油作为BD6还原Cr(VI)的最佳电子供体，并初步探究了甘油的添加量对菌株BD6生长和还原的影响，如图 5所示。
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| 图 5 甘油添加量对菌株BD6生长(A)和还原(B)的影响 Figure 5 Effects of glycerol addition on growth (A) and reduction (B) of strain BD6. |
图 5-A中随着甘油添加量的增加，逐渐对菌株BD6的生长产生抑制。有报道称在以甘油作为底物的微生物发酵工艺中，为避免高浓度的甘油对菌株的生长产生抑制，甘油的浓度一般控制在15–40 g/L[32]。图 5-A的实验结果表明，甘油的添加量不宜超过20 g/L。图 5-B中添加0.2 g/L的甘油即提高了菌株BD6对初始浓度为100 mg/L Cr(VI)的还原效果，但仍不足以完全还原Cr(VI)。2 g/L的添加量对还原反应较好，36 h的还原率为100%，超过此量对还原速率帮助不大。通过加大甘油的添加量来增加对Cr(VI)的还原，显然要受到多方面因素的限制，接下来的实验将作进一步的讨论。
2.4 甘油添加量对菌株BD6还原Cr(VI)的影响菌株BD6在还原Cr(VI)时，要受电子供体添加量和初始Cr(VI)浓度的影响。本研究在菌株BD6的最适生长温度和pH范围内测定了不同甘油添加量对不同初始浓度Cr(VI)的还原，如图 6所示。
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| 图 6 不同甘油添加量下菌株BD6对不同初始浓度Cr(VI)的还原情况 Figure 6 Reduction of Cr(VI) with different initial concentrations by strain BD6 with different glycerol additions. Initial concentrations of Cr(VI). A: 200 mg/L; B: 500 mg/L; C: 1000 mg/L; D: 1500 mg/L. |
由图 6-A、B、C、D可以看出在还原反应的初始阶段，因细菌处在生长的对数期菌种浓度有限，不同甘油添加量下的还原速率差别不大，但随着时间的推移还原速率的差异性逐渐显现，这可能和电子供体相对于还原酶的不饱和有关[28]。随着甘油添加量的增加，不同初始Cr(VI)浓度下的还原速率趋近于某个固定值，这个恒定值应该是不同浓度下的菌种还原反应速率[30-31, 33]，为今后还原反应速率方程的建立提供了数据支撑。随着Cr(VI)初始浓度的增大通过增加电子供体的添加量可以提高菌株BD6的还原效果，但Cr(VI)浓度较大时其毒害作用也逐渐显现，严重影响菌株的还原效能。Cr(VI)初始浓度为1000 mg/L时，还原时间明显增长(图 6-C)，1500 mg/L浓度下菌株BD6的去除效果更低(图 6-D)。
2.5 培养条件对菌株BD6还原Cr(VI)的影响在LB培养基中添加2 g/L的甘油，Cr(VI)的初始浓度设定为100 mg/L，菌株BD6在各种培养条件下对Cr(VI)的还原如图 7所示。
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| 图 7 菌株BD6在各种条件下对Cr(VI)的还原情况 Figure 7 Reduction of Cr(VI) by strain BD6 under various conditions. A: temperature; B: pH; C: sodium chloride concentration; D: metal ions. |
菌株BD6对Cr(VI)的最适还原温度在20– 35 ℃，最适还原pH在6.0–9.0，与菌株的适宜生长范围相似(图 7-A, B)。当盐浓度为50 g/L时72 h内菌株对Cr(VI)的还原率达96.79%(图 7-C)。与一株具有耐盐能力的Cr(VI)还原菌相比[20]，菌株BD6也是一株较好的耐盐Cr(VI)还原菌。重金属离子添加量为50 mg/L时，对生长和还原的抑制大小规律相似，为Mn2+ > Cd2+ > Zn2+ > Ni2+，Mn2+对生长和还原均有较为明显的抑制作用，Cu2+对生长和还原均起到了促进作用。对于较高毒性的Cd2+，菌株BD6的抗性表现较好，54 h内的Cr(VI)还原率达99.86% (图 7-D)。
3 结论(1) 本研究从某电镀厂下水道的淤泥中分离筛选出一株Cr(VI)耐受还原菌，经鉴定为微杆菌属(Microbacterium sp.)，暂命名为BD6。
(2) 对菌株BD6的生长测试表明，其适宜在中温、偏碱性的环境条件下生存，温度30 ℃、pH 7.0的条件下获得了最佳生长。菌株能在50.0 g/L NaCl培养条件下生长，表现出较好的耐盐性。Mn2+对菌株的生长表现出较高的抑制，Ni2+、Zn2+、Cd2+的抑制作用较小，Cu2+产生了一定的促进作用。Cr(VI)对菌株的MIC为1700 mg/L。
(3) 添加果糖、乳糖、葡萄糖、甘油、丙酮酸钠作为电子供体促进了菌株BD6对Cr(VI)的还原。选择甘油作为菌株还原Cr(VI)的最佳电子供体，无电子供体添加时菌株96 h内对100 mg/L Cr(VI)的还原率仅为69.63%，添加2 g/L的甘油菌株在36 h内的还原率达到了100%。通过加大甘油的添加量可以促进菌株对初始浓度较高Cr(VI)的还原，但要受到Cr(VI)的毒性限制。菌株的最适还原条件和最适生长条件吻合，在50.0 g/L NaCl的高盐条件和50 mg/L Cd2+的毒性环境中，添加2 g/L的甘油，菌株对100 mg/L Cr(VI)的还原率分别为72 h 96.79%、54 h 99.86%。
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