多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统的炎性脱髓鞘性疾病，是一种自身免疫性疾病，具有缓解、复发的临床特点，女性的发病率高于男性，是引起青壮年神经功能障碍最主要的神经系统疾病^[1-2]。MS的发病机制与基因和环境因素都有关系，例如EB病毒的感染、摄盐量、吸烟、青春期肥胖、酗酒、维生素D的缺乏等^[3-6]，这些危险因素都与肠道菌群的失调有关^[7]。例如，维生素D的减少可以改变免疫反应，产生Foxp3Treg细胞，减少肠道T细胞，从而直接影响肠道菌群^[8]。同时，梭杆菌属缺乏、厚壁菌属和古生菌属增加时MS的复发率升高^[9]。目前认为，肠道定殖菌的紊乱是一种新的值得重视的导致MS的环境因素^[10]。

实验性变态反应性脑脊髓炎模型(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是目前公认的MS的理想动物模型，能很好地模拟人类MS的发生、发展和转归过程^[11]。本实验采用EAE模型动态研究在MS发病过程中小鼠肠道菌群和淋巴细胞相关的炎症因子变化特点，进一步探讨在MS发生、发展过程中肠道菌群紊乱的变化特点和作用机制，为在临床上如何更加有效地中断反复发作以及辅助进行MS的免疫治疗提供了研究基础。

1 材料和方法 1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠48只，雌性，6–8周龄，体重16–18 g，购自甘肃省中医药大学动物研究中心，饲养于甘肃省中医药大学动物实验室(甘肃兰州)。按照随机数字表法分为正常对照组、EAE模型组各24只。已通过兰州大学第二医院伦理委员会审核。

1.2 实验材料

MOG_35-55购自CS Bio公司，完全弗氏佐剂(5 mg/mL)购自Sigma公司，结核菌素H37Ra购自Difco公司，百日咳毒素购自LBL公司。酶联免疫法IL-17、IFN-γ试剂盒购自武汉博士德试剂公司。小鼠粪便基因DNA提取试剂盒(QIAGEN，德国)。

1.3 EAE模型制备

0.9%的生理盐水将MOG_35-55稀释成10 mg/mL，然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)和等量的结核菌素H37Ra，于小鼠脊柱两旁分4点皮下注射0.1 mL的乳剂，之后分别在免疫当天及48 h分2次腹腔注射百日咳毒素0.5 mL作为免疫增强剂。

1.4 数据采集

从免疫后第1天开始，采用双盲法由两名观察者每天称量小鼠体重，采用国际通用的5分评分制对小鼠进行神经功能评分。评分标准：0分：无任何症状；1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分：一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪伴前肢瘫痪；5分：濒死状态或死亡。

1.5 小鼠粪便留取

EAE组分别于免疫后7、14、21、30 d留取小鼠粪便，每个时间点3个重复，每个样本0.5 g，取样后迅速至于冻存管中，并迅速放入液氮速冻，之后转移至–80 ℃冰箱保存。

1.6 粪便细菌基因组DNA的提取

按试剂盒要求提取DNA。PCR扩增基因组DNA，引物为细菌16S rDNA V4区特异性引物，扩增片段长度250 bp，有效序列分布长度构建测序文库采用Illumina MiSeq平台测序，对高质量测序数据进行生物信息学分析，分类学分析采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似性水平的OTU序列进行分类学分析，比对数据库为Silva_12816SrRNA database。EAE 7 d组、14 d组分别与30 d组间菌落结构差异显著性分析采用Metastats软件，7、14、21、30 d多组间比较用LEfSE在线分析软件。

1.7 酶联免疫法

EAE组小鼠分别于后免疫第7、14、21、30天随机各6只小鼠取血，分离血清，酶联免疫法测定IL-17、IFN-γ的含量。具体方法参照试剂盒说明书。

1.8 统计学方法

得到的数据采用SPSS 22.0软件，采用重复测量方差分析，计量资料采用(X±S)表示组间分析用成组t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。相关性分析，采用Spearman相关性分析。

2 结果和分析 2.1 小鼠临床症状评分与体重变化

EAE组小鼠平均发病时间7.70±0.67 d，21 d时达高峰。发病时食欲下降，体重减轻，皮毛不光滑，伴随有神经功能缺损症状出现，起病时尾部张力下降，身体向一侧倾倒，双侧后肢无力，逐渐前肢无力，严重时死亡。EAE组小鼠14 d神经功能评分2.10±1.58，21 d神经功能评分2.93±1.43，两两比较P < 0.05差异有统计学意义(图 1)。EAE组小鼠14 d体重16.28±0.23 g，21 d时体重15.96±0.45 g，30 d时体重18.28±0.41 g。14 d组与21 d组相比P < 0.05，差异有统计学意义，14 d与30 d相比P < 0.01，差异有统计学意义。正常对照组与EAE组相比，在14、21、30 d相比，P < 0.01，差异有统计学意义(图 2)。

2.2 IL-17、IFN-γ的检测结果

ELISA试剂盒检测IL-17、IFN-γ的表达。EAE组血清中IL-17的浓度21 d明显高于14 d和30 d组，差异有统计学意义(P < 0.05) (图 3)。IFN-γ的浓度在21 d时最高，与14 d和30 d组相比，差异也有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 肠道微生物测序结果

根据16S rRNA测序结果，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似性水平的OTU序列进行分类学分析，比对数据库Silva_128 16S rDNA database，得到了EAE组和正常对照组粪便共OTU221，15个界，125个门，189个钢，189个目，336个科，688个属，38个种。

2.3.1 物种相对丰度: 采用R语言作图在属水平上TOP 30物种分布柱状图(图 4)，其中以拟杆菌属、普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属、Alistipes、毛螺菌属、拟普雷沃菌属含量较高。

2.3.2 主坐标分析(PCoA): 对所有样本进行主坐标分析，图中一个点代表一个样品，颜色相同的点属于同一种分组，两个点之间的距离越近，说明两个样品的微生物群落差异越小(图 5)。采用主成分PC1和次要成分PC2分析；PC1贡献度为23.71%，PC2贡献度为20.03%。各组样本位于不同的象限中，差异较大。

2.3.3 组间菌落结构差异显著性分析结果: Metastats差异分析：14 d时，EAE组与正常对照组相比，物种丰度有显著性差异(P < 0.05)的菌种有：Alistipes、布牢特氏菌属、毛螺菌属_NK4A136_group、普雷沃氏菌属_NK3B31_group、普雷沃氏菌属_UCG-001 (图 6)。30 d时EAE组与正常对照组相比，物种丰度有显著性差异(P < 0.05)的菌种有：Allobaculum (支原体科)、真菌属、螺杆菌、Parasutterella、普雷沃氏菌属(图 7)。LEfSE差异分析(图 8)：在7 d组起主要作用的微生物群是瘤胃球菌属、变形菌属、弯曲菌目、螺杆菌科，14 d组伯克氏菌目、parasutterella、β-变性菌、产碱杆菌属，21 d组Odoribacter。

2.4 相关性分析

普雷沃氏菌属NK3B31_group的丰度均较正常对照组降低，与IFN-γ呈负相关(r=–0.537，P < 0.01)。

3 讨论

肠道作为人体最大的微生物定殖场所，肠道菌群参与宿主的多项生理过程，在保护肠道屏障、抑制病原微生物和全身免疫反应的形成中起了重要作用^[12]。随着微生物-肠-脑轴(microbiome-gut-brin axis，MGBA)的发现，逐渐开始关注其在MS发病过程中的作用。研究发现MS患者肠道中甲烷短杆菌和艾克曼菌属含量增加，它们可以刺激机体T细胞和单核细胞分化，因而激活天然和获得性免疫系统。然而予以DMT (disease-modifying treatment)干预后，患者肠道菌群中普式菌属和萨特氏菌属含量增加，八叠球菌属含量下降^[13]。因而，肠道菌群失调可能在多发性硬化病程中起到重要作用。

目前认为，肠道菌群可能通过调节淋巴细胞分化、炎症因子、代谢产物、破坏血脑屏障等机制参与了MS的发生发展过程^[14]。在本研究中采用MOG作为抗原诱导EAE模型，深入研究了肠道菌群在MS中的作用机制。MOG_35-55特异性活化T淋巴细胞，活化的T细胞可能通过受损的血脑屏障(blood brain barrier，BBB)进入中枢神经系统，释放细胞因子，引起脑部的病变。选用的C57BL/6小鼠，诱发的EAE呈慢性单相病程，CNS病灶呈多发性，主要位于白质，大脑、小脑、脑干及脊髓均有不同程度受累。EAE组的临床评分变化趋势及平均值如图 1，可以看到平均发病时间7.700±0.674 d，在21 d左右达到高峰，7、14、21 d三个时间点相比临床评分差异有统计学意义(P < 0.01)。体重的变化在正常对照组与EAE组，在14、21、30 d组间比较，P < 0.05差异有统计学意义。EAE组体重的变化趋势与临床评分的变化趋势一致。本研究中炎症因子IL-17、IFN-γ两者在21 d时最高，在各个时间点相比P < 0.05，差异有统计学意义。这说明，被动免疫PLP导致的炎性脱髓鞘反应上调了γ型的IFN的浓度，其介导JAK/STAT1信号通路，是通过JAK/STAT1-SOCS3信号通路中抑制免疫的重要因子。

本研究采用16S rDNA测序，采用R语言作图，各个样本在属水平上TOP 30物种丰度分布柱状图(图 8)，以多形杆菌属、普雷沃氏菌属、瘤胃菌属、另枝菌属、毛螺旋菌属、Alloprevotella丰度较高，是优势菌群。这与以往的研究MS患者肠道菌群中厚壁菌属和古生菌属、普式菌属、萨特氏菌属含量增加时引起肠道及中枢神经系统炎症，MS容易复发的结果相一致^[9]。14 d时，EAE组与正常对照组相比，物种丰度有显著性菌种是：Alistipes、布牢特氏菌属、毛螺菌属_-NK4A136_group、普雷沃氏菌属_NK3B31_group、普雷沃氏菌属_UCG-001。30 d时EAE组与正常对照组相比，有显著性差异的菌种有：Allobaculum (支原体科)、真细菌属、螺杆菌、Parasutterella、普雷沃氏菌属_NK3B31_group。不同的时间点与正常对照组相比，有显著性差异的菌种不同，因此存在肠道菌群结构的紊乱。可见，EAE小鼠肠道菌群结构的紊乱与炎性脱髓鞘的发生密切相关。其中普雷沃氏菌属_NK3B31_group的丰度在14 d组、30 d组均较正常对照组降低。普雷沃氏菌被认为与短链脂肪酸的合成一致^[15]，Haghikia等的研究发现低链脂肪酸可以抑制炎症反应，同时发现中长链脂肪酸可以促使T细胞分化为Th17、Th1细胞。短链脂肪酸也可以促进TGFβ1的表达，从而诱导Treg细胞的分化。由此可见短链脂肪酸在中枢神经系统疾病中起到抑制免疫反应的作用^[16]。通过相关性分析发现与IFN-γ、IL-17呈负相关。如前所述IFN-γ在肠道菌群紊乱的多发性硬化患者中表达显著增加，IFN-γ是典型的Thl型细胞因子，促进淋巴毒素或肿瘤坏死因子等介质的释放，引起脱髓鞘改变^[17]，可以加重多发性硬化的疾病进展^[18]。IL-17是Th17分泌的，是早期产生的具有广泛生物学活性的炎性细胞因子^[19]。IL-17受体存在于血脑屏障内皮细胞上，肠道菌群紊乱后，血液系统中IL-17增加，随着血液循环到达中枢的IL-17可通过血脑屏障内皮细胞上的受体直接穿过BBB^[20]。这说明肠道菌群及其相关炎症介质可能通过直接穿过BBB、改变BBB的完整性、增加血脑屏障的通透性或者直接刺激各种神经免疫物质等方式，参与MS的发生发展过程^[21]。普雷沃氏菌属_NK3B31_group的丰度的变化可能与上调血液中的炎症因子IFN-γ、IL-17的含量有关，导致肠道菌群的含量紊乱，继而又作用于中枢神经系统导致炎症脱髓鞘的形成，证实了MGBA^[22]的存在。在本研究中LEfSE差异分析的结果显示，在21 d起主要作用的菌属是Odoribacter。目前对于Odoribacter的研究较少，Odoribacter是紫单胞菌科，具体作用机制有待于进一步深入研究。

本实验主要侧重于炎症因子与肠道菌群在实验性脑脊髓膜炎关系中的作用及其机制进行了相关研究。γ型的IFN、IL-I7是在JAK/STAT1-SOCS3信号通路中抑制免疫的重要因子。肠道菌群结构的紊乱、菌群丰度的减少对EAE小鼠中淋巴细胞的分化、炎症因子表达的影响产生了重要的作用。肠道菌群可能从多个方面参与了MS的复发-缓解的病程，通过本研究发现的在EAE发病过程中起密切相关的肠道菌群，如普雷沃氏菌属_NK3B31_group、Odoribacter，具体的作用机制有待于进一步的深入研究，通过探索靶向调整肠道菌群的药物为MS的免疫治疗提供更多的方式。