鸭疫里默氏杆菌是一种革兰氏阴性杆状菌，属于拟杆菌门，黄杆菌科，里氏菌属^[1]。自1982年郭玉璞首次从北京雏鸭分离出该菌以来^[2]，由该菌引起的疾病在全国范围内时有发生和流行。目前已报道的鸭疫里默氏杆菌血清型超过21种，且各个血清型之间无明显的交叉保护作用^[3-4]。目前，用于防治鸭疫里默氏杆菌感染的主要手段为疫苗免疫和药物治疗。由于鸭疫里默氏杆菌血清型众多且同一养鸭场可能存在不同血清型的流行，所以欲通过疫苗实现有效预防面临一些实际困难。另一方面，鸭疫里默氏杆菌对多种抗生素敏感，生产实践中应用抗生素药物防治该病，致使鸭疫里默氏杆菌的耐药情况愈发严重，对环境造成严重污染及对人类健康造成威胁。

1 鸭疫里默氏杆菌病在我国流行现状

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种接触性传染病，是造成雏鸭死亡的原因之一。该病主要侵害2–7周龄的雏鸭，其中2–3周龄的雏鸭最易感^[5]，且有向大龄化发展的趋势。鸭疫里默氏杆菌病于1932年在美国纽约长岛的北京鸭中发现^[6]，在我国于1982年首次报道^[2]。近年来，在我国的北京^[7]、四川^[8]、山东^[9]、河北^[9]、江苏^[10]、安徽^[11]、广东^[12-13]等几乎所有的养鸭地区均有报道。目前在我国鉴定的血清型主要有1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、17、22、23、24、25型等10多种血清型^[7-8]。由此可见，鸭疫里默氏杆菌病的防控形势依然严峻且难以根除。

2 鸭疫里默氏杆菌毒力相关基因的鉴定 2.1 铁离子利用相关基因参与毒力

对于包括细菌在内的几乎所有的生命体而言，铁离子是必需的营养元素。研究表明，铁离子参与了电子传递、抗氧化反应以及核酸的合成等多种生命活动^[14]。在高等动物体内，游离的铁离子浓度非常低且不能够满足细菌的生长需求。一部分三价铁离子被结合在乳铁蛋白、转铁蛋白等宿主铁蛋白上^[15]。大多数的铁离子(90%以上)主要以血红素的形式存在于血红素结合蛋白(Hemoprotein)中，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素等^[16]。因此，细菌进化出了多种铁离子转运系统。

亚铁离子被认为是细菌利用铁的首选形式，可溶性的亚铁离子通过外膜直接进入胞周质，在Feo转运系统的作用下将铁离子转运至胞质供细菌利用^[17-18]。另外，一些细菌可以合成和分泌对铁离子具有高亲和力的铁载体(Siderophores)，它能够螯合三价铁离子形成铁载体-Fe³⁺复合物，这些铁载体-Fe³⁺复合物被特定外膜受体识别并在TonB复合物提供能量的帮助下转运进入细胞中供自身使用^[19]。铁载体能螯合宿主体内铁结合蛋白中的铁离子，包括转铁蛋白和乳铁蛋白等^[20-21]。目前发现的革兰氏阴性菌血红素转运系统主要包括直接的血红素转运系统和血红素载体(Hemophore)介导的间接血红素转运系统^[22]。在直接的血红素转运系统中，外膜受体可以直接从宿主摄取游离的血红素或血红素结合蛋白中的血红素。如小肠结肠耶尔森菌(Yersinia enterocxolitica)的hemR- hemSTUV系统、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的hmuRSTUV系统等^[16]。而在血红素载体介导的血红素转运系统中，则是由血红素载体从血红素结合蛋白中摄取血红素，然后将其传递给相应的外膜血红素受体。血红素载体的这种作用方式不但增大了利用宿主血红素结合蛋白的范围，而且提高了血红素的利用效率。目前已经鉴定的血红素载体主要有3种，分别为HasA型、HxuA型、HmuY型^[22]。

鸭疫里默氏杆菌基因组序列分析表明，该菌编码3个TonB依赖性的铁载体受体、1个铁载体相互作用蛋白、2个TonB依赖性的血红素受体蛋白、1个FeoAB系统、2套TonB-ExbB-ExbD复合物及1个单独存在的TonB家族蛋白^[23]。Liao等(2015)对鸭疫里默氏杆菌的3个TonB蛋白进行了鉴定，结果表明TonB1和TonB2均参与了鸭疫里默氏杆菌三价铁离子和血红素的转运且与TonB1相比，TonB2更为重要^[24]。随后，Liao等(2016)鉴定了鸭疫里默氏杆菌CH-1株中45、37、33、23、20、13 kDa胞浆血红素结合蛋白以及90、70、60、50、15 kDa的外膜血红素结合蛋白，说明鸭疫里默氏杆菌确实存在血红素转运系统^[25]。Liu等(2016)通过干扰和过表达的方法对TonB3 (TbfA)进行了功能鉴定，结果表明TonB3并没有参与鸭疫里默氏杆菌血红素的转运^[26]。为进一步发现更多的参与铁离子利用的基因，Liu等(2017)比较了鸭疫里默氏杆菌在铁离子丰富和铁离子限制性培养基中的转录组^[27]。在铁离子限制性培养基中，80个基因上调，383个基因下调，这些基因的发现为进一步鉴定鸭疫里默氏杆菌铁离子利用机制奠定了良好的基础^[27]。

2.1.1 TonB: Miao等(2015)构建了鸭疫里默氏杆菌CH3株tonB基因缺失株。与野生株相比，tonB1和tonB2缺失株对Vero细胞的粘附能力均明显降低^[28]。动物试验表明，野生株对10日龄雏鸭的半数致死量(LD₅₀)为2.29×10⁷，而tonB1缺失株的LD₅₀为5.13×10⁹，tonB2缺失株的LD₅₀为2.00×10⁹。相应的，与野生株相比，tonB1和tonB2缺失株在雏鸭组织定殖的能力均明显降低^[28]。由此说明，鸭疫里默氏杆菌TonB参与了毒力。

2.1.2 TonB依赖性受体: Lu等(2013)对鸭疫里默氏杆菌CH3株的TonB依赖性受体编码基因tbR1进行了缺失^[29]。与野生株相比，缺失株生物被膜形成的能力降低，同时对Vero细胞的粘附、入侵能力也降低。动物试验表明，缺失株的LD₅₀比野生株提高了45倍，且在各个组织器官的定殖能力下降。由此证明tbdR1基因参与了鸭疫里默氏杆菌的致病^[29]。Wang等(2017)对鸭疫里默氏杆菌CH-1株的TonB依赖性受体编码基因B739_1208进行了缺失^[30]。与野生株相比，缺失株利用铁离子的能力降低。动物试验表明，缺失株的LD₅₀明显高于野生株，且在体内与野生株的竞争能力减弱^[30]。Liu等(2018)在鸭疫里默氏杆菌CH-1株鉴定了另一个TonB依赖性的受体B739_1343^[31]。与野生株相比，B739_1343缺失株利用铁离子的能力降低且毒力减弱。将B739_1343缺失株作为弱毒疫苗免疫动物发现可以有效阻止野生株的攻击^[31]。

2.1.3 铁摄取调节子(Ferric uptake regulator，Fur): 铁离子是大多数细菌生存所必需的营养物质，但是过多的铁离子通过芬顿反应产生的活性氧会对细菌造成损伤。在细菌体内，铁离子的稳态受到严格的调控。铁摄取调节子是细菌铁离子代谢中最重要的调节子。当胞内游离铁浓度过高时，Fur以二聚体的形式与铁摄取相关基因的启动子结合从而抑制其转录；当胞内铁离子浓度过低时，Fur-Fe²⁺二聚体解离，变为Fur单体，从而解除对铁摄取相关基因的抑制作用^[32]。Guo等(2017)将鸭疫里默氏杆菌YM株中的fur基因进行了缺失。结果表明，与野生株相比，fur缺失株的毒力降低了80倍且在各组织器官的定殖能力降低^[33]。

2.2 外膜蛋白A (Outer membrane protein A，OmpA)

在大肠杆菌中，OmpA是一种重要的多功能蛋白。OmpA可以维持细胞的完整性^[34]，并在细菌接合转移^[35]、细胞粘附入侵^[36]中发挥重要的作用。OmpA存在于目前已测序的所有鸭疫里默氏杆菌菌株中。Subramaniam等(2000)将OmpA鉴定为鸭疫里默氏杆菌主要的免疫原性外膜蛋白^[37]。Huang等(2002)研究表明OmpA免疫可以产生针对鸭疫里默氏杆菌特异性的抗体，但不能提供针对强毒攻击的保护作用^[38]。Hu等(2011)对鸭疫里默氏杆菌血清2型Th4的ompA基因进行缺失。与野生株相比，缺失株生长状态和菌落形态并无明显改变。然而，ompA基因缺失株的粘附和入侵Vero细胞的能力均显著下降，且LD₅₀增加100倍以上。证明ompA基因是鸭疫里默氏杆菌中的毒力因子之一，并有可能是作为一种粘附素发挥作用^[39]。

2.3 脂多糖合成相关基因

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分，由核心多糖、O抗原链和类脂A三部分构成。LPS在革兰氏阴性菌的抗吞噬、耐药等方面起非常重要的作用^[40]。

Wang等(2014)研究表明鸭疫里默氏杆菌Yb2株AS87_04050基因缺失后，LPS形成受阻，同时对抗生素、消毒剂、鸭血清的抵抗能力降低。相反，与野生株相比，AS87_04050基因缺失株对Vero细胞的粘附和入侵能力增强。尽管如此，缺失株的毒力仍降低了10⁵倍，由此说明，LPS参与了鸭疫里默氏杆菌的致病^[41]。相似的，Zou等(2015)发现鸭疫里默氏杆菌CH3脂多糖合成相关基因M949_1556缺失株对鸭血清的抵抗力降低，粘附入侵Vero细胞的能力增强，而毒力降低了50倍。将该缺失株制备为弱毒疫苗并免疫动物，结果发现对其他血清型鸭疫里默氏杆菌均具有有效保护作用^[42]。Dou等(2017)在鸭疫里默氏杆菌CH3脂多糖合成相关基因M949_RS01915缺失株中得到了类似的结果^[43]。

2.4 荚膜合成相关基因

细菌的荚膜主要在免疫逃避、免疫调节等方面起重要作用，被认为是宿主致病的重要毒力因子^[44]。Yi等(2017)构建了鸭疫里默氏杆菌CH-1株荚膜合成基因wza的缺失株^[45]。与野生株相比，基因缺失株不再生成荚膜且对外界环境胁迫如氧化应激、干燥的抵抗能力降低，对补体更加敏感^[45]。通过动物试验表明，与野生株相比，缺失株毒力降低了250倍，说明鸭疫里默氏杆菌荚膜参与了致病^[45]。

2.5 调控相关基因

luxE基因编码脂酰蛋白合成酶，参与脂肪酸代谢，在生物发光的脂肪酸还原系统中起重要作用^[46]。Wang等(2016)将鸭疫里默氏杆菌Yb2株luxE基因(AS87_03730)缺失后发现，与野生株相比，其在TSB培养基的生长速度降低，入侵Vero细胞的能力降低，毒力降低80倍，证明其参与了鸭疫里默氏杆菌的致病^[47]。转录组测序表明，Yb2ΔAS87_03730株19个基因上调，2个基因下调。上调基因主要参与细胞膜的合成、氨基酸的转运与代谢等^[47]。

3 鸭疫里默氏杆菌耐药机制

细菌的耐药性是指细菌对抗生素表现出的抵抗特性，有天然耐药性(或固有耐药性)和获得性耐药性之分。天然耐药性是指细菌对某种抗菌药物表现出的先天性不敏感，由细菌自身生物学特性(如结构、代谢机制)所决定。获得性耐药是指细菌对某些抗菌药物由本来的敏感状态自发转变为耐受状态的特性。

在已经感染了鸭疫里默氏杆菌的鸭群当中，药物治疗是最常见的治疗措施。但在临床实践和实验室研究中发现鸭疫里默氏杆菌对多种抗生素表现出耐药，并且其耐药谱呈愈发广泛的趋势。Zhong等(2009)对中国1998–2005年分离的224株鸭疫里默氏杆菌进行了耐药性测定^[48]。结果表明，50%的分离株对氨苄、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林、青霉素和利福平等多种抗生素耐药，其中4株对29种抗生素均表现出耐受^[48]。Gyuris等(2017)对匈牙利2000–2014年分离的185株鸭疫里默氏杆菌分离株进行耐药性测定。结果表明，对氟苯尼考的敏感率为97.9%；对氨苄西林的敏感率为95.1%；对盘尼西林的敏感率为93.0%；对甲氧苄啶的敏感率为92.4%；对壮观霉素的敏感率为86.5%；对氟甲喹、四环素、红霉素和链霉素的耐药率分别为94.0%、91.4%、75.1%和71.4%^[49]。

虽然已经发现鸭疫里默氏杆菌对氯霉素、青霉素、卡那霉素、庆大霉素、林可霉素和氟苯尼考等抗生素耐受^[48]，但是大部分鸭疫里默氏杆菌的耐药基因以及耐药机制仍然是未知的。Chen等(2010)报道了编码了氯霉素乙酰转移酶的基因cat是鸭疫里默氏杆菌对于氯霉素具有抗性的原因之一^[50]。Huang等(2017)对中国192株分离株检测发现，有69株具有cat基因，其中在CH-2株具有2个拷贝且只有当2个拷贝均缺失时鸭疫里默氏杆菌CH-2株才能对氯霉素敏感^[51]。Tsai等(2012)在台湾地区66株鸭疫里默氏杆菌分离株当中对氟苯尼考耐药的9株分离株当中均检测出floR基因。并且通过进一步的研究结果表明floR基因是一个外排泵，对氯霉素以及氟苯尼考均有外排作用^[52]。Luo等(2015)对中国206株鸭疫里默氏杆菌鉴定发现有64株编码核糖体RNA甲基转移酶ermF基因，该基因的缺失会导致鸭疫里默氏杆菌对大环内酯类抗生素比如红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素以及林可酰胺类抗生素变得敏感^[53]。随后，Xing等(2015)对中国80株鸭疫里默氏杆菌鉴定发现有43株对红霉素耐受。43株红霉素耐药的菌株中有30株携带ermF或ermFU基因，MIC值的范围为32–2048μg/mL。另外13株菌株携带有ereD基因，MIC值的范围为4–16 μg/mL。此外，序列分析显示ermF、ermFU和ereD基因均位于鸭疫里氏杆菌基因组的多抗性区域内^[54]。Luo等(2018)对鸭疫里默氏杆菌当中lnu(H)基因进行了研究，发现Lnu(H)蛋白是一种新型的林可酰胺核苷酸转移酶，可以通过核苷酸化使得林可霉素失活，从而使鸭疫里默氏杆菌对林可酰胺产生高水平的抗性^[55]。Sun等(2012)测定了2008–2010年中国南方地区的103株鸭疫里默氏杆菌对23种抗生素的耐药性，发现gyrA基因与鸭疫里默氏杆菌对于喹诺酮的耐药有关^[56]。

Zhang等(2017)在鸭疫里默氏杆菌CH-1株鉴定了一个编码外排泵的基因B739_0873^[57]。与野生株相比，B739_0873缺失株对氨基糖苷类药物和去污剂更为敏感。用低浓度的链霉素、卡那霉素或庆大霉素处理鸭疫里默氏杆菌CH-1发现，B739_0873的表达上调了2–7倍^[57]。Li等(2017)研究表明鸭疫里默氏杆菌CH3株M949_0459基因缺失后对替加环素变得敏感，且用低浓度的替加环素处理鸭疫里默氏杆菌后M949_0459的表达量上调^[58]。随后，在大肠杆菌BL21株表达M949_0459发现大肠杆菌对替加环素的耐药性增加，表明M949_0459参与了鸭疫里默氏杆菌对替加环素的耐药^[58]。Zhu等(2018)对2011–2017年中国分离的212株鸭疫里默氏杆菌对四环素耐药情况进行了检测，结果表明192株(90.6%)对四环素耐药，在这些菌株中170株(80.2%)携带有tet(X)基因。其中一株携带有tet(M)、tet(O)和tet(X)这3个基因。将tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(O)、tet(O/W/32/O)、tet(Q)和tet(X)分别转入鸭疫里默氏杆菌四环素敏感菌株ATCC11845使该菌株对四环素变得耐药，说明这些基因参与了鸭疫里默氏杆菌对四环素的耐药^[59]。

4 问题和展望

鸭疫里默氏杆菌自发现已有100余年，至今仍然严重威胁着养鸭业的健康发展。由于其血清型众多且不断变异，给有效防控该病带来诸多不便。目前对于鸭疫里默氏杆菌的致病机制、耐药机制、遗传变异机制虽有研究但不够深入，且缺乏标准化的血清型分型方法。因此，在未来的研究中首先应建立统一的血清型分型的方法或其他分型方法，掌握其流行规律。其次，要进一步研究其致病机制，如毒力基因的鉴定、毒力因子的作用机制等；进一步研究鸭疫里默氏杆菌耐药的产生机制，是由基因突变造成的耐药还是从外界环境获取了耐药基因？进一步研究近期发现的鸭疫里默氏杆菌自然转化现象在耐药基因获取及血清型转换中的作用^[60]；进一步研究鸭疫里默氏杆菌从宿主获取铁离子或血红素等营养物质的机制，如参与营养物质摄取基因的鉴定、血红素载体从血红素结合蛋白摄取血红素的作用机制及调控机制等。通过上述的研究进一步指导鸭疫里默氏杆菌的有效防控。