拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)是一种生存适应力高、入侵性强，近年来呈全球性扩张分布的淡水水华蓝藻，它首次入侵某一水体几年后就能形成强烈占优势的水华藻^[1]。有些种类的拟柱孢藻可以产生毒素，研究较多的主要有CYN (Cylindrospermopsin)和STX (saxitoxin)等，前者是一种具有肝肾毒性的细胞毒素，后者为一种神经毒素^[2-3]。产毒拟柱孢藻在全球很多淡水饮用水水源地均有发现^[4-6]，由拟柱孢藻及其毒素引起的对水环境、动物及人体造成的危害也日渐受到人们的广泛关注^[7-8]。近几十年来，拟柱孢藻环境强适应性的生长特性^{[1, 9]}、入侵扩张特点^[10-12]、毒素种类及产毒的分子机制^[13-14]以及如何监测及去除拟柱孢藻及其毒素^[15-17]等方面的研究，一直是国内外学者的研究热点。

以拟柱孢藻为优势种的蓝藻水华不仅在河流、水库及湖泊等水体中频繁暴发，也可在鱼塘、盐沼和碱性湖泊中形成优势种^[18]。近年来在广东省，拟柱孢藻不仅在很多水库已取代微囊藻成为优势种^[19]，而且在珠海、中山及汕头等多地的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池中大量生长繁殖并形成优势藻类。凡纳滨对虾养殖池中的拟柱孢藻不产生毒素，形态呈少有的卷曲型^[20]，其大量繁殖并末对对虾的生长造成危害，反而有利于对虾健康生长，水质也更稳定。聂利华等^[21]通过对中国科学院武汉水生生物研究所来源的拟柱孢藻藻株研究发现，它对水体多种重金属离子具有很强的富集能力，推测拟柱孢藻可能富集了虾池环境中的大量重金属离子从而改善了水质。为进一步探讨虾池来源的拟柱孢藻潜在的重金属生物富集性能及其他生理生化特性，本研究以广东汕头澄海地区凡纳滨对虾养殖池中分离纯化出的藻株为实验材料，通过形态及16S rRNA基因进行鉴定并进行培养基优化培养，选取3种重金属离子(Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺)进行生长耐受试验，以期摸索其耐受范围，为拟柱孢藻活藻吸附重金属性能的研究提供参考。

1 材料和方法 1.1 藻种分离、鉴定与培养

1.1.1 藻种分离与16S rRNA的提取: 实验选用的藻种采集于广东省汕头市澄海凡纳滨对虾养殖池，样品送至中国科学院武汉水生生物研究所进行分离，在光学显微镜下，用自制的玻璃毛细管从水样中挑取单根藻丝，无菌水洗涤4-5次后转入含2 mL CT培养基的96孔板中，置于恒温光照培养箱中进行培养，培养条件为：光强25 µE/(m²·s)，光暗周期12 h:12 h，温度(25±1) ℃，培养约4周左右待藻丝明显生长后，先后转入10 mL试管及100 mL三角锥形瓶中继续扩大培养获得单种藻种。

对所分离的纯种藻依据形态特征进行种类鉴定后，以藻液的总DNA为模板，采用针对16S rRNA设计的蓝藻特异性引物(27F/809R)进行PCR扩增^[22]，PCR的反应体系(30 µL)：DNA模板1 µL，引物1、2各3 µL，dNTP 2 µL，Buffer 3 µL，酶0.2 µL，纯水17.8 µL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，最后1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。

1.1.2 分离藻株16S rRNA序列的测定及系统发育树的构建: PCR产物送深圳华大基因科技服务有限公司进行序列测定, 获得的序列与GenBank上下载的多株拟柱孢藻的16S rRNA序列及5株外类群藻即念珠藻属Nostoc sp. PCC7120、柱孢藻属Cylindrospermum sp. PCC7417、螺旋藻属Spirulina platensis、鱼腥藻属Umezakia natans TAC101和Anabaena bergii等采用BLAST软件进行相似性分析^[23]，并使用MEGA 6.0软件和邻接法(Neighbor Joining，NJ)对获得的序列构建系统发育树。

1.1.3 藻种培养: 在CT和BG11两种蓝藻通用培养基的基础上，根据前期摸索调整氮浓度及氮、磷比，设定了6种条件对分离鉴定后的藻种进行了培养基优化：对CT，N 32 mg/L，N︰P=13︰1；N 64 mg/L，N︰P=25︰1；N 128 mg/L，N︰P=50︰1；对BG-11，N 247 mg/L，N︰P=35︰1；N 124 mg/L，N︰P=17︰1；N 62 mg/L，N︰P=9︰1，依次设定为C1-3与B1-3号条件，每种培养基条件设置3个平行。实验采用单种批量藻液进行，取同一藻密度相同体积的适量藻液，无菌接种至含150 mL不同培养基的三角瓶中，置于恒温光照培养箱中进行培养，培养箱环境条件参考前期研究^[24]。每天摇瓶1次，隔天定时取样，测定OD₆₈₀反映其生物量，绘制生长曲线，并计算平均比生长速率(µ)。藻培养过程中，不定时无菌取样，制作临时装片，显微镜下观察藻的形态。

平均比生长速率(µ)按照公式(1)计算。

公式(1)

式中，t为从B₀至B_t的时间间隔(d)；B_t为藻丝生长到对数生长末期时的藻丝密度；B_o为初始藻丝密度。

1.2 不同浓度重金属离子Cu²⁺、Cd²⁺和Pb²⁺对分离藻株的影响

实验所用重金属离子试剂为硫酸铜、硝酸铅及氯化镉，国产分析纯。根据预实验结果及优化的最佳培养基，配制含不同浓度的重金属离子溶液的培养基，离子水平分别为，Cu²⁺:0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L；Cd²⁺：0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L；Pb²⁺︰0、1、5、10、20、40、80 mg/L，每个浓度设定3个平行。实验前1周进行藻种的活化培养，使其达到对数生长期，之后取适量藻液4000 r/min，离心10 min，收获藻体无菌接种至含不同重金属离子的150 mL培养液中，接种密度为2.1×10⁶/L。从接种后第2天开始，每天定时取样测定，绘制不同浓度重金属离子下的藻生长曲线，同时计算抑制率I(%)(公式2)。

公式(2)

式中I为藻细胞生长抑制率，u_o为对照组的特定生长速率，u_t为藻液在t时刻的特定生长速率，所得数值通过计算后使用Origin 8.0软件，利用曲线拟合得出96 h的EC₅₀值^[25]。

2 结果和分析 2.1 分离藻株藻属的确定

分离纯化的藻体镜下观察呈卷曲、螺旋的丝状，末端细胞尖细，宽度约2-3.5 µm，长度可至60 µm、多数20-50 µm (图 1-A、B)，偶见异形胞，顶生。为进一步明确藻株的归属，进行了16S rRNA的提取、PCR扩增与测序。

图 2为藻株16S rRNA的PCR扩增的电泳图，产物与预期的大小一致，约780 bp。测序结果表明拟柱孢藻16S rRNA最重要的780个核甘酸序列得到了有效扩增，将测得的基因序列用BLAST软件与GenBank中已发表的其他种类拟柱孢藻16S rRNA序列及5株外类群进行同源性比较，并构建系统发育树(图 3)，三角形代表样品。结果表明分离藻株与其他来源的拟柱孢藻都聚集在同一类群中，与已报道的拟柱孢藻Cylindrospermopsis catemaco CHAB1390亲源关系最近，比对显示有98%的相似性，意味着本分离藻株在蓝细菌分类学地位上归属于拟柱孢藻属，但是否与Cylindrospermopsis catemaco CHAB1390为同一种则尚缺乏足够的证据，结合形态学特征，本藻株命名为螺旋拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii helix)。

2.2 螺旋拟柱孢藻的培养基优化

图 4、图 5为螺旋拟柱孢藻藻丝在6种不同培养基条件下的生长曲线及其生长速率。结果显示，本藻丝在这6种培养基(C1、C2、C3、B1、B2、B3)条件下均能生长。多数条件下，藻体在经历约3-5 d的滞留期即进入生长快速的对数生长期，约15-16 d达稳定生长期，其中生物量最高及生长速率最快的培养基条件为B3，即在蓝藻通用培养基BG11的基础上调整氮浓度及氮、磷比分别为62 mg/L和9︰1，在此培养基条件下，最高生物量达(0.632±0.170)×10⁷/L，生长速率为(0.063± 0.001)/d，另外，在此培养基中的藻液主要呈绿色，镜下呈典型的螺旋型藻丝，多为3-4个螺旋，而生物量及生长速率较低的培养基条件为C3(即CT培养基上调整氮浓度及氮、磷比分别为N128 mg/L，N︰P=50︰1)和B1(即原始BG11未调整的培养基)，这2种培养基中的藻液多为黄色，镜下藻体呈弧形、圆形居多，其中C3的最高生物量低至4.50×10⁶/L，平均生长速率为0.038/d，分别为B3培养基的68.6%和60.3%，C3与B3组的生物量与生长速率存在显著差异(P < 0.05)。由此可见，螺旋拟柱孢藻生长最优的培养基为B3培养基。

2.3 不同浓度重金属离子Cu²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺对螺旋拟柱孢藻生长的影响

螺旋拟柱孢藻在不同浓度Cu²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺条件下经过7-8 d的培养后，结果如图 6所示。在预实验的基础上本实验设置的重金属离子浓度范围内，相比对照组而言，除Pb²⁺外，不同浓度的Cu²⁺和Cd²⁺对螺旋拟柱孢藻均表现出不同程度的抑制作用，藻体在经过2-3 d的适应性生长后，于第4天(≥96 h)受抑制效果更明显，且此抑制作用随重金属离子浓度的升高而增加。在Cu²⁺浓度范围为0-0.2 mg/L、Cd²⁺浓度范围为0-0.5 mg/L时，藻细胞仍可进入生长期，藻液不发黄，表现出一定的耐受性；对Cd²⁺的耐受性强于Cu²⁺，在Cu²⁺、Cd²⁺浓度分别为0.4、1 mg/L的环境中，藻细胞无任何生长，培养液后期为黄白色，镜检为聚集成堆的死亡藻细胞。使用回归曲线模拟，计算得出Cu²⁺和Cd²⁺对藻体的96 h EC₅₀值分别为0.125、0.551 mg/L。在Pb²⁺浓度为0-80 mg/L的范围内，除80 mg/L的Pb²⁺对藻体表现为明显抑制外，其他浓度对藻体的生长表现为一定的促进作用，尤其是处理第4天(96 h)后，在1-20 mg/L的Pb²⁺浓度范围内，促进作用随浓度升高而加强，40 mg/L的Pb²⁺对藻的生长也是促进的，但其促进作用低于10、20 mg/L的Pb²⁺浓度处理。以上结果表明，螺旋拟柱孢藻可以在一定浓度范围的Cu²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺重金属离子条件下生存，具有一定的耐受性，耐受性能依次为：Pb²⁺ > Cd²⁺ > Cu²⁺，能耐受的重金属离子浓度分别为Pb²⁺为1-40 mg/L，Cd²⁺为0-0.5 mg/L，Cu²⁺为0-0.2 mg/L。

3 讨论

拟柱孢藻是近年来受到广泛关注的一类具有潜在毒性且入侵性强的淡水水华蓝细菌，属于念珠藻目念珠藻科拟柱孢藻属^[26]，其分类主要结合形态学特征及分子生物学方法。根据显微镜下藻株形态、营养细胞、异形胞的大小与形成差异及孢子特征等方面分为Cylindrospermopsis africana、C. cuspis、C. philippinensis、C. raciborskii、C. allantoidispora、C. catemaco、C. tavernae和C. curvispora等8个种，其中C. raciborskii即拉氏拟柱孢藻因CYN、STX等毒素引发多起毒害事件而备受关注与研究^[27]，因而成为拟柱孢藻属的模式种^[28]。分子生物学水平上，16S rRNA常被用于对各种生物进行系统发育学及种属分类等方面的研究，于婷^[23]通过对广东镇海水库分离的8株拟柱孢藻的16S rRNA测序结果与GenBank上下载的15株来源于美、法、澳大利亚、德国等地区的拟柱孢藻16S rRNA比对发现，拟柱孢藻藻株间的16S rRNA相似度高达99.8%-100%。Saker^[27]对澳大利亚北部多个水域来源的7株拟柱孢藻进行16S rRNA遗传学分析，发现其相似度达99.8%以上。Wilson^[29]以16S rRNA、rpoCl、PC-IGS及固氮酶nif H基因等作为分子标记，分析澳大利亚地区2株形态分别为直线型与卷曲形的拟柱孢藻，发现其具有相似的遗传特征。本研究虾池来源的藻株16S rRNA序列与GenBank上下载的多株拟柱孢藻的16S rRNA序列构建的系统发育树可以看出，这些藻株都聚集在同一类群中，相似度均达到98%以上，说明在种属类别方面，虾池来源的藻株属于拟柱孢藻藻属，但此藻株形态为螺旋卷曲型，国内少见。查广才等^{[20, 30-31]}在对广东省凡纳滨对虾低盐度养殖水体环境进行长期跟踪调查时首次发现此螺旋卷曲型的拟柱孢藻，其在调查中还发现，螺旋拟柱孢藻极易在虾池中大量生长繁殖并形成优势种且对对虾生长无害，虾池的水质反而更稳定，这说明螺旋拟柱孢藻具有某种调节虾池水环境的特性而促进虾体健康，另一方面也说明遗传特征相似的不同拟柱孢藻藻株，其形态与生理功能存在一定程度的差异性。Willis等^[32]从澳大利亚Wivenhoe水库分离出24株拟柱孢藻，以HIP1为分子标记的遗传分析发现其系统发育异质性小，但其形态、生长率、营养代谢及产毒等方面的差异却较大。另外，也有学者^[33]从巴西一水库中同时分离到直线型与曲线型的拟柱孢藻，发现其生长生理特性也不相同。

本研究虾池来源的螺旋拟柱孢藻在两种通用蓝藻培养基CT与BG11中，生物量及比生长速率均不高，藻液极易变黄，在6种改良培养基中，生长最佳的是B3 (BG11基础上，N 62 mg/L，N︰P=9︰1)，生长最差的是C3 (CT基础上，N 128 mg/L，N︰P=50︰1)。分析发现，这6种培养基中，B3的氮磷比最小，而C3的氮磷比最高，其次，磷浓度上B3 (约7 mg/L)高于C3 (约2.56 mg/L)。根据螺旋拟柱孢藻在这6种改良培养基的生物量与比生长速率总体来看，藻丝生长与氮磷比负相关，与磷浓度正相关，氮磷比与磷浓度为主要影响因子，与赵莉等^[34]研究一致。磷对拟柱孢藻的作用一直是多年来的研究热点，拟柱孢藻对磷具有较高的亲和力及储存能力，有研究报道磷浓度与拟柱孢藻生物量之间呈正相关，也有呈负相关的报道^{[14, 35-36]}。不同拟柱孢藻藻株对磷浓度及其波动性变化具有生长反应的差异，这不仅表明藻株反应的灵活性，而且也表明藻株之间具有明显的差异性。此外，本项目调整的6种培养基条件中，氮浓度的水平均较高(≥32 mg/L)，藻株因氮浓度的不同引起的生长差异性较小，这与于婷等^[37]及戴景峻等^[19]的研究一致，拟柱孢藻藻丝的生长在高氮浓度下，受氮浓度影响小，而磷浓度及氮磷比成为更重要的决定因子。

藻类与重金属的相互作用研究对于了解重金属对水生生物的致毒机理、藻类的抗性机制以及利用藻类进行生物监测和防治水体重余属污染具有重要的意义^[38]。拟柱孢藻是一种近年来才受到广泛关注的水华蓝藻，其与重金属之间的相互作用研究不多。Tonietto等^[39]分析了不同分子量的拟柱孢藻有机分泌物(EOM)对重金属离子铜与隔的络合作用，结果发现藻株EOM络合铜离子的配体有2个，络合镉的配体只有1个，而且小分子量的EOM对铜的络合力更强。Tonietto^[40]将拟柱孢藻的可溶性有机分泌物按分子量分为3部分(> 30 kDa；30-10 kDa；10-3 kDa)，其发现不同分子量的有机分泌物对重金属离子Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺和Pb²⁺具有不同的络合位点与络合力，其中10-3 kDa的拟柱孢藻有机分泌物对Cu²⁺和Cd²⁺的络合力最强。聂利华等^[21]通过大规模无菌通气培养拟柱孢藻，冷冻干燥法收集藻粉，对Pb²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Cr²⁺、Co²⁺及Ni²⁺等7种重金属离子设计了24 h的吸附实验，结果发现拟柱孢藻对多数离子的吸附作用较强，在2 h内即可达到最佳吸附效果。凡纳滨对虾养殖池中处于优势生长的螺旋拟柱孢藻有益于虾体健康，是否因为藻体能够耐受并吸附了重金属离子，从而改善了水质？为此本研究从耐受性方面对水体常见的重金属离子Cu²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺进行了初步探讨，研究发现，螺旋拟柱孢藻对这3种离子具有不同程度的耐受性，能耐受的离子浓度范围分别为Pb²⁺ 1-40 mg/L、Cd²⁺0-0.5 mg/L、Cu²⁺ 0-0.2 mg/L，本藻株对Cu²⁺的耐受性比淡水蓝藻螺旋藻弱^[41]，对Cd²⁺的耐受性与微囊藻相当^[42]。Pb²⁺对螺旋拟柱孢藻具有低浓度促进高浓度抑制生长的特性，与张展宁等^[43]、李勇勇等^[44]及易婷婷等^[25]研究Pb²⁺对蛋白核小球藻、螺旋藻及淡水硅藻谷皮菱形藻的作用性质类似，但螺旋拟柱孢藻在80 mg/L的Pb²⁺浓度下才表现为明显抑制作用，远远高于螺旋藻(60 mg/L)及淡水硅藻谷皮菱形藻(50 mg/L)，蛋白核小球藻的抑制浓度与之相同。活体藻类因易受到重金属的毒性作用，适合用于水体重金属浓度为1 mg/L左右的生物修复^[45]，螺旋拟柱孢藻活体对Cd²⁺(≤0.5 mg/L)、Cu²⁺(≤0.2 mg/L)是否具有吸附作用还需进一步研究，藻体对Pb²⁺耐受性更高，以期用于更高浓度Pb²⁺污染的水体处理中。